Kultur av isolerat Floor Plate Tissue och produktion av konditionerat medium för att bedöma funktionella egenskaper hos golvplatta utgivna Signaler

Summary

Golvplattan är en viktig struktur för utvecklings ryggmärgen, ger diffunderbara signaler till stamceller och differentierande neuroner. Vi beskriver en metod för att tillverka golvplatta medium, för att tillämpa den på färsk ryggmärgsvävnad, och att bedöma konsekvenserna på proteiner av intresse med biokemi.

Abstract

Under utveckling, progenitorceller och post-mitotiska neuroner emot signaler från angränsande områden som reglerar deras öde. Golvet-plattan är en grupp av gliaceller kantar ependymceller kanalen vid ventrala positionen. Golvet-plattan uttrycker nyckel morfogener bidrar till mönstring av cell linjer i ryggmärgen. Vid senare utvecklingsstadier, reglerar golvplattan navigering av axoner i ryggmärgen, som agerar som en barriär för att förhindra passage av ipsilaterala axoner och kontrollerande mittlinjen korsning av commissural axoner ^1. Dessa funktioner uppnås genom att utsöndringen av olika vägledning ledtrådar. Några av dessa signaler fungerar som tilldragande och avskräckningsmedel för de växande axoner medan andra reglerar väglednings receptorer och nedströms signalering att modulera känsligheten hos axoner till de lokala vägledning ledtrådar ^2,3. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att undersöka egenskaperna för golv-plattan härledda signaler i olika utvecklopmental sammanhang, baserat på produktionen av Golvplatta medium (FP ^{cm) 4-6.} Vi exemplifierar då användningen av denna FP ^cm i samband med axon vägledning. För det första är ryggmärg isolerad från musembryo vid E12.5 och eldstadsplanet dissekeras ut och odlas i ett plasma-trombmatrisen (figur 1). Andra två dagar senare, är commissural vävnad dissekeras ut från E12.5 embryon, finfördelas och exponeras för FP ^cm. För det tredje, är den vävnad bearbetas för Western blot-analys av commissural markörer.

Introduction

Golvet-plåt är ett välkänt mönstring centrum för utvecklings ryggmärgen, spelar nyckelroller i specifikationen av progenitorceller och postmitotiska cellhärstamningar och kontrollerande axonet navigering ^7,8. Den experimentella procedur som beskrivs här för att producera FP ^cm låter utredare för att bedöma de funktionella egenskaperna hos golvplatt-härledda signaler i en olika sammanhang av utvecklingsprocesser, från cell mönstring och överlevnad för cell-och Axon migration.

För att illustrera användningen av en sådan FP ^cm, dorsala ryggmärgen vävnader innehållande commissural neuroner dissekeras, dilacerated och stimulerades med FP ^cm. Vävnaderna kan sedan bearbetas för Western blot-analys. Detta gör det möjligt att undersöka föreskrifter axonet vägledning maskiner från golv-plattan släpptes signaler. Den metod för behandling av dilacerated färsk vävnad håller den stora fördelen av att bevara den mikromiljö av celler i: tee vävnad. Sålunda konsekvenserna av behandling av FP ^cm eller några typer av behandling utvärderas på ett mer fysiologiskt sätt än i cell-och vävnadsodlingsbetingelser.

Protocol

DAG 1 1. Dissektion av ryggmärgen golvplattan (FP) från E12.5 musembryon Anmärkning: Hela förfarandet kräver användning av sterila betingelser. Det är att föredra att utföra dissektionen under ett dissektion huva för att undvika kontaminering. Bör rengöras Ytan av huven med etanol. Alla dissektionsinstrument måste steriliseras och förvaras i en steril petriskål. Vätskorna (medium dissektion medel) måste hållas stängda och sätta i e…

Representative Results

Commissural vävnader behandlades med hjälp av FP cm och proven bearbetades för analys av receptornivåer i Western blöt. Tillämpning av FP cm visade sig öka nivåerna av en vägledning receptor, PlexinA1, som förmedlar känslighet commissural axoner med mittlinjen avvisande Semaphorin3B efter att ha korsat (Figur 2). Detta visade att signaler släpptes av FP reglerar PlexinA1 nivå 4,6. <img alt="Fi…

Discussion

Produktionen av golvplatta medium ger ett effektivt och enkelt sätt för att utvärdera de biologiska egenskaperna hos golvplatta släpptes signaler.

Den plasma-trombin matris ger utmärkt skick för vävnadsöverlevnad. Ändå kan detta berikad miljö vara en begränsning för vissa typer av experiment. Således kan golvplattan vävnad också odlas i agaros-matris. Kvaliteten på golvplattan medium kan bedömas genom detektering av kända golv-plattan släpptes signaler, såsom GDNF <stron…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O