Summary
Нейробласта миграция является одним из основных событий в послеродовой нейрогенеза. Мы опишем протокол для эффективной маркировки нейробластах по в естественных условиях послеродового электропорации и последующей визуализации их миграции с использованием покадровой визуализации острых срезах мозга. Мы включать описание для количественного анализа динамики нейробластов Отслеживая видео.
Abstract
Субвентрикулярной зоне (СВЗ) является одним из основных нейрогенных ниш в послеродовой мозга. Здесь, нейронные клетки-предшественники размножаться и приводить к нейробластах, способных двигаться по ростральной миграционного потока (RMS) к обонятельной луковице (OB). Это междугородной миграции требуется для последующего созревания новорожденных нейронов в OB, но молекулярные механизмы, регулирующие этот процесс пока не ясны. Исследуя сигнальных путей, контролирующих нейробластов моторику может помочь не только понять фундаментальную шаг в нейрогенеза, но также имеют терапевтический регенеративный потенциал, учитывая способность этих нейробластах таргетинг на сайты мозга, пострадавших от травмы, инсульта или дегенерации.
В этой рукописи мы описываем подробный протокол для в естественных условиях послеродового электропорации и последующей покадровой визуализации нейробласта миграции в RMS мыши. Послеродовая электропорации может эффективно трансфекции СВЗ прародителяклетки, которые в свою очередь генерируют нейробласты мигрирующих вдоль RMS. Использование конфокальной вращающийся диск покадровой микроскопии на острых культур мозга срезов, нейробластов миграции можно наблюдать в среде тесно напоминающие состояние в естественных условиях. Кроме того, нейробластов моторики могут быть отслежены и количественному анализу. В качестве примера, мы опишем, как использовать в естественных условиях послеродовой электропорации в GFP-экспрессирующих плазмиды маркировать и визуализировать нейробласты мигрирующих вдоль RMS. Электропорации из shRNA или CRE рекомбинантному-экспрессирующих плазмид в условных нокаутных мышей, использующих систему LoxP также могут быть использованы для генов-мишеней, представляющих интерес. Фармакологические манипуляции острых культур мозга срез может быть выполнена исследовать роль различных сигнальных молекул в нейробласта миграции. Объединяя в естественных условиях электропорации с покадровой обработки изображений, мы надеемся понять молекулярные механизмы, контролирующие нейробластов моторику и способствовать разработкения новых подходов в целях содействия ремонт мозга.
Introduction
В мозге млекопитающих, генерация новых нейронов (нейрогенез) происходит после рождения в основном в двух регионах, субвентрикулярной зоне (СВЗ) из боковых желудочков и под зернистым зоне в зубчатой извилине гиппокампа 1. Значительное доказательства, собранные в последние годы поддерживает важнейшую роль в послеродовой нейрогенеза в гиппокампе и обонятельной функции памяти лампа 1-3. Важно отметить, что послеродовая нейрогенез также имеет терапевтический потенциал из-за его отношений с дегенеративными неврологическими расстройствами, и способность нейробластах мигрировать в пострадавших сайтов в мозге 4-6.
Субвентрикулярной зоне (СВЗ) недавно стала важнейшим нейрогенной нише. СВЗ-производные нейробласты мигрируют к обонятельной луковице (OB) через ростральной миграционного потока (RMS), что делает этот самый длинный процесс миграции в послеродовом 1,7,8 мозга. Млекопитающих СВЗ / RMS / система О.Б. сталполезная модель для изучения различных шагов в нейрогенеза, такие как пролиферации, миграции и дифференцировки 1,8. Многие факторы роста и внеклеточных сигналы регулируют СВЗ нейрогенеза и миграции вдоль RMS, но внутриклеточные молекулярные механизмы далеки от полного понимания 1,9. Правильное миграции вдоль RMS имеет решающее значение для последующего созревания новорожденных нейронов 10. Кроме того, некоторые исследования показали, что СВЗ-производные нейробласты могут мигрировать из RMS для ушиба мозга сайтов 4-6,11-13. Таким образом, исследуя механизмы сигнализации регулирующее нейробластов миграции является фундаментальным не только понять нейрогенез, но и для потенциальных терапевтических применений.
Здесь мы описываем подробный протокол маркировать СВЗ нервные клетки-предшественники по в естественных послеродовой электропорации и контроля за их миграции вдоль RMS при острых культур мозга срезов с помощью покадровой вращающийся диск конфокальной microscoру. Электропорацию широко используется в исследованиях развития от эмбриональных до взрослой стадии 14-18. Это мощный инструмент для выявления и манипулировать СВЗ нервные клетки-предшественники и представляет собой более дешевую и значительно быстрее альтернативу стереотаксической инъекции вирусных векторов или поколения трансгенных моделей 1,15,19,20. Это относительно простая процедура, которая не нуждается в операции и имеет высокие показатели выживаемости. Электропорация shRNA или CRE рекомбиназу экспрессирующих плазмид в мыши генетических моделей, использующих систему LoxP могут быть использованы для генов-мишеней, представляющих интерес или для достижения постоянного маркировки СВЗ предшественников, тем самым представляя собой полезный инструмент для нейрогенез исследований 21,22.
Изображений RMS нейробластов миграция в интактном мозге по-прежнему сталкивается с проблемами из-за текущих технических ограничений. Тем не менее, этот процесс можно контролировать с помощью конфокальной вращающийся диск покадровой микроскопии острых срезах мозга, которые обеспечивают подходящую систэм напоминающий состояние в естественных условиях также позволяет использовать их для фармакологической манипуляции 23,24. Муфта в естественных условиях послеродового электропорации с покадровой обработки изображений будет способствовать понимание молекулярных механизмов, контролирующих нейробластов моторику и способствовать развитию новых подходов в целях содействия ремонт мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта процедура в соответствии с МВД Великобритании Положения (Закон Животное научных мероприятиях, 1986). Ученые должны следовать принципам, установленным и утвержденным их институциональных и национальных регулирующих организаций животных.
1. Послеродовая Электропорацию
1.1. Подготовка стеклянных капилляров, ДНК решения и электропоратора
- Подготовка вытащил стеклянный капилляры (OD: 1,5 мм, ID: 0.86 мм) для инъекции ДНК. (Ориентировочные параметры для капиллярной съемника Саттер Р-97 являются: Тепло 283; Потяните 50; Скорость 90; Время 50). Сделайте отметку на капилляр, соответствующего объема приблизительно 2 мкл.
- Установите напряжение электропоратора до 5 прямоугольных импульсов, 50 мс / импульс на 100 В, с 850 мс интервалах (100 В, импульс на 50 мс, импульс ВЫКЛ 850 мсек, пульс 5).
- Развести высокой чистоты (OD 260/280> 1,80) эндотоксина плазмидную ДНК до конечной концентрации 1-2 мкг / мклс эндотоксинов буфера Трис-ЭДТА или PBS. Рекомендуется добавить 0,1% Быстрый зеленый к решению ДНК (краситель должен распространяться в желудочке, когда успешно вводили).
- Подготовьте мм электроды 5-7, электрод гель и прогрейте грелку.
1.2. Электропорацию
- Удаление послеродовой день 2 мыши щенка из клетки и обезболить его изофлурана ингаляции (при потоке ~ 0,6 л / мин).
- После приблизительно 1 мин, определить состояние обезболивания с помощью ответа ноги щепотку. Если никакого движения не происходит, перейдите к внутрижелудочкового инъекции.
- Загрузить капиллярной иглы с 1-2 мкл ДНК с использованием аспиратора трубку, соединенную с капилляра.
- Под источником холодного света, держите голову щенка между большим и указательным пальцем менее доминирующей рукой. Слегка потяните кожу обратно на голову, чтобы помочь идентифицировать нужный момент впрыска.
- Рассмотрим виртуальную линию между глазом и тон краниометрических ориентир лямбда (рис. 1А). Вставьте капиллярную иглу около одной трети длины этой линии от лямбда (около 1 мм от линии середины) 15. Вставьте капилляр о глубоких 2 мм, убедившись, чтобы избежать глубокого проникновения в мозг.
- Введите плазмиды путем продувки медленно через рот (шприц соединен с капилляром также может быть использован). Во время этой процедуры, убедитесь, что ваши пальцы не применяя слишком много давления на мозг, так как это может помешать успешному инъекции плазмиды.
- Стоп инъекции, когда минимальное количество раствора ДНК остается в капилляре. Желательно, чтобы вводить менее чем 1 мкл чтобы избежать вредного увеличение внутричерепного давления.
- Coat оба электрода с гелем и размещать их с положительной стороны на боковой стороне полушарии, где вводили ДНК (фиг. 1а). Для ДНК включения в ростральной СВЗ, место электродов слегка ростральнеевпрыск. Изменение положения электродов может достичь региональной специфики электропорации в различных областях СВЗ 22,25.
- Инициировать передачи тока нажатием на педаль импульса ножного переключателя. Когда электропорации завершена, проверьте напряжение на дисплее электропоратора (значения напряжения не должно быть ниже 90 V, так как значения ниже напряжения коррелируют с низкой эффективностью электропорации).
- Реанимируй щенка в атмосфере кислорода на грелку в течение нескольких минут и вернуть его в клетку, поместив его от матери. Убедитесь, что мать получает щенка и воссоединяется с остальной помета. После электропорации, оставить щенков с матерью в течение 4-7 дней до следующего шага.
2. Подготовка Острая мозга срез культуры
2.1. Приготовление растворов и инструменты
- Следующие растворы требуется (это также можно использовать DMEM с высоким глюкозы для рассечения и обработки изображений17):
Вскрытие Средний (500 мл)
Сбалансированный СМИ Гея - 500мл
45% Глюкоза - 5 мл
Фильм Средний (10 мл)
45% Глюкоза - 0,110 мл
HEPES 1 М - 0,100 мл
Ручка / Стрептококковое - 0,100 мл
ФТС - 0,500 мл
В27 - 0,100 мл
Глютамин - 0,200 мл
Дульбекко модификации Дульбекко (фенол красный без) - 8,89 мл - Разминка фильм среде при 37 ° С
- Наведите Millicell вставляет в 35 мм со стеклянным дном блюдо культуры, содержащей 1 мл среды кино и место в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С / 5% СО 2.
- Подготовка Vibratome аксессуары (отвертка, камеру, бритвенные лезвия, клей).
- Подготовка рассечение инструменты: ножницы, небольшой шпатель, прямые щипцы.
- Подготовьте инструменты для обработки срезов: маленькую кисть или мягкую прививки петли (размер: 10 мкл), пластиковые пипетки Пастера, коробка льда и несколько 6 см пластиковой посуды.
- Предварительного охлаждения рассечение средыпри температуре 2-4 ° С.
2.2. Подготовка мозга Ломтики
- Заполните чашку диаметром 6 см с предварительно охлажденной рассечение среды и поместить его на льду (держать свежесрезанные ломтики).
- После смещения шейных позвонков, используйте ножницы, чтобы обезглавить щенка мыши. Снимите кожу головы с помощью скальпеля, разрезать череп вдоль середины стреловидного шва от ОВ в мозжечок и осторожно удалите черепные закрылки с помощью щипцов. Убедитесь, что весь мозг подвергается и тщательно анализировать его с помощью шпателя, уделяя особое внимание, чтобы не повредить ткани. Рассечение должно быть сделано осторожно, но в то же время очень быстро (менее чем за минуту, если это возможно). Рак шейки дислокации является нашим предпочтительным способом, потому что терминал анестезия с препараты / газовых анестетиков может влиять на миграционные свойства нейробластах и здорового состояния срез культуры мозга, которые должны быть отображены относительно быстро следующих жертвоприношения животных.
- Hemisect мозг с Razили лезвие (рис. 2). Откажитесь неинъецированных полушарие или использовать для других экспериментов.
- Поместите небольшой кусочек ленты на держателе Vibratome и использовать минимальное необходимое количество клея, чтобы прикрепить полушарие мозга поверх него (рис. 2). Это предотвращает повреждение поверхности держателя из-за повторных применений клей.
- Пусть клей сухой в течение нескольких секунд.
- Поместите держатель в лоток Vibratome наполненной предварительно охлажденному раствору рассечение. Направьте обонятельной луковицы к лопасти (рис. 2).
- Начните резки полушарие мозга с помощью соответствующих настроек. Следующие параметры рекомендуются: толщина среза 300 мкм, скорость ~ 3-5; частота ~ 9. Высокая частота и низкая скорость рекомендуется для предотвращения повреждения среза.
- Соберите кусочки, используя маленькую кисть или мягкую прививки петлю. Только держите ломтики с видимым OB (обычно 2-3 ломтика / мозга). Как правило, ломтик, содержащий большую часть СУР чан быть найдены в ~ 300 мкм от поверхности дна.
- Проверьте ломтики под стандартным флуоресцентным микроскопом для GFP сигнала (и обязательно перевернуть их, чтобы проверить флуоресценции с обеих сторон), и выбрать те, показывающие яркий флуоресценции вдоль большей части СУР.
2.3. Культивирование Мозг Ломтики
- В капот культуре клеток, срежьте наиболее хвостовой треть мозга срез и удалить любые клеевые следы, используя тонкие прямые пинцетом или с микродиссекции скальпель.
- Деликатно аспирации кусочек с помощью пластиковой пипетки Пастера (отрезать кончик пипетки, чтобы создать больший открытие, это позволит избежать повреждения ломтик) и поместите его на центре нагретого Millicell вставки.
- Убедитесь, что сторона с самого яркого флуоресцентного сигнала находится в контакте с Millicell вставить (для работы с изображениями с помощью инвертированного микроскопа).
- Удалите излишки рассечение решение на верхней части вставки с помощью пипетки.
- Оставьте срез культуры впоселиться в 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора, по крайней мере в течение 1 часа до визуализации.
3. Покадровый Визуализация из нейробласта миграции
- По крайней мере, 2 часа до визуализации, включите конфокальной спиннинг диска системы Перкин Элмер UltraViewVoX, перевернутой Nikon Ti-E микроскопом, Хамамацу C10600-10B (ORCA-R2), охлажденному цифровую камеру CCD, и системы отопления (Solent научного), установленной на постоянное температура 37 ° С
- Откройте модуль сбора Volocity программного обеспечения и нажмите на кнопку «ВИЗ» и выберите лазер (ы) для работы с изображениями.
- В 2 ч. мозга подготовки ломтик положите стеклянным дном блюдо, содержащий кусочек мозга в камере изображений на столике микроскопа.
- Используйте цель Nikon CFI Супер План Fluor ELWD 20X/0.45 в рамках соответствующего флуоресцентного света, чтобы выбрать и сосредоточиться площадь среза, которые будут в образ (например, первого нисходящей части СУР просто после инъекции, или ELBOж области СУР, или сразу после локтя до нейробласты введите OB).
- Настройте покадровой обработки изображений со следующими действиями:
- На микроскопом, нажмите на кнопку L100, чтобы лазерное сканирование образца.
- В Volocity откройте UltraView Лазерная Changer, выбрав соответствующую лазера (например нм лазерный 488 для GFP).
- Установка времени экспозиции (как правило, между 100-500 мс) и интенсивности лазерного (обычно 20-30%) в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала.
- Отрегулируйте изображения цифрового усиления, чтобы улучшить визуализацию клеток.
- Выберите интервал Z-Stack имиджу внутри мозга срез (обычно более 100-120 интервал мкм). Выберите интервал с подходящим количеством изолированных клеток, чтобы избежать возможных перекрывает как можно больше (это облегчит последующий анализ отслеживания).
- Выбор интервала между каждой Z-Stack изображения (обычно 2-4 мкм).
- Выберите часовой Interval между каждым захватом Z-Stack (например, 3 мин) и общей продолжительности обработки изображений (например, 3 часа).
- Нажмите на иконку "Сохранить", чтобы сохранить изменения в параметрах визуализации.
- Нажмите кнопку записи, чтобы начать изображений.
- Альтернативные визуализации контроля и экспериментальных образцов (например, транспортного средства / лечения наркозависимости или различных электропорации плазмид) на протяжении того же дня.
4. Анализируя нейробласта миграции
- В модуле Volocity количественного определения, открыть нужный библиотеку, созданную после завершения эксперимента покадровой. Выберите "Расширенный фокус" в верхнем левом окне (рис. 4а, на стадии 1).
- Перейдите на вкладку «измерений», чтобы открыть окно измерений (рис. 4А, шаг 2).
- Список задач отображается в левом нижнем углу экрана. Перетащите "Трек" (в настоящее время в рамках программы "Разное" заголовок в нижней частисписок) на вышеуказанном пространстве. Это подскажет открытии нового окна под названием "Трек" в верхнем левом части экрана (рис. 4А, шаг 3).
- Выберите "точки" на вкладке "Вход" в окне Track (рис. 4А, стадия 4).
- Нажмите на инструмент точка (рисунок 4А, шаг 5).
- Начните отслеживать мигрирующих нейробласта щелчком мыши на центральной площади тела клетки и держать не отслеживания перемещения клеток до последнего времени точки покадровой достигается (например, точки номер 61 в течение 3 часов на протяжении фильма а) .
- Для получения данных выберите "Сделать измерения товар" из измерений меню (Рисунок 4B, шаги 6-7). Появится окно в центре экрана.
- В этом окне выберите "новое измерение пункт под названием:" и введите имя (рис. 4С, этап 8). Не забудьте выбрать опцию "Все моменты времени" перед пр.эссинга ОК (рис. 4С, шаг 9). Файл пункт измерения появится под файле покадровой и будет содержать параметры для количественного анализа (например, миграция расстояния, скорости, перемещения и скорости перемещения).
- Дважды щелкните по файлу пункт измерения, чтобы открыть его в окне (рис. 4D, шаг 10).
- Для визуализации отдельные дорожки анализируемых клеток, выберите "регистрируются Point" от "Дисплей" вариантов (рис. 4D, шаг 11).
- Щелкните правой кнопкой мыши на файле измерения товара и экспортировать его в виде текстового файла, который затем может быть импортирован в программах, как Excel для анализа параметров миграции.
- Для измерения движения между последовательными кадрами и пауз, сделанных каждой ячейки в период съемок, при измерении файла Вещи на выбор от "Дисплей" вариантов "точка" или "населения" и нажмите на ID (каждый трек имеет уникальный идентификатор). Экспорт полученный файл по приступитьING как описано в шаге 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Маркировка СВЗ-производных перелетных нейробластах можно наблюдать вдоль RMS, как правило, 4-8 дней после успешного электропорации (рис. 1В). Более длинные временные точки также могут быть выбраны, но меньше клетки можно будет найти в СУР, так как большинство из них будет ввели OB. Нейробластов начать приобретение типичную морфологию и функции зрелых зернистых клеток в OB около 2-3 недель после электропорации (не показан). После культивирования в течение ~ 1 часа, ломтики мозга от электропорации щенков мыши может быть надежно отображаемого на срок до 3-4 часов. Как сообщалось ранее 23,26, нейробласты может отображать сложную динамику миграции (рис. 3 и видео 1), которые могут быть количественно проанализированы с использованием ячейки отслеживания (рис. 4).
Рисунок 1. Postna Таль в естественных условиях электропорации. (А) Схематическое изображение электропорации в естественных условиях послеродовой день 2 мыши щенка. Пунктирная линия (красная), соединяющий глаза на краниометрические ориентир лямбда служит позиционной маркера для вставки капилляра. Впрыск указывается как зеленой точкой. Серые овальной формы указывают положение электрода, как описано в Boutin и соавт. 15 (В) Сагиттальный мыши переднего мозга срез иммуноокрашиванию для GFP через 5 дней после электропорации через GFP-экспрессирующих плазмиды. СВЗ-производные мигрирующие нейробласты могут видеть вдоль RMS и некоторые из них начали достичь OB. Ctx: кора; СВЗ: субвентрикулярной зоне; RMS: ростральная миграционный поток; О.Б.: обонятельная луковица. Бар, 400 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
н "Первоначально" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 2. Схема шаги в подготовке острых мозга срез культуры для визуализации. (А) Хвостовой и внутриполушарных сокращений (пунктирные линии) выполняются на недавно расчлененного мозга. (B) электропорации полушарие мозга помещается на держатель Vibratome. (С) сагиттальных получаются с Vibratome и наблюдается при стандартной флуоресцентного микроскопа . (D)-фрагменты с лучшим сигнала GFP культивируют в течение по крайней мере 1 часа на Millicell вставить внутрь со стеклянным дном тарелки, и (Е) затем помещают в камеру искусственного климата для работы с изображениями на перевернутой конфокальной прядильной системы на диске. Нажмите здесь чтобы просмотреть увеличенное изображение .
les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 3. Покадровый визуализации мигрирующих нейробластов. (А) вращающийся диск покадровой изображения нейробластах взятых из мыши сагиттальной мозга срез через 5 дней после электропорации через GFP-экспрессирующих плазмиды. Изображения 1 час друг от друга. Каждая панель является проекцией Z-Stack из 28 последовательных снимков 4 мкм друг от друга. Стрелки указывают 4 представительства нейробласты мигрирующих вдоль RMS отношению к обонятельной луковице (находится из картины в правом нижнем углу). (В) Представительства миграционные пути, полученные из покадровой визуализации 4 нейробластах выделены (А). (C) график, показывающий расстояние мигрировал с течением времени по два представительных нейробластов. Клетки отображения типичный сальтаторные подвижные поведение. Бар, 70 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Отслеживание анализ мигрирующих нейробластов. Последовательные шаги, используемые для отслеживания мигрирующих нейробластов с помощью программного обеспечения Volocity. Пожалуйста, см. текст подробным описанием. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Видео 1:. Покадровый изображений мигрирующих нейробластов Фильм показан участок СУР мыши с GFP-меченых мигрирующих нейробластов полученных через 5 дней после электропорации в GFP-экспрессирующих плазмиды. О.Б. находится вне поля зрения к нижней правом углу. Конфокальные Z-стеки были захвачены на вращающемся диске конфокальной с целью 20X каждые 3 мин в течение 3 часов в течение интервала 120 мкм. 10 кадров / сек: скорость Играя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективное миграция нервных клеток-предшественников вдоль RMS обеспечивает их последующее созревание в функциональные нейроны 10. Видные потоки нервных клеток-предшественников, направленные на ОВ могут видеть в человеческой младенчестве и, вероятно, играют важную роль в раннем послеродовом развития человеческого мозга 27. Более того, эти клетки способны целевой сайты мозга, пострадавших от травм и нейродегенерацию 4,28. Будучи в состоянии контролировать в реальном времени эффект генных манипуляций на динамику нейробластов становится необходимым в полной мере понять, как движение нейробластов направляется и регулируется.
Здесь мы описали протокол для мониторинга СВЗ производный миграции нейробластов путем сочетания в естественных послеродовой электропорации с покадровой конфокальной спиннинг диска микроскопии острых культур мозга срезов. В частности, мы показали, как миграции нервных клеток-предшественников могут быть помечены на электропорации в СВЗ плазмиды прилОдинг GFP. В зависимости от цели исследования, несколько типов плазмид может использоваться (например, позволяя экспрессию других флуоресцентных белков или коэкспрессией дикого типа / мутантных белков интереса, CRE рекомбиназы или shRNA вместе с флуоресцентных белков). Мы настоятельно рекомендуем использовать плазмид, содержащих курица бета актина CAG промотор 29 для выражения в естественных условиях. Визуализация срезах мозга, полученных от животных электропорации также могут быть использованы для мониторинга радиальное перемещение нейронных клеток-предшественников в OB на более длинных временных точках (7-10 дней) после электропорации 30.
После начального периода практики, в естественных условиях послеродовой электропорации становится очень надежный метод, позволяющий надежным нейробластов маркировки и для покадровой обработки изображений и анализа иммунофлюоресценции. Кроме того, этот метод предлагает принципиальное преимущество перед трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки под нейробластов конкретных промоутеров,где большинство нейробластах помечены. Действительно, электропорации позволяет разреженный маркировки нейробластах, что позволяет подробный анализ их динамики морфологии и миграции. По сравнению с стереотаксической доставки вирусных векторов 31, этот метод дешевле, быстрее и очень хорошо переносится щенков мыши. Основной недостаток состоит в том, что оно ограничено раннего постнатального этапа. В самом деле, мы настоятельно рекомендуем использовать послеродовой день 2 щенков мыши, так как мы наблюдали существенное снижение эффективности маркировки на более поздних времен, когда вирусные методы доставки становятся все более подходит 31. Однако стратегии, как электропорации CRE-экспрессирующих плазмид в соответствующих генетических мышиных моделях может быть использован для изучения нейрогенез у взрослых стадий 22.
Двухфотонное, стандартный конфокальной, вращающийся диск конфокальной и широкого поля флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для визуализации нейробластов миграции 17,23,24. Спиннинг диск конфокусное микроскопия является более дешевой альтернативой двухфотонного микроскопии. Это позволяет 3D визуализации на более высокой скорости через несколько самолетов г, ограничивая фотообесцвечивания по сравнению со стандартным конфокальной микроскопии и предлагает высокое разрешение, чем в ширину поля флуоресценции изображений 31-33. Большинство мигрирующих нейробластов имеют четко видимый сому и высоко динамичную ведущую процесс чаевые с конуса роста.
Как описано другими 17, имея перфузии камеры позволит непосредственно оценить эффекты контроля и медикаментозного лечения на одном срезе мозга. В то время как мы считаем это важным преимуществом, протокол, описанный здесь, показывает, что это не является абсолютно необходимым для жизнеспособности клеток заливать ломтики с кислородом искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) или DMEM с высоким содержанием глюкозы 17,33. Кроме того, с помощью инвертированного микроскопа облегчает объективную манипуляции по сравнению с вертикальными микроскопов, оснащенных целей погружения в воду.Мы обнаружили, что использование 20X дальней цели является оптимальным компромиссом, позволяющих отслеживать достижение большого числа клеток (обычно 25-40 за часть) и дают хорошие разрешение изображения (видео 1). Автоматическое отслеживание Также возможно, однако это не всегда надежны. По этой причине мы рекомендуем визуальный и, при необходимости, вручную проверки автоматических данных отслеживания. Более высокое увеличение изображения отдельных нейробластов может быть выполнена с использованием объектива Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W. В свободном доступе ImageJ плагин MTrackJ также может быть использован для измерения основные статистические трек 33, однако некоторые сырьевые файлы сбора данных могут быть несовместимы с этим программным обеспечением и, возможно, должны быть преобразованы в подходящих форматов для анализа, которые в некоторых случаях могут быть трудоемким . Сочетание модулей сбора и анализа изображений обеспечивается программным обеспечением Volocity позволяет непосредственный переход от захвата изображения / обработки для количественного анализа миграционной параметвкраплений (скорость, объем, и т.д.), которые могут быть легко визуализированы в различных графиков (например, показывая этим миграционные процессы / расстояние / направленность / скорость / Стойкость / время, проведенное неподвижны, и т.д.).
Нейробласты отображать сальтаторные движение, чередуя перелетных для неподвижных фаз 34,35 (рис. 3C). В свете того факта, что стационарные фазы может быть между 4-10 мин 32, мы считаем, что захват изображения каждые 3 мин представляет собой хороший компромисс следовать мигрирующих нейробластов с минимальной освещенности и фотостарения. Мы редко видим клетки остановки в течение более 6 мин, и обнаружили, что, в течение 3-часового, они, как правило, тратят в среднем 30 мин неподвижной. Согласно предыдущим сообщениям, нейробласты имеют среднюю скорость 60-100 мкм / ч, а средний индекс извилистые (фактическое смещение по мигрировали расстоянии), чуть выше 0,6 23,36, что согласуется с нашими наблюдениями. Typicсоюзником, около 60% клеток показать "миграционный" поведение (например, после почти линейные пути миграции, с извилистой индекса между 0,6-1) и 20-25% являются "разведочное" (с извилистой индекса между 0-0.4), а остальные ~ 20% могут быть классифицированы как "промежуточный" (переменный мигрирующих и поисковых фазы, с извилистой индекса между 0,4-0,6).
Мы признаем, что есть еще ограничения этого метода, поскольку мы не можем снимать нейробласты для более 3-4 ч без соблюдения существенные изменения в их подвижности. Съемки продолжительность может быть увеличена за счет снижения частоты изображений (однако это повлияет на точность анализа миграции), а также путем принятия перфузии камеры для оптимизации экологических условий для визуализации. Однако протокол, описанный здесь, включая период 3-4 ч изображения представляет собой приемлемый компромисс, позволяющий сбор достаточных данных для количественного анализамиграция. В самом деле, до сих пор нам удалось обнаружить эффекты, вызываемые по миграции на белок суперэкспрессии / подавлением 37 или фармакологической манипуляции после сравнению с соответствующим контролем (Sonego и Чжоу, неопубликованные результаты).
В заключение, сочетание в естественных послеродовой электропорации с вращающимся диском визуализации мозга срез культуры представляет собой мощный инструмент для мониторинга динамики нейробласта миграции в системе напоминающий окружающей среды в естественных условиях, предлагая возможность глубоко исследовать молекулярные механизмы, контролирующие нейробласта моторику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
МС и YZ поддерживаются KCL и KCL-китайских аспирантов studentships. МО финансировалось за счет биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета PhD студенчества. Мы благодарим Масару Okabe и Дзюнъити Миядзаки для плазмиды PCX-EGFP и Алена Chedotal и Athena Ипсиланти за ценные советы по электропорации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A.
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
