Summary
Neuroblast migration är en grundläggande händelse i postnatal neurogenes. Vi beskriver ett protokoll för effektiv märkning av neuroblaster genom in vivo-postnatal elektroporering och efterföljande visualisering av sin vandring med hjälp av time-lapse avbildning av akut hjärnan skivor. Vi inkluderar en beskrivning för kvantitativ analys av neuroblast dynamik genom videospårning.
Abstract
Den subventrikulära zonen (SVZ) är en av de viktigaste neurogena nischer i postnatal hjärnan. Här, neurala stamceller förökar sig och ge upphov till neuroblaster som kan röra sig längs rostralt vandrande ström (RMS) mot luktbulben (OB). Detta långväga migration behövs för den efterföljande mognad av nyfödda nervceller i OB, men de molekylära mekanismer som reglerar denna process är fortfarande oklart. Undersöka de signalvägar som styr neuroblast motilitet kan inte bara hjälpa till att förstå ett grundläggande steg i neurogenesis, men också ha terapeutisk regenerativ potential, med tanke på möjligheterna för dessa neuroblaster att rikta hjärn platser som drabbats av skador, stroke eller degeneration.
I detta manuskript beskriver vi ett detaljerat protokoll för in vivo-postnatal elektroporering och efterföljande tidsförlopp avbildning av neuroblast migration i mus RMS. Postnatal elektroporation kan effektivt transfektera SVZ gångareceller, som i sin tur genererar neuroblaster som migrerar längs RMS. Använda konfokala spinning disk tidsförlopp mikroskopi på akut hjärn slice kulturer, kan neuroblast migration följas i en miljö som liknar nära in vivo skick. Dessutom kan neuroblast motilitet spåras och analyseras kvantitativt. Som ett exempel beskriver vi hur man använder in vivo postnatal elektroporering av en GFP-uttryckande plasmid för att märka och visualisera neuroblaster som migrerar längs RMS. Elektroporering av shRNA eller Cre-rekombinas-uttryckande plasmider i villkorknockoutmöss med användning av loxP-systemet kan också användas för att rikta generna av intresse. Farmakologisk manipulation av akut hjärn slice kulturer kan utföras för att undersöka betydelsen av olika signalmolekyler i neuroblast migration. Genom att koppla in vivo elektroporering med time-lapse avbildning, hoppas vi att förstå de molekylära mekanismer som styr neuroblast rörlighet och bidra till att utvecklalingen av nya metoder för att främja hjärnans reparation.
Introduction
I däggdjurshjärnan, inträffar alstrandet av nya nervceller (neurogenes) efter födseln huvudsakligen i två regioner, den subventrikulära zonen (SVZ) hos de laterala ventriklarna och subgranular zonen i gyrus dentatus i hippocampus 1. Betydande bevis som samlats in under de senaste åren stöder en kritisk roll för postnatal neurogenes i hippocampus och luktloben minnesfunktioner 1-3. Huvudsakligen har postnatal neurogenes även terapeutisk potential på grund av sin relation med degenerativa neurologiska sjukdomar, och förmågan av neuroblaster att migrera till drabbade områden i hjärnan 4-6.
Den subventrikulära zonen (SVZ) har nyligen dykt upp som en viktig neurogen nisch. SVZ-härledda neuroblaster vandrar mot luktbulben (OB) via den rostrala migrationsströmmen (RMS), vilket gör detta den längsta migrationsprocessen i postnatal hjärn 1,7,8. Den däggdjurs SVZ / RMS / OB-systemet har blivit enanvändbar modell för att studera olika stegen i neurogenes, såsom tillväxt, migration och differentiering 1,8. Många tillväxtfaktorer och extracellulära signaler reglerar SVZ neurogenes och migration längs RMS, men de intracellulära molekylära mekanismerna är långt ifrån helt klar 1,9. Korrekt migration längs RMS är avgörande för den efterföljande mognaden av nyfödda nervceller 10. Dessutom har vissa studier visat att SVZ-härledda neuroblaster kan migrera ut ur RMS till hjärnskada platser 4-6,11-13. Således undersöker signaleringsmekanismer reglerande neuroblast migration är grundläggande inte bara för att förstå neurogenes utan också för potentiella terapeutiska tillämpningar.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att märka SVZ neurala stamceller genom in vivo-postnatal elektroporering och övervaka sin vandring längs RMS i akut hjärn skiva kulturer med hjälp av time-lapse spinning disk confocal microscopy. Elektroporation används ofta i utvecklingsstudier från foster till vuxen stegen 14-18. Det är ett kraftfullt verktyg för att rikta in och manipulera SVZ neurala stamceller och representerar en billigare och betydligt snabbare alternativ till stereotaktisk injektion av virala vektorer eller generering av transgena modeller 1,15,19,20. Det är ett relativt enkelt förfarande som inte kräver kirurgi och har hög överlevnad. Elektroporation av shRNA eller Crerekombinas-uttryckande plasmider i mus genetiska modeller som utnyttjar LoxP systemet kan användas för att rikta gener av intresse eller för att uppnå permanent märkning av SVZ stamceller, vilket representerar ett användbart verktyg för vuxna neurogenes studier 21,22.
Imaging RMS neuroblast migration i den intakta hjärnan är fortfarande en utmaning på grund av gällande tekniska begränsningar. Däremot kan processen övervakas med hjälp av konfokal spinning disk tidsförlopp mikroskopi av akut hjärnan skivor, som ger en lämplig system nära liknar tillståndet också mottaglig för farmakologisk manipulation 23,24 in vivo. Koppling in vivo-postnatal elektroporering med time-lapse avbildning kommer att underlätta förståelsen av de molekylära mekanismer som styr neuroblast rörlighet och bidra till utvecklingen av nya metoder för att främja hjärnans reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande är i enlighet med den brittiska Home Office förordningarna (Animal Scientific Rutiner lagen, 1986). Forskare bör följa de riktlinjer som fastställts och godkänts av deras institutionella och nationella djur reglerande organisationer.
1. Postnatal Elektroporering
1,1. Beredning av glaskapillärer, DNA-lösning och Electroporator
- Förbered drog glaskapillärer (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) för DNA-injektion. (Vägledande inställningar för en Sutter P-97 kapillär avdragare är: Heat 283, Pull 50, Hastighet 90, Time 50). Gör en markering på det kapillära motsvarande en volym av ca 2 | il.
- Ställ in spänningen hos elektroporator till 5 fyrkantpulser, 50 msek / puls vid 100 V, med 850 ms intervall (100 V, puls på 50 ms, puls OFF 850 msek, puls 5).
- Späd högrent (OD 260/280> 1,80) endotoxinfritt plasmid-DNA till en slutlig koncentration av 1-2 ug / ulmed endotoxin frigöra Tris-EDTA-buffert eller PBS. Det rekommenderas att lägga till 0,1% Fast Green till DNA-lösningen (färgämnet bör spridas i kammaren när framgångsrikt injiceras).
- Förbered 5-7 mm elektroder, elektrod gel och värma upp värmedyna.
1,2. Elektroporering
- Ta bort en postnatal dag 2 mus valp från buren och söva den med isofluran inandning (vid ett flöde av ~ 0,6 L / min).
- Efter ca 1 min, fastställa tillståndet för anesthetization använder foten nypa respons. Om ingen rörelse sker, fortsätt med intraventrikulär injektion.
- Load kapillär nål med 1-2 | il av DNA med användning av ett sugrör som är ansluten till kapillären.
- Under en kall ljuskälla, hålla huvudet av valpen mellan tummen och pekfingret på din mindre dominanta hand. Något dra huden tillbaka på huvudet för att identifiera rätt insprutningspunkten.
- Betrakta en virtuell linje mellan ögat och than craniometric landmärke lambda (Figur 1A). Sätt i kapillär nål vid ungefär en tredjedel av längden av denna linje från lambda (ca 1 mm från linjen mittpunkt) 15. Sätt i kapillär cirka 2 mm djupa, och se till att undvika djup inträngning i hjärnan.
- Injicera plasmiden genom att blåsa långsamt genom munnen (en spruta ansluten till kapillären kan också användas). Under denna procedur, se till att dina fingrar inte tillämpa för mycket tryck på hjärnan, eftersom detta kan förhindra framgångsrik plasmid injektion.
- Stoppa injektion när en minimal mängd av DNA-lösning som finns kvar i kapillären. Det är lämpligt att injicera mindre än 1 l för att undvika skadlig ökning av intrakraniellt tryck.
- Coat båda elektroder med gel och placera dem med den positiva sidan på den laterala sidan av halvklotet där DNA injicerades (Figur 1A). För DNA-införlivande i den rostrala SVZ, placera elektroderna något rostralt tillinsprutningspunkt. Varierande elektrodläget kan uppnå regional specificitet elektroporation i olika delar av SVZ 22,25.
- Initiera strömöverföring genom att trycka på puls fotpedalen pedalen. När elektroporation är klar, kontrollera spänningen på elektroporator displayen (spänningsvärden bör inte vara lägre än 90 V, eftersom lägre spänningsvärden korrelerar med dålig elektroporation effektivitet).
- Väcka till liv valpen under syre på värmedyna i några minuter och återlämna den till buren, placera den bort från mamman. Se till att mamman hämtar valpen och återförenar den med resten av kullen. Efter elektroporation, lämnar valpar med sin mamma i 4-7 dagar innan nästa steg.
2. Beredning av akut hjärn Slice kulturer
2,1. Beredning av lösningar och verktyg
- Följande lösningar krävs (det är också möjligt att använda hög-glukos DMEM för att dissekera och bildbehandling17):
Dissektion Medium (500 ml)
Gey Balanced media - 500ml
45% glukos - 5 ml
Movie Medium (10 ml)
45% glukos - 0,110 ml
HEPES 1 M - 0.100 ml
Penna / Strep - 0.100 ml
FCS - 0,500 ml
B27 - 0.100 ml
Glutamin - 0.200 ml
Dulbeccos modifierade Eagle-medium (fenolrött-fri) - 8,89 ml - Värm upp film-medium vid 37 ° C.
- Placera Millicell infogas i ett 35 mm glas botten odlingsskål innehållande 1 ml av filmmediet och lägg i en fuktad inkubator vid 37 ° C / 5% CO 2.
- Förbered Vibratome tillbehör (skruvmejsel, kammare, rakblad, lim).
- Förbered dissektion verktyg: sax, liten spatel, raka pincett.
- Förbered verktyg för hantering av skivor: liten pensel eller mjuk inokulering slinga (storlek: 10 l), plast Pasteur pipetter, en isbox och flera 6 cm plastskålar.
- Förkyla dissektion medietvid 2-4 ° C.
2.2. Beredning av hjärnan skivor
- Fyll en 6 cm skål med kyld dissektion medium och placera den på is (för att hålla nyskurna skivor).
- Efter halsdislokation, använda sax för att halshugga musen valpen. Avlägsna hårbotten med en skalpell, skär skallen längs mitt sagittal sutur från OB till lillhjärnan och försiktigt bort de kraniala flikarna med hjälp av pincett. Se till att hela hjärnan är utsatt och noggrant dissekera ut den med hjälp av en spatel, tar särskilt försiktig med att inte skada vävnaden. Den dissektion måste göras försiktigt, men på samma gång mycket snabbt (mindre än en minut, om möjligt). Halsdislokation är vår metod som föredras, eftersom terminal anestesi med läkemedel / gas anestetika kan påverka flytt egenskaperna för neuroblaster och hälsosamt tillstånd av hjärnan skiva kulturer, som måste avbildas relativt snabbt efter djuroffer.
- Hemisect hjärnan med en razeller blad (Figur 2). Kasta oinjicerade halvklotet eller användning för andra experiment.
- Placera en liten bit tejp på vibratome hållaren och använda den minimala nödvändiga mängden av lim för att fästa den hjärnhalvan ovanpå det (figur 2). Detta förhindrar skada av innehavaren ytan på grund av upprepade lim applikationer.
- Låt limmet torka i några sekunder.
- Placera hållaren i vibratome bricka fylld med kyld dissektion lösning. Rikta luktbulben mot bladet (Figur 2).
- Börja skära hjärnan halvklotet med hjälp av lämpliga inställningar. Följande parametrar rekommenderas: skivtjocklek 300 um, hastighet ~ 3-5, frekvens ~ 9. Hög frekvens och låg hastighet rekommenderas att förhindra skador på skivan.
- Samla skivor med hjälp av en liten pensel eller en mjuk inokulering slinga. Bara hålla skivor med synliga OB (oftast 2-3 skivor / hjärna). Typiskt segmentet innehåller de flesta av de RMS can hittas på ~ 300 | im från bottenytan.
- Kontrollera skivor under en standard fluorescerande mikroskop för GFP-signal (se till att vända dem över till kolla fluorescens på båda sidor), och välja de visar ljusa fluorescens längs de flesta av RMS.
2,3. Odling hjärnan skivor
- I en cellkultur huva, skär bort den mest kaudala tredjedel av hjärnan skiva och ta bort eventuella lim spår med hjälp av fina raka pincett eller en microdissection skalpell.
- Fint aspirera segment med hjälp av en plast pasteurpipett (skär spetsen på pipetten för att skapa en större öppning, kommer detta att undvika skador på skivan) och placera den i mitten av en uppvärmd Millicell insats.
- Se till att sidan med den ljusfluorescenssignalen är placerad i kontakt med Millicell infoga (för avbildning med ett inverterat mikroskop).
- Ta bort överflödigt dissektion lösning på toppen av insatsen med en pipett.
- Lämna slice kulturer tillsedimentera i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator under minst 1 timme innan avbildning.
3. Time-lapse avbildning av neuroblast migration
- Minst 2 timmar innan avbildning, slå på Perkin Elmer UltraViewVoX konfokala spinning disksystem, inverterade Nikon Ti-E mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) kyld digital CCD-kamera, och värmesystem (Solent Scientific) satt vid konstant temperatur av 37 ° C.
- Öppna Volocity programvara Förvärv modul och klicka på "Viz"-knappen och välj laser (er) för avbildning.
- Inom 2 timmar av hjärnan skiva förberedelse, placera glaset nedre skålen innehåller hjärnan skiva i avbildning kammare på mikroskop scenen.
- Använd en Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 mål under lämplig fluorescerande ljus för att välja och fokusera på området för den del som kommer att avbildas (t.ex. den första nedåtgående delen av RMS strax efter injektionsstället, eller Elbow region i RMS, eller strax efter armbågen före neuroblaster ange OB).
- Ställ in tidsförlopp avbildning med följande åtgärder:
- I mikroskopet, klicka på L100 för att möjliggöra laserskanning av provet.
- I Volocity Öppna Ultra Laser växlare genom att välja lämplig laser (t.ex. 488 nm laser för GFP).
- Ställ in exponeringstiden (vanligtvis mellan 100 till 500 msek) och laserintensiteten (vanligen 20-30%), beroende på intensiteten av den fluorescerande signalen.
- Justera bilden digital förstärkning för att förbättra cell visualisering.
- Välj z-stack intervallet till bilden inne i hjärnan slice (vanligtvis över en 100-120 nm intervall). Välj ett intervall med ett lämpligt antal isolerade celler för att undvika eventuella överlappningar så mycket som möjligt (detta kommer att underlätta den efterföljande spårningsanalys).
- Välj avståndet mellan varje z-stack bild (vanligen 2-4 um).
- Välj tids interval mellan varje z-stack infångning (t ex 3 min) och den totala avbildnings varaktighet (t.ex. 3 h).
- Klicka på ikonen "Spara" för att spara ändringarna i avbildningsparametrar.
- Tryck på inspelningsknappen för att starta avbildning.
- Alternate avbildning av kontroll-och experimentprover (t.ex. fordon / läkemedelsbehandling eller andra elektroporerade plasmider) under samma dag.
4. Analysera neuroblast migration
- I Volocity Kvantifiering modul öppnar önskad biblioteket skapat efter att ha avslutat ett tidsförlopp experiment. Välj "Extended Focus" från det övre vänstra rutan (Figur 4A, steg 1).
- Klicka på fliken "Mätningar" för att visa mätningsfönstret (Figur 4A, steg 2).
- En lista över uppgifter syns i nedre vänstra hörnet av skärmen. Drag "Track" (närvarande under "Diverse" rubrik på botten avlistan) om utrymmet ovanför. Detta kommer att förmå att öppna ett nytt fönster som heter "Spår" i övre vänstra delen av skärmen (Figur 4A, steg 3).
- Välj "Poäng" från "Input"-fliken i spår fönstret (Figur 4A, steg 4).
- Klicka på Point Tool (Figur 4A, steg 5).
- Börja spåra den vandrande neuroblast genom att klicka med musen på den centrala delen av cellkroppen och hålla spåra cellrörelse tills den sista tidpunkten för tidsförlopp har uppnåtts (t.ex. punkt nummer 61 för en 3 timmar lång film) .
- För att erhålla data välj "Gör Measurement Post" från menyn Mätning (Figur 4B, steg 6-7). Ett fönster kommer att visas i mitten av skärmen.
- I det här fönstret väljer du "En ny mätning post kallad:" och skriv ett namn (Figur 4C, steg 8). Kom ihåg att välja "alla tidpunkter" alternativ innan prEssing OK (Figur 4C, steg 9). En mätning objekt fil kommer att visas under den tidsförlopp fil och kommer att innehålla parametrar för kvantitativ analys (t.ex. migration avstånd, hastighet, deplacement, och förskjutningshastighet).
- Dubbelklicka på mätningen posten filen för att öppna den som ett fönster (Figur 4D, steg 10).
- För att visualisera de enskilda spåren av analyserade celler, välj "Band Point" från alternativen "Display" (Figur 4D, steg 11).
- Högerklicka på den mätnings Post-filen och exportera den som en textfil, som sedan kan importeras i program som Excel för att analysera migrationsparametrar.
- För att mäta rörelser mellan konsekutiva ramar och pauser från varje cell under inspelningen perioden, i Measurement Post filen välja från "Display" alternativ "Point" eller "patientgrupper" och klicka på ID (varje spår har ett unikt ID). Exportera den resulterande filen genom att fortsättaning som förklaras i steg 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kan observeras Märkning av SVZ-härledda flyttande neuroblaster längs RMS, vanligen 4-8 dagar efter en lyckad elektroporering (Figur 1B). Längre tidpunkter kan också väljas, men färre celler kommer att finnas i de RMS eftersom de flesta av dem kommer att ha kommit in i OB. Neuroblaster börjar förvärva typisk morfologi och egenskaper av mogna granulat celler i OB omkring 2-3 veckor efter elektroporation (visas ej). Efter odling i ~ 1 timme, kan hjärnan skivor från elektroporerade mus valpar tillförlitligt avbildas i upp till 3-4 timmar. Som tidigare rapporterats 23,26, kan neuroblaster visa komplexa migrationsdynamiken (Figur 3 och Video 1), vilket kan vara kvantitativt analyseras med hjälp av cell tracking (Figur 4).
Figur 1. Postna tal in vivo-elektroporering. (A) Schematisk bild av in vivo-elektroporering av en postnatal dag 2 mus valp. En streckad linje (röd) som förbinder ögat till craniometrical landmärke lambda tjänar såsom en positionsmarkör för kapillär införing. Injektions punkten anges som en grön prick. Grå ovala former indikerar elektrod position som beskrivs i Boutin et al. 15 (B) Sagittal musen framhjärnan slice immunostained för GFP 5 dagar efter elektroporation av en GFP-uttryckande plasmid. SVZ-härledda migrera neuroblaster är synliga längs RMS och några av dem har börjat nå OB. Ctx: cortex; SVZ: subventrikulära zon, RMS: rostral vandrande ström, OB: luktbulben. Bar, 400 nm. Klicka här för att visa en större bild .
n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Schematisk steg i beredningen av akut hjärn skiva kulturer för avbildning. (A) Stjärt och intrahemispheric snitt (streckade linjer) är utförd på en nyligen dissekeras hjärnan. (B) electroporated hjärnhalvan placeras på en vibratome hållaren. (C) sagittala skivor erhålles med en vibratom och observerades under en standardfluorescensmikroskop . (D) Skivor med bästa GFP signalen odlas i minst 1 timme på en Millicell sätta i en glasbottnad skål, och (e) därefter placeras i en klimatkammare för avbildning av en inverterad konfokala spinning disksystem. Klicka här för att visa en större bild .
les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Time-lapse avbildning av migrera neuroblaster. (A) Spinning disk time-lapse bilder av neuroblaster tagna från en mus sagittal hjärna skiva 5 dagar efter elektroporation av en GFP-uttryckande plasmid. Bilder är 1 hr isär. Varje panel är en z-stack projektion av 28 bilder i följd 4 ìm isär. Pilar indikerar 4 representativa neuroblaster som migrerar längs RMS mot luktloben (placerad ur bilden i det nedre högra hörnet). (B) Representativa flyttvägar som erhållits från time-lapse avbildning av de 4 neuroblaster markerade i (A). (C) Diagram som visar avståndet migrerade med tiden med 2 representativa neuroblaster. Celler som visar en typisk saltatorisk motila beteende. Bar, 70 um. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Spårning analys av migrera neuroblaster. Sekventiella steg som används för att spåra flyttande neuroblaster hjälp av Volocity programvara. Se text för närmare beskrivning. Klicka här för att visa en större bild .
Video 1:. Time-lapse avbildning av flyttande neuroblaster Filmen visar en sektion av musen RMS med GFP-märkta migrera neuroblaster erhållna 5 dagar efter elektroporation av en GFP-uttryckande plasmid. OB ligger utom synhåll mot det nedre högra hörnet. Konfokala z-stackar fångades på en snurrande skiva konfokala med en 20X mål var 3 min under 3 timmar under en ìm intervall 120. Spela Hastighet: 10 bilder / sek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv migration av neurala stamceller längs RMS garanterar deras efterföljande mognad i funktionella nervceller 10. Framstående strömmar av neurala stamceller riktade mot OB är synliga i människans linda och kommer sannolikt att spela en viktig roll i tidig postnatal mänskliga hjärnans utveckling 27. Dessutom är dessa celler kan rikta platser som drabbats av skada och neurodegeneration 4,28 hjärna. Att kunna övervaka i realtid effekten av genmanipulation på neuroblast dynamik blir viktigt att till fullo förstå hur neuroblast rörelse styrs och regleras.
Här har vi beskrivit ett protokoll för att övervaka SVZ-derived neuroblast migration genom att koppla in vivo-postnatal elektroporering med tidsförlopp konfokala spinning disk mikroskopi av akut hjärn skiva kulturer. Närmare bestämt har vi visat hur migrerar neurala progenitorceller kan märkas genom electroporating i SVZ en plasmid encoding GFP. Beroende på syftet med studien, kan flera typer av plasmider användas (t.ex. att tillåta expression av andra fluorescerande proteiner eller samexpression av vildtyp / mutant-proteiner av intresse, Cre-rekombinas, eller shRNA tillsammans med fluorescerande proteiner). Vi rekommenderar starkt att du använder plasmider innehållande kyckling beta aktin CAG promotor 29 för in vivo-uttryck. Avbildning av hjärnan skivor erhållna från electroporated djur kan också användas för att följa den radiella migration av neurala progenitorceller i OB vid längre tidpunkter (7-10 dagar) efter elektroporering 30.
Efter en inledande period av praktik, blir in vivo-postnatal elektroporering en mycket tillförlitlig metod, vilket gör robust neuroblast märkning av både tidsförlopp imaging och immunfluorescensanalys. Dessutom erbjuder denna teknik ett grundläggande fördel jämfört med transgena möss som uttrycker fluorescerande proteiner i neuroblast specifika promotorer,där majoriteten av neuroblaster är märkta. I själva verket låter elektroporation glesa märkning av neuroblaster, vilket möjliggör detaljerad analys av deras morfologi och migrationsdynamiken. Jämfört med den stereotaktiska leverans av virala vektorer 31, denna teknik är billigare, snabbare och tolereras mycket väl av musungar. Den viktigaste nackdelen består i det faktum att den är begränsad till första tiden efter födseln. Ja, rekommenderar vi att du använder postnatal dag 2 mus valpar, eftersom vi observerade en betydande minskning av effektivitetsmärkning vid senare tillfällen, då virala leveransmetoder blir mer passande 31. Däremot kan strategier som elektroporation av CRE-uttryckande plasmider i lämpliga mus genetiska modeller användas för att studera neurogenes i vuxensteg 22.
Två-foton, standard konfokal, snurrande skiva konfokala och brett fält fluorescensmikroskopi kan alla användas för att visualisera neuroblast migration 17,23,24. Spinning disk confokal mikroskopi är ett billigare alternativ till två-foton mikroskopi. Det gör 3D-röntgen vid högre hastighet genom flera z-plan, begränsar fotoblekning jämfört med standard konfokalmikroskopi och erbjuda en högre upplösning än brett fält fluorescens avbildning 31-33. Majoriteten av flyttande neuroblaster har en väl synlig soma och en mycket dynamisk ledande process tippas med en tillväxt kon.
Som beskrivs av andra 17, skulle ha en perfusion kammare tillåter att direkt bedöma effekterna av kontroll-och drogbehandlingar på samma hjärnan skiva. Även om vi anser att detta är en viktig fördel, det protokoll som beskrivs här visar att det är inte absolut nödvändigt för cellviabilitet till BEGJUTA skivor med syresatt artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) eller hög glukos DMEM 17,33. Dessutom med ett inverterat mikroskop tillåter enklare objektiv manipulation jämfört med upprätt mikroskop utrustad med vatten nedsänkning mål.Vi fann att du använder en 20X långväga mål är en optimal kompromiss, som möjliggör spårning av ett stort antal celler (vanligen 25-40 per skiva) och producera bra upplösning (Video 1). Automatisk spårning är också möjligt, men det är inte alltid tillförlitliga. Därför rekommenderar vi visuell och, om nödvändigt, manuell kontroll av automatiska uppgifter spårning. Högre förstoring avbildning av enskilda neuroblaster kan utföras med användning av ett Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W mål. Den fritt tillgängliga ImageJ plugin MTrackJ kan också användas för att mäta grundläggande spårstatistik 33, men vissa rådatainsamlingsfiler kan vara oförenligt med denna programvara och kan behöva konverteras till lämpliga format för analys, vilket i vissa fall kan vara tidskrävande . Kombinationen av bild insamling och analys av moduler som tillhandahålls av Volocity programvara gör en omedelbar övergång från bild fånga / bearbetning till kvantitativ analys av migrations paramegor (hastighet, deplacement, etc.), som lätt kan visualiseras i en mängd olika grafer (t.ex. visar flyttmönster / sträcka / riktning / hastighet / uthållighet / tid orörlig, etc.).
Neuroblaster visar en saltatorisk rörelse, omväxlande vandrande till stationära faser 34,35 (figur 3C). Mot bakgrund av det faktum att stationära faser kan vara mellan 4-10 min 32, tror vi att ta bilder var 3 min är en bra kompromiss för att följa migrera neuroblaster med minimal belysning och fotoskador. Vi ser sällan celler som stannar i mer än 6 minuter, och upptäcker att, under en 3-timmarsperiod, de i allmänhet tillbringar i genomsnitt 30 minuter orörlig. Enligt tidigare rapporter, neuroblaster har en medelhastighet på 60-100 ìm / tim och en genomsnittlig slingrande index (faktisk förskjutning över den migrerade distans), något över 0,6 23,36, vilket är i överensstämmelse med våra observationer. Typicbundsförvant, cirka 60% av celler visar en "vandrande" beteende (t.ex. efter nästan linjära migrationsvägar, med en slingrande index mellan 0,6-1) och 20-25% är "undersökande" (med en slingrande index mellan 0 till 0,4), medan resterande ~ 20% kan klassificeras som "mellanliggande" (omväxlande flyttande och förberedande faser, med en slingrande index mellan 0,4-0,6).
Vi inser att det fortfarande finns begränsningar för denna teknik, eftersom vi inte kan filma neuroblaster i mer än 3-4 timmar utan att iaktta väsentliga förändringar i sin rörlighet. Filmning varaktighet skulle kunna ökas genom att sänka imaging frekvens (hur detta kommer att påverka noggrannheten i analysen migrations) samt genom att anta en perfusion kammare för att optimera miljöförhållanden för avbildning. Dock beskrev protokollet här inklusive en 3-4 tim imaging perioden utgör en lämplig kompromiss som gör det möjligt att samla in tillräckligt med uppgifter för kvantitativ analys avmigration. Ja, så långt vi har lyckats påvisa effekterna som produceras om migration av proteinuttryck / nedreglering 37 eller genom farmakologisk manipulation efter jämförelse med lämpliga kontroller (Sonego och Zhou, opublicerade resultat).
Sammanfattningsvis, en kombination av in vivo-postnatal elektroporering med snurrande skiva avbildning av hjärnan skiva kulturer utgör ett kraftfullt verktyg för att följa dynamiken i neuroblast migration i ett system som i mycket liknar det in vivo-miljö som ger möjlighet att undersöka på djupet de molekylära mekanismer som styr neuroblast motilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
MS och YZ stöds av KCL och KCL-Kina doktorandtjänster. MO finansierades av en bioteknik och Biological Sciences Research Council doktorand. Vi tackar Masaru Okabe och Jun-ichi Miyazaki för PCX-EGFP plasmid och Alain Chedotal och Athena Ypsilanti för värdefulla råd om elektroporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
