Summary
Vi præsenterer en protokol for in vitro-undersøgelse af effluxpumper fra Pseudomonas aeruginosa. Denne protokol giver mulighed for generering af en robust, reversible og afstemmelige protongradient i liposommembranen og derfor bør kunne tilpasses enhver membranprotein energi ved protomotive kraft.
Abstract
Der er en spirende videnskabelig behov for pålidelige værktøjer til overvågning membranproteinet transport. Vi præsenterer en metode fører til rekonstituering af effluxpumper fra Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa i en biomimetiske miljø, der giver mulighed for en omhyggelig undersøgelse af deres aktivitet på transportområdet. Tre forudsætninger er opfyldt: adskillelser i en lipidisk miljø, brug af en relevant indeks for transport, og generering af en proton gradient. Membranproteinet transportør rekonstitueres i liposomer sammen med bakterierhodopsin, en lys-aktiverede protonpumpe, der genererer en proton gradient, der er robust, samt reversible og tunable. Aktiviteten af proteinet udledt fra pH-variationer, der forekommer i liposomet ved hjælp af pyranin, en pH-afhængig fluorescerende probe. Vi beskriver en trin-for-trin procedure, hvor membran proteinoprensning, liposomdannelse, protein rekonstitution og transport enNALYSE behandles. Selv om de blev specifikt designet til et RND transportøren kan de beskrevne fremgangsmåder potentielt tilpasses til anvendelse med andre membranprotein transportør aktiveres af en proton-gradient.
Introduction
Integrerede membranproteiner udgør op til 30% af generne kodet i eukaryote genomer. De deler afgørende roller såsom gate holde (receptorer), transport næringsstoffer, ioner, eller skadelige forbindelser (transportører) eller vedligeholdelse af permeabiliteten tværs membrandobbeltlag (kanaler) blandt alle levende celler 1.. Effluxpumper har en central rolle i resistens over for antibiotisk behandling 2. I Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa, som er beskyttet af en ydre membran, der effluxtransportører organiseret som treparts systemer, hvor MexB, efflukspumpen ligger i den indre membran, arbejder sammen med Mexa, en periplasmisk protein og OprM, en ydre membran-kanal. Den cytoplasmatiske indre membran-protein fungerer som en energiafhængig pumpe med bred substrat-specificitet. Den ydre membran-protein fungerer som en porin hvorimod den tredje ene er placeret i det periplasmatiske rum og menes at stabilisere hele komplekset Strukturel information har akkumuleret over de sidste 5 år takket være X-ray bestemmelse af homologe protein AcrB fra Escherichia coli 4-7. Selv om det er helt klart vigtigt at koble disse oplysninger med dynamiske og kinetiske data, designe et funktionelt assay for denne transporter er en reel udfordring 8.. Faktisk skal membranproteiner skal holdes i membranøs miljøet og et lukket rum skal opretholdes for en vektoriel transport af substrat, der skal nås. Rekonstituering af membranproteiner i proteoliposomer er blevet grundigt fremlagt og gennemgået (se Rigaud og Levy 9). Sådanne protokoller gør det muligt for overvågning af membrantransportproteiner aktivitet, for eksempel ved at følge substraterne over liposommembranen. I dette tilfælde opstår begrænsninger fra enreferencelægemidlet af titrerbare substrater (fluorescerende, radioaktive, osv.) og fra det faktum, at meget ofte disse substrater er hydrofobe og har en tendens til at krydse membraner, uanset tilstedeværelsen af transportvirksomheden. Som et alternativ kan man følge de spektroskopiske variationer af en rapporterende farvestof følsom over for kemiske ændringer, der opstår som følge af transport. Som anført ovenfor, protoner energi transport via MexB. Derfor en relevant mulighed er at overvåge spektroskopiske variationer af en pH-følsom rapportering farvestof til at følge pH-variationer på grund af proton-drevne substrat transport. Valget af et fluorescerende farvestof undgår nogen kunstig virkninger på grund af den hydrofobe natur af substratet. En yderligere vanskelighed er frembringelsen af en proton-gradient. Adskillige protokoller findes i litteraturen. Blandt dem, anvendelse af valinomycin teknik er udbredt, men vi har vist, at det er besværligt at udføre 10-11. Desuden er detikke reproducerbar og det er ikke reversibel. Vi har tyet til anvendelsen af bakterierhodopsin (BR), en lysaktiveret protonpumpe fra Halobacter Salinarium en halofile marine Gram-negativ obligat aerob archaeon. Dette protein coreconstituted i liposomer med MexB og efter belysning, BR pumper protoner inde i liposomer og dermed skaber ΔpH (sur indvendig) brug for protein til at transportere underlaget 12-13.
Protocol
1.. Protein Produktion og oprensning
- Mexa, MexB fra Pseudomonas aeruginosa
- Omdan plasmiderne huser Mexa og MexB gener i en E. coli produktionsstamme (fx C43 DE3). Plade på LB agar medium suppleret med passende antibiotika. Pick en enkelt koloni til at pode en O / N forkultur. Den næste morgen, pode forkultur i 1 L LB og vokse ved 37 ° C under omrøring (240 rpm).
- Når cellerne har nået den eksponentielle fase (OD600 = 0,6-0,8) fremkalde med 1 mM IPTG. Udføre induktion til 2-3 timer ved 30 ° C under omrøring.
- Centrifuger cellerne (9.000 xg i 20 minutter) og resuspenderes i 30 ml Tris-HCI 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM.
- Forstyrre celler ved hjælp af en fransk presse (10.000 psi, 4 pass). Kassér ubrudte celler og inklusionslegemer ved centrifugering ved 9.000 xg i 20 min.
- Pellet membraner 1 time ved 100.000 x g og resuspend hver pellet i 30 ml bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCI 500 mM.
- Bestemme den samlede membranproteinkoncentration anvendelse af BCA kolorimetrisk assay og opløseliggøre membranerne O / N med 2% dodecylmaltosid (DDM) i et slutvolumen fastsat således, at vaskemiddel: protein er 1:1,5 (vægt / vægt).
- Ultracentrifuge ved 100.000 xg i 1 time for at kassere ikke opløselig og aggregeret materiale.
- Inkubér supernatant i 2 timer ved 4 ° C med en nikkel-harpiks (Mexa oprensning) eller en cobalt-harpiks (MexB oprensning) ækvilibreret med Bis-Tris 10 mM, pH 7,4, glycerol 5% (w / v), imidazol 10 mM NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
- Hæld harpiksen i en tom kolonne. Saml gennemstrømningen.
- Vask harpiksen med 50 ml bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCI 500 mM, DDM 0,2% og derefter med 25 ml bis-Tris 10 mM pH 6, glycerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCI 500 mM, DDM 0,2%.
- Eluere protein med 20 ml bis-Tris 10 mM, pH 7,4, glycerol 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCI 500 mM, DDM 0,2%.
- Koncentrer protein med en ultrafiltreringsindretning ned til 3 ml og belastning på en afsaltningskolonne ækvilibreret med en imidazol-puffer. Lige før rekonstitution (se nedenfor), ultracentrifuge de opløste proteiner (100.000 xg i 20 min) for at slippe af lipider og unsolubilized proteiner. Derefter koncentrere proteinet igen til 0,3 ml.
- Bakterierhodopsin fra Halobacter Salinarium
- Grow Halobacter Salinarium celler under belysning ved 37 ° C i 10 dage i et flydende vækstmedium indeholdende NaCI 4 M, MgSO4 150 mM, citrat 10 mM, KCI 30 mM, gærekstrakt 5 g / l, og pepton 5 g / L.
- Forstyrre celler ved dialyse mod deioniseret vand.
- Renses lilla membran på en 30-40% (w / v) saccharosegradient (100.000 x g i 17 timer).
- Solubilisere membransuspensionen med 2% octylglucoside i 24 timer ved 37 ° C (volumen for solubilisering for at resuspendere membranen ved en 2:1 (w / w) detergent: protein-forhold). Estimere koncentrationen af opløste BR hjælp ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Lige før rekonstitution (se nedenfor), ultracentrifuge den opløste BR (100.000 xg i 20 min) for at slippe af lipider og unsolubilized proteiner.
Bemærk: De indfødte membraner er naturligt beriget med BR så ingen yderligere rensning er nødvendig.
2. Fremstilling af proteoliposomer
- Liposomdannelse: Sæt 400 pi DOPC opløst i chloroform (25 mg / ml) i et bægerglas, og der tilsættes 1,5 mg kolesterol opbevaret som et pulver. Tør dem lige før manipulation under en strøm af nitrogen eller vakuum i mindst 1 time i et bægerglas. Den DOPC: kolesterol molforhold 3,3:1.
- Efter at de er tørrede, hydrere lipiderne med 1 ml HEPES 25 mM pH 7K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, pyranin 2 mM. Suspensionen skal vises uklar på dette stadium.
- Opløsningen opvarmes i 10 minutter ved 37 ° C. Ultralydsbad i 10 minutter ved 40 W med 30 sek puls, 30 sec pause cyklusser ved RT. Suspensionen skal være klar på dette tidspunkt.
- For at opnå en monodisperse population af liposomer udføre to cyklusser af ekstrudering og for hver cyklus, passerer liposomsuspensionen gennem filteret mindst 11x. For første cyklus, skal du bruge en membran porestørrelse på 200 nm, og for den anden cyklus, skal du bruge en membran porestørrelse på 100 nm. Dynamisk lysspredning målinger kan udføres på dette trin for at kontrollere homogeniteten af suspensionen.
- Protein inkorporering
Princip: membrantransportproteiner kan rekonstitueres i liposomer takket være den opløseliggørende virkning af detergenter. Vaskemiddel-solubiliseret liposomer inkuberes med detergent-solubiliserede membranprotein og dannelse af proteoliposomes udløses ved hurtig eliminering af vaskemiddel med polystyrenkugler 9.- Tilføj 28 mg Triton X-100 (0,56% endelig) og inkuberes O / N ved 4 ° C (solubiliseringen temperatur kan tilpasses til proteinet blev undersøgt).
- Tilsæt detergent-solubiliserede protein (BR, MexB og Mexa) til de solubiliserede liposomer og inkuberes 15 minutter ved 4 ° C. Føj proteinerne til den opløste liposomsuspension ved følgende forhold (vægt / vægt): lipider / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5, og lipider / BR = 30.
- Tilføj polystyrenperler på et 30:1 perler: detergent forhold (vægt / vægt, i betragtning af den samlede vægt af detergent, herunder tilsat de oprensede proteiner detergent), og der inkuberes i 5 timer i mørke (på grund af BR) ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. Forud for denne procedure, aktivere BIOBEADS med methanol og ethanol inkubation og grundigt vaskes af med vand.
- Renses proteoliposomer protein og frie substrater ved hjælp af en PD-10afsaltningskolonne ækvilibreret med HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 100 mM og MgCl2 2 mM.
- Opbevar proteoliposomer ved 18 ° C i mørke i op til 2-3 uger.
- Vurdering af rekonstituering effekt på saccharosegradient.
For at kontrollere, at både MexB og BR er blevet rekonstitueret i liposomer, rense proteoliposom suspension på en diskontinuerlig saccharosegradient.- Forsigtigt afvikle proteoliposomer på en femlags gradient af saccharose (60%, 20%, 10%, 5% og 2,5% w / v).
- Ultracentrifugér i 17 timer ved 100.000 xg (med minimal acceleration og deceleration satser).
- Indsamle forsigtigt de forskellige gradientfraktioner (især grænsefladerne mellem hvert lag af saccharose) og analysere dem på SDS-PAGE (10%) ved hjælp Coomassiefarvning eller Western blotting. Aggregerede proteiner findes i bunden af røret, mens nonincorporated, detergent-solubiliserede proteiner findes på toppen afrøret. Proteoliposomer og liposomer findes på saccharose grænseflader, der svarer til deres iboende vægtfylde. Tomme liposomer inddrives længere op i gradienten end proteoliposomer.
3. Fluorescens Måling
- Udfør fluorescens målinger ved 25,0 ° C ved hjælp af et spektrofluorometer giver mulighed for dobbelt-bølgelængde målinger (Xe lampe, 150 W). Suppleant belysning perioder (for at aktivere BR med excitation / emission bølgelængder på 550 nm / 550 nm) og fluorescens målinger med excitation / emission bølgelængder på 455 nm / 509 nm for 2 sek at måle pyranin fluorescens. Indstil excitation og emission båndbredder til 5 nm. Udfør målingerne i overværelse af 50 nm valinomycin at forhindre dannelsen af en omvendt membranpotentialet ΔΨ.
Bemærk: Faktisk fordi BR pumper protoner, der er mere positive ladninger inde i liposomet end udenfor. Denne afgiftgradient kan kasseres under anvendelse af valinomycin, som er en K + selektiv ionofor. Når sat til liposomer suspension valinomycin som et hydrofobt molekyle, vil indsætte i liposommembranen passivt transportere K +, og dermed sprede membranpotentialet ΔΨ.
Representative Results
Assayet består af overvågning pyranin fluorescens som en funktion af tid, mens en proton-gradient genereres. Til dette formål, er prøverne udsat alternativt til belysning (dermed proton pumpning af BR udløses), og derefter fluorescensmåling hjælp af excitation og emission bølgelængder pyranin (λ ex = 455 nm og λ em = 509 nm).
Figur 1 viser et repræsentativt kontrol opnået med assayet i fravær af Mexa / MexB kontrol af, at protongradienten genereret af BR er reversibel. Efter en cyklus af forsuring er proteoliposomer holdt i mørke i 45 minutter, for at BR at standse pumpe protoner (protoner diffunderer langsomt og passivt over lipiddobbeltlag efter deres koncentrationsgradient). Efter dette restitutionstid, aktivering af BR er muligt blot ved at belyse samme suspension igen.
Figur 2svarer til en faktisk måling transport. En negativ kontrol med protein frie liposomer viser, som forventet, er pH-værdien konstant ved belysning (figur 2A og 2B, orange cirkler). Men proteoliposomer indeholdende BR i deres membraner behøver pumpe proton, således pH inde i liposom formindskes, og en stabil gradient bygget (figur 2A og 2B, lilla firkanter). Grå trekanter og røde diamanter (figur 2a) repræsenterer pH inde i proteoliposomer indeholder BR og MexB, i nærvær eller i fravær af Hoechst 33342, hhv. Vi observerer et substrat-uafhængig aktivitet, hvor protongradienten kun delvist afbødet ved MexB counter-transport. Vi tilskriver denne observation til en basal aktivitet MexB.
For at teste virkningen af Mexa på aktiviteten af MexB blev Mexa tilsat til rekonstituering, først i mangel af substrat (
. Figur 1. reversibilitet protongradienten bygget af BR belysning: pyranin fluorescence af BR proteoliposomer målt som en funktion af tiden. Fra 0-15 minutter, BR pumper protoner som følge af lys aktivering. Fra 15-60 min, er proteoliposomer inkuberet i mørke, i løbet af denne tid, protoner passivt flytte ud af liposomer, indtil intravesikulær pH og extravesicular pH er lige. Fra 60-75 min, BR er stadig funktionel og pumper protoner ved belysning.
. Figur 2. Transport-assay: pyranin fluorescens, omdannes til de tilsvarende pH-variationer, som en funktion af tiden A) pH inde i kontrol-liposomer (orange cirkler), pH-værdi inde i proteoliposomer indeholdende BR i membranen (lilla firkanter), pH indeni. af proteoliposomer indeholdende BR og MexB i membranen uden Hoechst 33342 (rød diamonds), pH inde i proteoliposomer indeholder BR og MexB i membranen med Hoechst 33342 (grå trekanter) b) pH-inde i kontrol-liposomer (orange cirkler). pH inde i proteoliposomer indeholder BR i membranen (lilla firkanter), pH inde af proteoliposomer indeholder BR, MexB og Mexa i membranen uden Hoechst 33342 (blå diamanter), pH inde i proteoliposomer indeholder BR, MexB og Mexa i membranen med Hoechst 33342 (grønne trekanter).
Discussion
Vi beskriver rekonstituering procedure designet til analyse membranprotein transport. Når de er etableret, protein rekonstitueringsprocedure fører til målinger, der er meget reproducerbare. De nøjagtige betingelser for rekonstitution af protein, vil imidlertid variere fra ét protein til et andet. Meget pleje skal tages i at optimere følgende parametre: i) kvaliteten af rensning (renhed og fravær af aggregeret materiale), ii) effektiviteten af vaskemiddel opløsende trin (når det er muligt, bør lav cmc rengøringsmiddel blive foretrukket, fordi de er lettere at få slippe af) iii) desorption af detergent (det er for eksempel muligt at kombinere anvendelsen af polystyrenperler med en dialyse skridt, men dette kan påvirke hastigheden af desorption, en kritisk parameter for den efterfølgende aktivitet af proteinet, se ref [ 9]), iv) lipid rekonstitution (den kemiske natur af lipid, lipid-protein-forhold, tilstedeværelsen af yderligere amphiphiles er kritiske parametre, der skal varieres og optimeret). Ud over temperatur og inkubationstid påvirke alle disse spørgsmål.
Kvalitetskontrol er derfor primordial på hvert trin i rekonstitutionsproceduren. Fra dette synspunkt, lysspredning er en meget bekvem teknik, fordi det er en hurtig, ikke-destruktiv, og det kræver kun 20 ul prøve ved en koncentration i det mikromolære område. Når proteoliposomer er dannet, sucrosegradient er også en stor hjælp, fordi den åbner vejen for en systematisk kontrol af rekonstituering: kvalitative (er proteinet faktisk indlejret i liposommembranen) samt kvantitativ (hvor mange protein i et liposom). Sidstnævnte ville blive behandlet ved nøjagtigt at måle protein og lipid koncentrationer.
Vores analyse er ikke afhængig af titrering af underlaget selv og dette undgår urolige overvejelser vedrørende eventuel kunstig passiv diffusion af molekyle på grund af hydrofobe opdeling i membraner. Assayet udnytter egenskaberne af pyranin som en pålidelig og kvantitativ probe til overvågning af pH-ændringer. Vores resultater er i overensstemmelse med resultater opnået med en anden procedure, hvor protongradient dannelse blev udført ved hjælp valinomycin 10, men det giver mulighed for en mere robust og reproducerbar gradient 11. Desuden kan protongradienten præcist indstilles blot ved at variere koncentrationen af pufferen (for yderligere detaljer se Verchere et al. 12).
I proceduren kontrolmåling udføres først i fravær af substrat (dette giver adgang til den passive aktiviteten af proteinet). Den faktiske membranprotein transportør aktivitet måles derefter efter substratet er blevet tilsat i samme kuvette. Dette er virkelig et aktiv, fordi forsøget kan betragtes som en ægte, ikke tvetydig, substrat-induceret resultat.
ent "> Protokollen kunne tilpasses til høj-medium gennemløb (for eksempel 96-brønde målinger) automatisering fordi lysende prøven udløser reaktionen. Automation og parallelisering ville bestå i at forberede et stort parti af proteoliposom, og dispensering portioner i en 96 -brøndplade. Substrater (og også eventuelle inhibitorer) vil derefter blive tilsat, og efter inkubation i mørke i 45 min pladen ville blive udsat for belysning / pyranin fluorescens måleserier på en mikropladelæser.For yderligere oplysninger om protokollen, er læserne opfordres til at læse Verchere et al. 12,13
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Agence Nationale de la Recherche (projekt ANR-2010-BLAN-1535), og af en bevilling fra Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 | |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 | |
| Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 | |
| DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA | |
| Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 | |
| Desalting columns | Bio-Rad | 54805 | |
| Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar | |
| Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
References
- Granseth, E., et al. Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review). Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).
- Nikaido, H.
- Pos, K. M. Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).
- Murakami, S., et al. Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism. Nature. 443 (7108), 173 (2006).
- Seeger, M. A. Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism. Science. 313 (5791), 1295 (2006).
- Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).
- Su, C. C., et al. Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli. Nature. 470 (7335), (2011).
- Nikaido, H., Takatsuka, Y. Mechanisms of RND multidrug efflux pumps. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in enzymology. 372, 65 (2003).
- Aires, J. R., Nikaido, H. Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli. J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).
- Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys. Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).
- Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press. , (2012).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Sci Rep. 2, 306 (2012).
