Vi præsenterer en protokol for in vitro-undersøgelse af effluxpumper fra Pseudomonas aeruginosa. Denne protokol giver mulighed for generering af en robust, reversible og afstemmelige protongradient i liposommembranen og derfor bør kunne tilpasses enhver membranprotein energi ved protomotive kraft.
Der er en spirende videnskabelig behov for pålidelige værktøjer til overvågning membranproteinet transport. Vi præsenterer en metode fører til rekonstituering af effluxpumper fra Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa i en biomimetiske miljø, der giver mulighed for en omhyggelig undersøgelse af deres aktivitet på transportområdet. Tre forudsætninger er opfyldt: adskillelser i en lipidisk miljø, brug af en relevant indeks for transport, og generering af en proton gradient. Membranproteinet transportør rekonstitueres i liposomer sammen med bakterierhodopsin, en lys-aktiverede protonpumpe, der genererer en proton gradient, der er robust, samt reversible og tunable. Aktiviteten af proteinet udledt fra pH-variationer, der forekommer i liposomet ved hjælp af pyranin, en pH-afhængig fluorescerende probe. Vi beskriver en trin-for-trin procedure, hvor membran proteinoprensning, liposomdannelse, protein rekonstitution og transport enNALYSE behandles. Selv om de blev specifikt designet til et RND transportøren kan de beskrevne fremgangsmåder potentielt tilpasses til anvendelse med andre membranprotein transportør aktiveres af en proton-gradient.
Integrerede membranproteiner udgør op til 30% af generne kodet i eukaryote genomer. De deler afgørende roller såsom gate holde (receptorer), transport næringsstoffer, ioner, eller skadelige forbindelser (transportører) eller vedligeholdelse af permeabiliteten tværs membrandobbeltlag (kanaler) blandt alle levende celler 1.. Effluxpumper har en central rolle i resistens over for antibiotisk behandling 2. I Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa, som er beskyttet af en ydre membran, der effluxtransportører organiseret som treparts systemer, hvor MexB, efflukspumpen ligger i den indre membran, arbejder sammen med Mexa, en periplasmisk protein og OprM, en ydre membran-kanal. Den cytoplasmatiske indre membran-protein fungerer som en energiafhængig pumpe med bred substrat-specificitet. Den ydre membran-protein fungerer som en porin hvorimod den tredje ene er placeret i det periplasmatiske rum og menes at stabilisere hele komplekset <sop.> 3 I det følgende har vi fokus på udformningen af en funktionel analyse til Mexa MexB forsamling.
Strukturel information har akkumuleret over de sidste 5 år takket være X-ray bestemmelse af homologe protein AcrB fra Escherichia coli 4-7. Selv om det er helt klart vigtigt at koble disse oplysninger med dynamiske og kinetiske data, designe et funktionelt assay for denne transporter er en reel udfordring 8.. Faktisk skal membranproteiner skal holdes i membranøs miljøet og et lukket rum skal opretholdes for en vektoriel transport af substrat, der skal nås.
Rekonstituering af membranproteiner i proteoliposomer er blevet grundigt fremlagt og gennemgået (se Rigaud og Levy 9). Sådanne protokoller gør det muligt for overvågning af membrantransportproteiner aktivitet, for eksempel ved at følge substraterne over liposommembranen. I dette tilfælde opstår begrænsninger fra enreferencelægemidlet af titrerbare substrater (fluorescerende, radioaktive, osv.) og fra det faktum, at meget ofte disse substrater er hydrofobe og har en tendens til at krydse membraner, uanset tilstedeværelsen af transportvirksomheden. Som et alternativ kan man følge de spektroskopiske variationer af en rapporterende farvestof følsom over for kemiske ændringer, der opstår som følge af transport. Som anført ovenfor, protoner energi transport via MexB. Derfor en relevant mulighed er at overvåge spektroskopiske variationer af en pH-følsom rapportering farvestof til at følge pH-variationer på grund af proton-drevne substrat transport. Valget af et fluorescerende farvestof undgår nogen kunstig virkninger på grund af den hydrofobe natur af substratet.
En yderligere vanskelighed er frembringelsen af en proton-gradient. Adskillige protokoller findes i litteraturen. Blandt dem, anvendelse af valinomycin teknik er udbredt, men vi har vist, at det er besværligt at udføre 10-11. Desuden er detikke reproducerbar og det er ikke reversibel. Vi har tyet til anvendelsen af bakterierhodopsin (BR), en lysaktiveret protonpumpe fra Halobacter Salinarium en halofile marine Gram-negativ obligat aerob archaeon. Dette protein coreconstituted i liposomer med MexB og efter belysning, BR pumper protoner inde i liposomer og dermed skaber ΔpH (sur indvendig) brug for protein til at transportere underlaget 12-13.
Vi beskriver rekonstituering procedure designet til analyse membranprotein transport. Når de er etableret, protein rekonstitueringsprocedure fører til målinger, der er meget reproducerbare. De nøjagtige betingelser for rekonstitution af protein, vil imidlertid variere fra ét protein til et andet. Meget pleje skal tages i at optimere følgende parametre: i) kvaliteten af rensning (renhed og fravær af aggregeret materiale), ii) effektiviteten af vaskemiddel opløsende trin (når det er muligt, bør lav cmc rengøringsmiddel blive foretrukket, fordi de er lettere at få slippe af) iii) desorption af detergent (det er for eksempel muligt at kombinere anvendelsen af polystyrenperler med en dialyse skridt, men dette kan påvirke hastigheden af desorption, en kritisk parameter for den efterfølgende aktivitet af proteinet, se ref [ 9]), iv) lipid rekonstitution (den kemiske natur af lipid, lipid-protein-forhold, tilstedeværelsen af yderligere amphiphiles er kritiske parametre, der skal varieres og optimeret). Ud over temperatur og inkubationstid påvirke alle disse spørgsmål.
Kvalitetskontrol er derfor primordial på hvert trin i rekonstitutionsproceduren. Fra dette synspunkt, lysspredning er en meget bekvem teknik, fordi det er en hurtig, ikke-destruktiv, og det kræver kun 20 ul prøve ved en koncentration i det mikromolære område. Når proteoliposomer er dannet, sucrosegradient er også en stor hjælp, fordi den åbner vejen for en systematisk kontrol af rekonstituering: kvalitative (er proteinet faktisk indlejret i liposommembranen) samt kvantitativ (hvor mange protein i et liposom). Sidstnævnte ville blive behandlet ved nøjagtigt at måle protein og lipid koncentrationer.
Vores analyse er ikke afhængig af titrering af underlaget selv og dette undgår urolige overvejelser vedrørende eventuel kunstig passiv diffusion af molekyle på grund af hydrofobe opdeling i membraner. Assayet udnytter egenskaberne af pyranin som en pålidelig og kvantitativ probe til overvågning af pH-ændringer. Vores resultater er i overensstemmelse med resultater opnået med en anden procedure, hvor protongradient dannelse blev udført ved hjælp valinomycin 10, men det giver mulighed for en mere robust og reproducerbar gradient 11. Desuden kan protongradienten præcist indstilles blot ved at variere koncentrationen af pufferen (for yderligere detaljer se Verchere et al. 12).
I proceduren kontrolmåling udføres først i fravær af substrat (dette giver adgang til den passive aktiviteten af proteinet). Den faktiske membranprotein transportør aktivitet måles derefter efter substratet er blevet tilsat i samme kuvette. Dette er virkelig et aktiv, fordi forsøget kan betragtes som en ægte, ikke tvetydig, substrat-induceret resultat.
ent "> Protokollen kunne tilpasses til høj-medium gennemløb (for eksempel 96-brønde målinger) automatisering fordi lysende prøven udløser reaktionen. Automation og parallelisering ville bestå i at forberede et stort parti af proteoliposom, og dispensering portioner i en 96 -brøndplade. Substrater (og også eventuelle inhibitorer) vil derefter blive tilsat, og efter inkubation i mørke i 45 min pladen ville blive udsat for belysning / pyranin fluorescens måleserier på en mikropladelæser.For yderligere oplysninger om protokollen, er læserne opfordres til at læse Verchere et al. 12,13
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Agence Nationale de la Recherche (projekt ANR-2010-BLAN-1535), og af en bevilling fra Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 |
Valinomycin | Invitrogen | V-1644 |
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 |
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA |
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 |
Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 |
Desalting columns | Bio-Rad | 54805 |
Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar |
Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |