Summary

Kultur av isolerat Floor Plate Tissue och produktion av konditionerat medium för att bedöma funktionella egenskaper hos golvplatta utgivna Signaler

Published: February 11, 2014
doi:

Summary

Golvplattan är en viktig struktur för utvecklings ryggmärgen, ger diffunderbara signaler till stamceller och differentierande neuroner. Vi beskriver en metod för att tillverka golvplatta medium, för att tillämpa den på färsk ryggmärgsvävnad, och att bedöma konsekvenserna på proteiner av intresse med biokemi.

Abstract

Under utveckling, progenitorceller och post-mitotiska neuroner emot signaler från angränsande områden som reglerar deras öde. Golvet-plattan är en grupp av gliaceller kantar ependymceller kanalen vid ventrala positionen. Golvet-plattan uttrycker nyckel morfogener bidrar till mönstring av cell linjer i ryggmärgen. Vid senare utvecklingsstadier, reglerar golvplattan navigering av axoner i ryggmärgen, som agerar som en barriär för att förhindra passage av ipsilaterala axoner och kontrollerande mittlinjen korsning av commissural axoner 1. Dessa funktioner uppnås genom att utsöndringen av olika vägledning ledtrådar. Några av dessa signaler fungerar som tilldragande och avskräckningsmedel för de växande axoner medan andra reglerar väglednings receptorer och nedströms signalering att modulera känsligheten hos axoner till de lokala vägledning ledtrådar 2,3. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att undersöka egenskaperna för golv-plattan härledda signaler i olika utvecklopmental sammanhang, baserat på produktionen av Golvplatta medium (FP cm) 4-6. Vi exemplifierar då användningen av denna FP cm i samband med axon vägledning. För det första är ryggmärg isolerad från musembryo vid E12.5 och eldstadsplanet dissekeras ut och odlas i ett plasma-trombmatrisen (figur 1). Andra två dagar senare, är commissural vävnad dissekeras ut från E12.5 embryon, finfördelas och exponeras för FP cm. För det tredje, är den vävnad bearbetas för Western blot-analys av commissural markörer.

Introduction

Golvet-plåt är ett välkänt mönstring centrum för utvecklings ryggmärgen, spelar nyckelroller i specifikationen av progenitorceller och postmitotiska cellhärstamningar och kontrollerande axonet navigering 7,8. Den experimentella procedur som beskrivs här för att producera FP cm låter utredare för att bedöma de funktionella egenskaperna hos golvplatt-härledda signaler i en olika sammanhang av utvecklingsprocesser, från cell mönstring och överlevnad för cell-och Axon migration.

För att illustrera användningen av en sådan FP cm, dorsala ryggmärgen vävnader innehållande commissural neuroner dissekeras, dilacerated och stimulerades med FP cm. Vävnaderna kan sedan bearbetas för Western blot-analys. Detta gör det möjligt att undersöka föreskrifter axonet vägledning maskiner från golv-plattan släpptes signaler. Den metod för behandling av dilacerated färsk vävnad håller den stora fördelen av att bevara den mikromiljö av celler i: tee vävnad. Sålunda konsekvenserna av behandling av FP cm eller några typer av behandling utvärderas på ett mer fysiologiskt sätt än i cell-och vävnadsodlingsbetingelser.

Protocol

DAG 1 1. Dissektion av ryggmärgen golvplattan (FP) från E12.5 musembryon Anmärkning: Hela förfarandet kräver användning av sterila betingelser. Det är att föredra att utföra dissektionen under ett dissektion huva för att undvika kontaminering. Bör rengöras Ytan av huven med etanol. Alla dissektionsinstrument måste steriliseras och förvaras i en steril petriskål. Vätskorna (medium dissektion medel) måste hållas stängda och sätta i e…

Representative Results

Commissural vävnader behandlades med hjälp av FP cm och proven bearbetades för analys av receptornivåer i Western blöt. Tillämpning av FP cm visade sig öka nivåerna av en vägledning receptor, PlexinA1, som förmedlar känslighet commissural axoner med mittlinjen avvisande Semaphorin3B efter att ha korsat (Figur 2). Detta visade att signaler släpptes av FP reglerar PlexinA1 nivå 4,6. <img alt="Fi…

Discussion

Produktionen av golvplatta medium ger ett effektivt och enkelt sätt för att utvärdera de biologiska egenskaperna hos golvplatta släpptes signaler.

Den plasma-trombin matris ger utmärkt skick för vävnadsöverlevnad. Ändå kan detta berikad miljö vara en begränsning för vissa typer av experiment. Således kan golvplattan vävnad också odlas i agaros-matris. Kvaliteten på golvplattan medium kan bedömas genom detektering av kända golv-plattan släpptes signaler, såsom GDNF <stron…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, och Florie Reynaud för deras hjälp. Arbetet stöds av CNRS, ANR YODA program och Labex DevWeCan.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  2. Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
  3. Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
  4. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  5. Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
  6. Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
  7. Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
  8. Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  10. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
  11. Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
  12. Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).

Play Video

Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

View Video