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Neuroscience

माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग

Published: November 25, 2013 doi: 10.3791/50905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Neuroblast प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक मौलिक घटना है. हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें के समय चूक इमेजिंग का उपयोग vivo में प्रसव के बाद electroporation और उनके प्रवास के बाद के दृश्य द्वारा neuroblasts के कुशल लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम वीडियो पर नज़र रखने के द्वारा Neuroblast गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विवरण शामिल हैं.

Abstract

subventricular क्षेत्र (SVZ) प्रसव के बाद मस्तिष्क में मुख्य तंत्रिकाजन्य आलों में से एक है. इधर, तंत्रिका progenitors पैदा करना और घ्राण बल्ब (ओ) की ओर व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा (आरएमएस) के साथ ले जाने में सक्षम neuroblasts को जन्म दे. यह लंबी दूरी के प्रवास ओबी में नवजात न्यूरॉन्स के बाद परिपक्वता के लिए आवश्यक है, लेकिन इस प्रक्रिया को विनियमित आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है. Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित करने के संकेत दे रास्ते की जांच कर neurogenesis में एक बुनियादी कदम को समझने में मदद, लेकिन यह भी चोट, स्ट्रोक, या अध: पतन से प्रभावित मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने के लिए इन neuroblasts की क्षमता दे दी, चिकित्सकीय पुनर्योजी क्षमता हो सकती है ही नहीं.

इस पांडुलिपि में हम vivo में प्रसव के बाद electroporation और माउस आरएमएस में Neuroblast प्रवास के बाद के समय चूक इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रसव के बाद electroporation कुशलतापूर्वक SVZ पूर्वज transfect कर सकते हैंबदले में आरएमएस साथ पलायन neuroblasts उत्पन्न कोशिकाओं है, जो. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों पर डिस्क समय चूक माइक्रोस्कोपी कताई confocal का प्रयोग, Neuroblast प्रवास बारीकी में विवो हालत जैसी एक वातावरण में नजर रखी जा सकती है. इसके अलावा, Neuroblast गतिशीलता पर नज़र रखी और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में, हम आरएमएस साथ पलायन neuroblasts लेबल और कल्पना करने के लिए एक GFP-व्यक्त प्लाज्मिड के vivo प्रसव के बाद electroporation उपयोग करने के लिए क्या करते हैं. LoxP प्रणाली को रोजगार सशर्त पीटा चूहों में shRNA या Cre recombinase व्यक्त plasmids के electroporation भी ब्याज की जीन लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों के औषधीय हेरफेर Neuroblast प्रवास में अलग संकेतन अणुओं की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है. समय चूक इमेजिंग के साथ vivo electroporation में युग्मन, हम Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित आणविक तंत्र को समझने और विकसित करने के लिए योगदान करने की उम्मीद हैउपन्यास के बयान मस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के दृष्टिकोण.

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स (न्यूरोजेनेसिस) की पीढ़ी के लिए मुख्य रूप से दो क्षेत्रों में जन्म के बाद होता है, हिप्पोकैम्पस 1 की दांतेदार गाइरस में पार्श्व ventricles और subgranular क्षेत्र के subventricular क्षेत्र (SVZ). हाल के वर्षों में एकत्र हुए काफी सबूत हिप्पोकैम्पस और घ्राण बल्ब स्मृति समारोह 1-3 में प्रसव के बाद neurogenesis के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करता है. महत्वपूर्ण बात है, प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस भी चिकित्सकीय क्योंकि अपक्षयी मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के साथ अपने संबंधों की क्षमता है, और मस्तिष्क 4-6 में घायल साइटों की ओर पलायन neuroblasts की क्षमता रखती है.

subventricular क्षेत्र (SVZ) ने हाल ही में एक महत्वपूर्ण तंत्रिकाजन्य जगह के रूप में उभरा है. SVZ व्युत्पन्न neuroblasts इस प्रसव के बाद मस्तिष्क 1,7,8 में सबसे लंबे समय तक माइग्रेशन प्रक्रिया बनाने, व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा (आरएमएस) के माध्यम से घ्राण बल्ब (ओ) की ओर पलायन. स्तनधारी SVZ / आरएमएस / ओ प्रणाली एक बन गया हैइस तरह के प्रसार, प्रवास और भेदभाव 1,8 के रूप में neurogenesis में विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी मॉडल. कई वृद्धि कारकों और बाह्य cues आरएमएस साथ SVZ न्यूरोजेनेसिस और प्रवास विनियमित, लेकिन intracellular आणविक तंत्र अब तक पूरी तरह से किया जा रहा से 1,9 समझ में आ रहे हैं. आरएमएस साथ उचित प्रवास नवजात न्यूरॉन्स 10 के बाद परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है. साथ ही, कुछ अध्ययनों SVZ व्युत्पन्न neuroblasts मस्तिष्क चोट साइटों 4-6,11-13 को आरएमएस के बाहर पलायन कर सकते हैं कि पता चला है. इस प्रकार, संकेतन तंत्र विनियमन Neuroblast प्रवास की जांच न्यूरोजेनेसिस समझने के लिए न केवल मौलिक लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए है.

यहाँ, हम vivo में प्रसव के बाद electroporation द्वारा SVZ तंत्रिका progenitors लेबल और समय चूक कताई डिस्क confocal microsco का उपयोग तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में आरएमएस साथ उनके प्रवास नजर रखने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णनpy. Electroporation व्यापक रूप से भ्रूण से वयस्क चरणों 14-18 को विकास अध्ययन में प्रयोग किया जाता है. यह SVZ तंत्रिका progenitors लक्ष्य और हेरफेर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और ट्रांसजेनिक मॉडल 1,15,19,20 के वायरल वैक्टर या पीढ़ी की stereotactic इंजेक्शन के लिए एक सस्ता और काफी तेजी से विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. यह सर्जरी की जरूरत है और उच्च जीवित रहने की दर है नहीं है एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. ShRNA या LoxP प्रणाली ब्याज की जीन को लक्षित करने या SVZ progenitors के स्थायी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, इस प्रकार वयस्क neurogenesis पढ़ाई 21,22 के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है रोजगार माउस आनुवंशिक मॉडल में Cre recombinase व्यक्त plasmids के electroporation.

बरकरार मस्तिष्क में इमेजिंग आरएमएस Neuroblast प्रवास अभी भी कारण वर्तमान तकनीकी सीमाओं को चुनौती दे रहा है. हालांकि, इस प्रक्रिया को एक उपयुक्त syst प्रदान जो तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें के confocal कताई डिस्क समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर नजर रखी जा सकती हैउन्हें बारीकी से औषधीय हेरफेर 23,24 करने के लिए भी उत्तरदायी में विवो हालत जैसी. समय चूक इमेजिंग के साथ vivo प्रसव के बाद electroporation में युग्मन Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित आणविक तंत्र की समझ की सुविधा और मस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए उपन्यास दृष्टिकोण के विकास के लिए योगदान देगा.

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Protocol

यह प्रक्रिया ब्रिटेन के गृह मंत्रालय विनियम (पशु वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम, 1986) के अनुसार है. वैज्ञानिकों की स्थापना की और उनके संस्थागत और राष्ट्रीय पशु नियामक संगठनों द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए.

1. प्रसव के बाद Electroporation

1.1. कांच capillaries, डीएनए समाधान और Electroporator की तैयारी

  1. डीएनए इंजेक्शन के लिए खींच लिया कांच capillaries (0.86 मिमी: 1.5 मिमी, आईडी ओवर ड्राफ्ट) तैयार करें. (एक Sutter पी 97 केशिका खींचने के लिए सांकेतिक सेटिंग कर रहे हैं: गर्मी 283, 50 पुल, वेग 90; समय 50). लगभग 2 μl की एक मात्रा को इसी केशिका पर एक निशान बना.
  2. 850 मिसे के अंतराल (100 वी, 50 मिसे पर पल्स, 850 मिसे, नाड़ी 5 रवाना नाड़ी) के साथ, 100 वी में 5 वर्ग दालों, 50 मिसे / नाड़ी को electroporator की वोल्टेज सेट.
  3. 1-2 ग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए उच्च शुद्धता (आयुध डिपो> 1.80 260/280) पतला endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनएendotoxin के साथ Tris-EDTA बफर या पीबीएस मुक्त. यह डीएनए समाधान (सफलतापूर्वक जब इंजेक्शन डाई निलय में फैल चाहिए) को 0.1% फास्ट ग्रीन जोड़ने की सिफारिश की है.
  4. , 5-7 मिमी इलेक्ट्रोड तैयार इलेक्ट्रोड जेल और हीटिंग पैड को गर्म.

1.2. Electroporation

  1. पिंजरे से एक प्रसव के बाद दिन 2 माउस पिल्ला निकालें और (~ 0.6 एल / मिनट की एक प्रवाह में) isoflurane साँस लेना द्वारा यह anesthetize.
  2. लगभग 1 मिनट के बाद, पैर चुटकी प्रतिक्रिया का उपयोग anesthetization की स्थिति का पता लगाने. कोई आंदोलन होता है, intraventricular इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ना.
  3. केशिका से जुड़े एक Aspirator ट्यूब का उपयोग डीएनए के 1-2 μl के साथ केशिका सुई लोड.
  4. एक ठंड प्रकाश स्रोत के तहत, अपने अंगूठे और अपने कम प्रमुख हाथ की तर्जनी के बीच पिल्ला के सिर पकड़. थोड़ा सही इंजेक्शन बिंदु की पहचान में मदद करने के लिए सिर पर त्वचा वापस खींच.
  5. आंख और टी के बीच एक आभासी लाइन पर विचारवह मील का पत्थर लैम्ब्डा (चित्रा 1 ए) craniometric. लैम्ब्डा (रेखा मध्य से लगभग 1 मिमी) 15 से इस लाइन की लंबाई के बारे में एक तिहाई पर केशिका सुई डालें. मस्तिष्क में गहरी पैठ से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है, गहरी 2 मिमी के बारे में केशिका डालें.
  6. मुंह के माध्यम से धीरे धीरे बह द्वारा प्लाज्मिड इंजेक्ट (केशिका से जुड़े एक सिरिंज का भी इस्तेमाल किया जा सकता है). इस सफल प्लाज्मिड इंजेक्शन रोका जा सकता है के रूप में इस प्रक्रिया के दौरान, अपनी उंगलियों मस्तिष्क पर बहुत अधिक दबाव लागू नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  7. डीएनए समाधान की एक न्यूनतम राशि केशिका में छोड़ दिया है जब इंजेक्शन बंद करो. यह intracranial दबाव में हानिकारक वृद्धि से बचने के लिए कम से कम 1 μl इंजेक्षन करने के लिए सलाह दी जाती है.
  8. कोट दोनों जेल के साथ इलेक्ट्रोड और डीएनए (चित्रा 1 ए) इंजेक्ट किया गया था जहां गोलार्द्ध के पार्श्व पक्ष पर सकारात्मक पक्ष के साथ उन्हें जगह है. को विजय - स्तम्भ SVZ में डीएनए शामिल करने के लिए, जगह इलेक्ट्रोड थोड़ा विजय - स्तम्भइंजेक्शन बिंदु. इलेक्ट्रोड स्थिति बदलती SVZ 22,25 के विभिन्न क्षेत्रों में electroporation की क्षेत्रीय विशिष्टता हासिल कर सकते हैं.
  9. पल्स footswitch पेडल दबाकर वर्तमान स्थानांतरण करें. Electroporation के पूरा होने पर, (कम वोल्टेज मूल्यों गरीब electroporation दक्षता के साथ सहसंबंधी के बाद वोल्टेज मूल्यों, 90 वी नीचे नहीं होना चाहिए) electroporator प्रदर्शन पर वोल्टेज की जाँच करें.
  10. कुछ मिनट के लिए हीटिंग पैड पर ऑक्सीजन के तहत पिल्ला सजीव और दूर मां से यह डाल, पिंजरे के लिए यह वापसी. मां पिल्ला प्राप्त करता है और कूड़े के बाकी के साथ reunites सुनिश्चित करें. Electroporation के बाद, अगले कदम से पहले 4-7 दिनों के लिए अपनी मां के साथ पिल्ले छोड़ दें.

2. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति की तैयारी

2.1. समाधान और उपकरण की तैयारी

  1. निम्नलिखित समाधान (यह विदारक और इमेजिंग के लिए उच्च ग्लूकोज DMEM उपयोग करने के लिए भी संभव है आवश्यक हैं17):
    विच्छेदन मध्यम (500 मिलीलीटर)
    Gey बैलेंस्ड मीडिया - 500ml
    45% ग्लूकोज - 5ml
    मूवी मध्यम (10 मिलीलीटर)
    45% ग्लूकोज - 0.110 मिलीग्राम
    HEPES 1 एम - 0.100 मिलीग्राम
    पेन / Strep - 0.100 मिलीग्राम
    एफसीएस - 0.500 मिलीग्राम
    B27 - 0.100 मिलीग्राम
    Glutamine - 0.200 मिलीग्राम
    Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (फिनोल लाल मुक्त) - 8.89 मिलीग्राम
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म फिल्म मध्यम
  3. जगह Millicell 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में फिल्म मध्यम और जगह के 1 मिलीलीटर युक्त एक 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति डिश में सम्मिलित करता है.
  4. Vibratome सामान (पेचकश, चैम्बर, रेज़र ब्लेड, गोंद) तैयार करें.
  5. कैंची, छोटा सा रंग, सीधे संदंश: विच्छेदन उपकरण तैयार.
  6. स्लाइस से निपटने के लिए उपकरण तैयार: छोटे तूलिका या नरम inoculating पाश (आकार: 10 μl), प्लास्टिक पाश्चर pipettes, एक आइस बॉक्स और कई 6 सेमी प्लास्टिक के बर्तन.
  7. विच्छेदन मध्यम Precool2-4 डिग्री सेल्सियस पर

2.2. मस्तिष्क स्लाइसें की तैयारी

  1. Precooled विच्छेदन माध्यम के साथ एक 6 सेमी पकवान भरें और (ताजा कटौती स्लाइस रखने के लिए) बर्फ पर जगह है.
  2. ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, माउस पिल्ला सिर काटना करने के लिए कैंची का उपयोग करें. , एक छुरी के साथ खोपड़ी निकालें सेरिबैलम के लिए ओबी से मध्य बाण के समान सीवन के साथ खोपड़ी में कटौती और धीरे संदंश का उपयोग कपाल फ्लैप हटा दें. पूरे मस्तिष्क संपर्क में है सुनिश्चित करें और ध्यान से ऊतक नुकसान नहीं विशेष ख्याल रख रही है, एक रंग का उपयोग कर इसे काटना. विच्छेदन ध्यान से किया जा सकता है, लेकिन एक ही समय में बहुत जल्दी (यदि संभव हो तो एक मिनट से भी कम). दवाओं / गैस anesthetics के साथ टर्मिनल संज्ञाहरण neuroblasts और पशु बलि निम्नलिखित अपेक्षाकृत जल्दी से imaged किया जा करने की जरूरत है जो मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों का स्वस्थ राज्य के प्रवासी गुणों को प्रभावित कर सकते हैं क्योंकि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हमारे पसंदीदा तरीका है.
  3. एक सूबेदार राज के साथ मस्तिष्क Hemisectया ब्लेड (चित्रा 2). Uninjected गोलार्द्ध त्यागें या अन्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं.
  4. Vibratome धारक पर टेप का एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस और यह की चोटी पर मस्तिष्क गोलार्द्ध (चित्रा 2) संलग्न करने के लिए गोंद की न्यूनतम आवश्यक राशि का उपयोग करें. इस वजह से दोहराया गोंद आवेदन करने के लिए धारक सतह के हानिकारक रोकता है.
  5. गोंद कुछ सेकंड के लिए सूखी.
  6. Precooled विच्छेदन समाधान के साथ भरा vibratome ट्रे में धारक रखें. ब्लेड की ओर घ्राण बल्ब (चित्रा 2) बिंदु.
  7. उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग कर मस्तिष्क गोलार्द्ध काटने शुरू. निम्नलिखित मानकों सिफारिश कर रहे हैं: टुकड़ा मोटाई 300 माइक्रोन, गति ~ 3-5, आवृत्ति ~ 9. उच्च आवृत्ति और कम गति टुकड़ा के नुकसान को रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  8. एक छोटे तूलिका या एक नरम inoculating पाश का उपयोग कर स्लाइस लीजिए. केवल दिखाई ओबी (आमतौर पर 2-3 स्लाइस / मस्तिष्क) के साथ स्लाइस रख. आमतौर पर, आरएमएस की सबसे युक्त टुकड़ा can नीचे की सतह से ~ 300 माइक्रोन पर पाया जा.
  9. (दोनों पक्षों पर प्रतिदीप्ति की जांच करने के लिए उन पर फ्लिप करने के लिए सुनिश्चित करते हुए) GFP संकेत के लिए एक मानक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे स्लाइस की जाँच करें, और आरएमएस की सबसे साथ उज्ज्वल प्रतिदीप्ति दिखा लोगों का चयन.

2.3. संवर्धन मस्तिष्क स्लाइसें

  1. एक सेल संस्कृति हुड में, मस्तिष्क टुकड़ा के सबसे दुम तीसरी दूर कटौती और ठीक सीधे चिमटी या एक microdissection स्केलपेल का उपयोग कर किसी भी गोंद निशान हटा दें.
  2. नाजुक एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग टुकड़ा महाप्राण (एक बड़ा खोलने बनाने के लिए पिपेट की नोक में कटौती, यह टुकड़ा हानिकारक से बचने जाएगा) और डालने एक prewarmed Millicell के केंद्र पर जगह है.
  3. प्रतिभाशाली फ्लोरोसेंट संकेत के साथ कंधे Millicell (एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए) डालने के साथ संपर्क में रखा गया है सुनिश्चित करें.
  4. एक विंदुक के साथ डालने के शीर्ष पर अतिरिक्त विच्छेदन समाधान निकालें.
  5. करने के लिए टुकड़ा संस्कृतियों छोड़ दोइमेजिंग से पहले कम से कम के लिए 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में बसा.

3. Neuroblast प्रवास के समय चूक इमेजिंग

  1. कम से कम 2 घंटे पहले इमेजिंग, निरंतर पर सेट हमामात्सू C10600-10B (ORCA-r2) डिजिटल कैमरा सीसीडी ठंडा Perkin एल्मर UltraViewVoX confocal कताई डिस्क सिस्टम, उल्टे Nikon तिवारी ई माइक्रोस्कोप, और हीटिंग सिस्टम (सोलेंट वैज्ञानिक) पर बारी 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान
  2. Volocity सॉफ्टवेयर अधिग्रहण मॉड्यूल खोलें और "अर्थात" बटन पर क्लिक करें और इमेजिंग के लिए लेजर (ओं) का चयन करें.
  3. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के 2 घंटे के भीतर, खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग कक्ष में मस्तिष्क टुकड़ा युक्त गिलास नीचे पकवान.
  4. Imaged किया जाएगा कि टुकड़ा के क्षेत्र (जैसे सिर्फ इंजेक्शन साइट के बाद आरएमएस की पहली घटते हिस्से, या ELBO चयन और ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत एक Nikon CFI सुपर योजना Fluor ELWD 20X/0.45 उद्देश्य का प्रयोग करेंआरएमएस के क्षेत्र डब्ल्यू, या बस neuroblasts ओबी में प्रवेश से पहले कोहनी के बाद).
  5. निम्नलिखित कार्यों के साथ समय चूक इमेजिंग स्थापनाः
    1. माइक्रोस्कोप पर, नमूना के लेजर स्कैनिंग अनुमति देने के लिए L100 बटन पर क्लिक करें.
    2. Volocity में, उपयुक्त लेजर (GFP के लिए जैसे 488 एनएम लेजर) का चयन करके UltraView लेजर परिवर्तक खुला.
    3. फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता के आधार पर जोखिम समय (आमतौर के बीच 100-500 मिसे) और लेजर तीव्रता (आमतौर पर 20-30%) सेट करें.
    4. सेल दृश्य में सुधार करने के लिए छवि डिजिटल लाभ को समायोजित.
    5. मस्तिष्क टुकड़ा अंदर छवि को z ढेर अंतराल (आमतौर पर एक 100-120 माइक्रोन अंतराल) का चयन करें. (यह बाद में ट्रैकिंग विश्लेषण की सुविधा होगी) जितना संभव overlaps संभव से बचने के लिए अलग कक्षों का एक उपयुक्त संख्या के साथ एक अंतराल चुनें.
    6. प्रत्येक z ढेर छवि (आमतौर पर 2-4 सुक्ष्ममापी) के बीच के अंतर का चयन करें.
    7. समय INT चुनेंप्रत्येक z ढेर कब्जा (जैसे 3 मिनट) और कुल इमेजिंग अवधि (जैसे 3 घंटा) के बीच ERVAL.
    8. इमेजिंग मापदंडों में परिवर्तन को बचाने के लिए "सहेजें" आइकन पर क्लिक करें.
    9. इमेजिंग शुरू करने के लिए रिकॉर्डिंग बटन दबाएं.
  6. नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने की वैकल्पिक इमेजिंग एक ही दिन भर में (उदाहरण के वाहन / दवा उपचार या अलग electroporated plasmids के लिए).

4. Neuroblast माइग्रेशन का विश्लेषण करना

  1. Volocity Quantitation मॉड्यूल में एक समय चूक प्रयोग पूरा करने के बाद बनाया वांछित पुस्तकालय खुला. ऊपर छोड़ दिया बॉक्स (चित्रा -4 ए, चरण 1) से "विस्तारित फोकस" का चयन करें.
  2. (चित्रा -4 ए, चरण 2) मापन विंडो प्रदर्शित करने के लिए "माप" टैब पर क्लिक करें.
  3. कार्यों की सूची स्क्रीन के नीचे बाएँ में दिखाई दे रहा है. खींचें "ट्रैक" ("विविध" के अंतर्गत वर्तमान के तल पर शीर्षकऊपर अंतरिक्ष पर सूची). इस स्क्रीन के ऊपरी बाएँ अनुभाग में "ट्रैक" नामक एक नई विंडो के खुलने (चित्रा -4 ए, चरण 3) का संकेत होगा.
  4. ट्रैक खिड़की में "इनपुट" टैब (चित्रा -4 ए, चरण 4) से "अंक" का चयन करें.
  5. प्वाइंट उपकरण पर (चित्रा -4 ए, चरण 5) पर क्लिक करें.
  6. सेल शरीर के मध्य क्षेत्र पर माउस से क्लिक करके पलायन Neuroblast ट्रैकिंग शुरू और समय चूक के अंतिम समय बिंदु तक सेल आंदोलन ट्रैकिंग रखने पर पहुंच गया है (3 घंटा लंबी फिल्म के लिए उदाहरण के बिंदु संख्या 61 के लिए) .
  7. डेटा का चयन प्राप्त करने के लिए माप मेनू (चित्रा 4 बी, 6-7 कदम) से "मापन आइटम बनाने". एक विंडो स्क्रीन के केंद्र पर दिखाई देगा.
  8. इस विंडो में, "नामक एक नई माप आइटम:" का चयन करें और (चित्रा 4C, चरण 8) कोई नाम लिखें. जनसंपर्क से पहले "सभी timepoints" विकल्प का चयन करने के लिए याद रखेंEssing ठीक (चित्रा 4C, चरण 9). एक माप मद फ़ाइल समय व्यतीत फ़ाइल के तहत दिखाई देगा और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मानकों (जैसे प्रवास दूरी, वेग, विस्थापन, और विस्थापन की दर) में शामिल होंगे.
  9. एक खिड़की (चित्रा 4D, चरण 10) के रूप में इसे खोलने के लिए माप मद फाइल पर डबल क्लिक करें.
  10. विश्लेषण कोशिकाओं के एकल पटरियों कल्पना "प्रदर्शन" विकल्प (चित्रा 4D, चरण 11) से "ट्रैक प्वाइंट" चुनें.
  11. सही मापन मद फाइल पर क्लिक करें और फिर माइग्रेशन पैरामीटर का विश्लेषण करने के लिए Excel जैसे कार्यक्रमों में आयात किया जा सकता है, जो एक पाठ फ़ाइल के रूप में यह निर्यात.
  12. फिल्माने की अवधि के दौरान प्रत्येक कोशिका द्वारा किए गए मापन मद फाइल में "प्रदर्शन" विकल्प "प्वाइंट" या "आबादी" से चयन और (हर ट्रैक एक अद्वितीय पहचान है) आईडी पर क्लिक करें लगातार फ्रेम और pauses के बीच आंदोलनों उपाय. आगे बढ़ने से परिणामी फ़ाइल निर्यातकदम 4.10 के रूप में समझाया आईएनजी.

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Representative Results

SVZ व्युत्पन्न प्रवासी neuroblasts के लेबल आमतौर पर 4-8 दिनों एक सफल electroporation (चित्रा 1 बी) के बाद, आरएमएस के साथ मनाया जा सकता है. लंबे समय के अंक भी चुना जा सकता है, लेकिन उनमें से ज्यादातर ओबी में प्रवेश किया है के बाद से कम कोशिकाओं आरएमएस में मिल जाएगा. Neuroblasts लगभग 2-3 सप्ताह electroporation के बाद () नहीं दिखाया ओबी में परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं की ठेठ आकारिकी और सुविधाओं को प्राप्त करने लगते हैं. ~ 1 घंटे के लिए संवर्धन के बाद, electroporated माउस पिल्ले से मस्तिष्क स्लाइसें मज़बूती से अप करने के लिए 3-4 घंटे के लिए imaged किया जा सकता है. पहले 23,26 बताया, neuroblasts मात्रात्मक ट्रैकिंग सेल (चित्रा 4) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा सकता है, जो (चित्रा 3 और वीडियो 1) जटिल प्रवास गतिशीलता प्रदर्शित कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. Postna ताल में vivo electroporation. (ए) एक प्रसव के बाद दिन 2 माउस पिल्ला के vivo electroporation की योजनाबद्ध ड्राइंग. Craniometrical मील का पत्थर लैम्ब्डा आंख जोड़ने एक बिंदीदार रेखा (लाल) केशिका प्रविष्टि के लिए एक स्थितीय मार्कर के रूप में कार्य करता है. इंजेक्शन बिंदु एक हरे रंग की बिंदी के रूप में संकेत दिया है. Boutin एट अल में वर्णित के रूप में ग्रे अंडाकार आकार इलेक्ट्रोड स्थिति से संकेत मिलता है. 15 (बी) के बाण के समान माउस अग्रमस्तिष्क टुकड़ा 5 दिनों एक GFP-व्यक्त प्लाज्मिड के electroporation के बाद GFP के लिए immunostained. SVZ व्युत्पन्न पलायन neuroblasts आरएमएस के साथ दिखाई दे रहे हैं और उनमें से कुछ ओबी तक पहुँचने के लिए शुरू कर दिया है. CTX: प्रांतस्था, SVZ: subventricular क्षेत्र, आरएमएस: विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा, ओबी: घ्राण बल्ब. बार, 400 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. इमेजिंग के लिए तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी में योजनाबद्ध कदम. (ए) दुम और intrahemispheric कटौती (बिंदीदार रेखा) एक हौसले से विच्छेदित मस्तिष्क पर प्रदर्शन कर रहे हैं. (बी) electroporated मस्तिष्क गोलार्द्ध एक vibratome धारक पर रखा गया है. (सी) बाण के समान स्लाइस एक vibratome साथ प्राप्त की है और एक मानक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे मनाया जाता है सर्वश्रेष्ठ GFP संकेत के साथ. (डी) स्लाइस एक गिलास नीचे पकवान अंदर डालें, और (ई) बाद में डिस्क सिस्टम कताई एक औंधा confocal इमेजिंग के लिए एक पर्यावरण कक्ष में रखा एक Millicell पर कम से कम 1 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं. यहां क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए .

les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "चौड़ाई =" 500px "/>
चित्रा 3. Neuroblasts पलायन के समय चूक इमेजिंग. (ए) 5 दिनों एक GFP-व्यक्त प्लाज्मिड के electroporation के बाद एक माउस बाण के समान मस्तिष्क टुकड़ा से लिया neuroblasts की कताई डिस्क समय चूक छवियों. छवियाँ अलावा 1 घंटा हैं. प्रत्येक पैनल 4 मीटर के अलावा 28 लगातार छवियों का एक z ढेर प्रक्षेपण है. तीर (सही नीचे कोने में चित्र के बाहर स्थित) घ्राण बल्ब की ओर आरएमएस साथ पलायन 4 प्रतिनिधि neuroblasts संकेत मिलता है. (बी) 4 neuroblasts के समय चूक इमेजिंग से प्राप्त प्रतिनिधि प्रवासी पथ (ए) में प्रकाश डाला. (सी) ग्राफ़ 2 प्रतिनिधि neuroblasts से समय के साथ चले दूरी दिखा. कोशिकाओं एक ठेठ नाटकीय गतिशील व्यवहार प्रदर्शित करते हैं. बार, 70 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 4. Neuroblasts पलायन की ट्रैकिंग विश्लेषण. Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पलायन neuroblasts ट्रैक किया अनुक्रमिक चरणों. विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

वीडियो: 1. पलायन neuroblasts के समय चूक इमेजिंग फिल्म एक GFP-व्यक्त प्लाज्मिड के electroporation के बाद 5 दिनों प्राप्त GFP लेबल पलायन neuroblasts साथ माउस आरएमएस के एक वर्ग को दर्शाता है. ओबी सही नीचे कोने की ओर देखने के बाहर स्थित है. Confocal Z-ढेर एक 20x उद्देश्य एक 120 मीटर के अंतराल पर 3 घंटे के लिए हर 3 मिनट के साथ एक कताई डिस्क confocal पर कब्जा कर लिया गया. 10 फ्रेम / सेक: गति बजाना.

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Discussion

आरएमएस साथ तंत्रिका progenitors के कुशल प्रवास कार्यात्मक न्यूरॉन्स 10 में उनके बाद परिपक्वता सुनिश्चित करता है. ओबी की ओर निर्देशित तंत्रिका progenitors की प्रमुख नदियों मानव प्रारंभिक अवस्था में दिखाई दे रहे हैं और जल्दी प्रसव के बाद मानव मस्तिष्क के विकास में 27 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं. इसके अलावा, इन कोशिकाओं की चोट और neurodegeneration 4,28 से प्रभावित मस्तिष्क की साइटों को लक्षित कर रहे हैं. वास्तविक समय में Neuroblast गतिशीलता पर जीन में गड़बड़ी के प्रभाव की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते पूरी तरह से Neuroblast आंदोलन निर्देशित और नियंत्रित किया जाता है कैसे समझने के लिए आवश्यक हो जाता है.

यहाँ हम तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों का समय चूक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी के साथ vivo में प्रसव के बाद electroporation युग्मन द्वारा SVZ व्युत्पन्न Neuroblast प्रवास पर नजर रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. विशेष रूप से, हम तंत्रिका progenitors पलायन SVZ में एक प्लाज्मिड पूर्वी नौसेना कमान electroporating द्वारा लेबल किया जा सकता है कि कैसे पता चला हैGFP oding. अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है, plasmids के कई प्रकार के (जैसे अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एक साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जंगली प्रकार / ब्याज, Cre recombinase, या shRNA के उत्परिवर्ती प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति की अनुमति) का उपयोग किया जा सकता है. हम दृढ़ता से vivo में अभिव्यक्ति के लिए चिकन बीटा actin सीएजी प्रमोटर 29 युक्त plasmids का उपयोग करना चाहिये. Electroporated पशुओं से प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस की इमेजिंग भी electroporation 30 के बाद लंबे समय के अंक (7-10 दिन) पर ओबी में तंत्रिका progenitors के रेडियल प्रवास पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अभ्यास का एक प्रारंभिक अवधि के बाद, vivo में प्रसव के बाद electroporation के समय चूक इमेजिंग और immunofluorescence विश्लेषण दोनों के लिए मजबूत Neuroblast लेबलिंग की अनुमति, एक बहुत ही विश्वसनीय तरीका बन जाता है. इसके अलावा, इस तकनीक, Neuroblast विशिष्ट प्रमोटरों के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों पर एक मौलिक लाभ प्रदान करता हैneuroblasts के बहुमत चिह्नित कर रहे हैं, जहां. दरअसल, electroporation इस तरह उनकी आकारिकी और प्रवास की गतिशीलता का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति, neuroblasts के विरल लेबलिंग की अनुमति देता है. वायरल वैक्टर 31 की स्तेरेओतक्तिक प्रसव की तुलना में, इस तकनीक का तेज, सस्ता है और बहुत अच्छी तरह से माउस पिल्ले द्वारा सहन किया है. मुख्य दोष यह जल्दी प्रसव के बाद चरणों तक सीमित है कि वास्तव में होते हैं. हम वायरल प्रसव के तरीके 31 अधिक उपयुक्त होने पर बाद में समय पर लेबलिंग दक्षता में पर्याप्त कमी मनाया, क्योंकि वास्तव में, हम दृढ़ता से, प्रसव के बाद दिन 2 माउस पिल्ले का उपयोग करना चाहिये. हालांकि, उचित माउस आनुवंशिक मॉडल में रचनात्मक व्यक्त plasmids के electroporation तरह रणनीतियों वयस्क neurogenesis में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 22 चरणों.

दो photon, मानक confocal, कताई डिस्क confocal, और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सभी Neuroblast प्रवास 17,23,24 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्पिनिंग डिस्क चोरफोकल माइक्रोस्कोपी दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए एक सस्ता विकल्प है. यह मानक confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में photobleaching और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग 31-33 तुलना में एक उच्च संकल्प की पेशकश सीमित, कई Z विमानों के माध्यम से उच्च गति पर 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है. पलायन neuroblasts के बहुमत एक स्पष्ट रूप से दिखाई सोमा और एक विकास शंकु के साथ इत्तला दे दी एक अत्यधिक गतिशील अग्रणी प्रक्रिया है.

दूसरों के 17 से वर्णित है, एक छिड़काव चैम्बर होने सीधे ही मस्तिष्क टुकड़ा पर नियंत्रण और दवा उपचार के प्रभाव का आकलन करने की अनुमति होगी. हम यह एक महत्वपूर्ण लाभ पर विचार करते हैं, यहां वर्णित प्रोटोकॉल यह ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) या उच्च ग्लूकोज DMEM 17,33 साथ स्लाइस छिड़कना को सेल व्यवहार्यता के लिए बिल्कुल जरूरी नहीं है कि पता चलता है. इसके अलावा, एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग पानी विसर्जन उद्देश्यों से लैस ईमानदार सूक्ष्मदर्शी की तुलना में आसान उद्देश्य हेरफेर की अनुमति देता है.हम एक 20X लंबी दूरी उद्देश्य का उपयोग कोशिकाओं की एक अच्छी संख्या (टुकड़ा प्रति आमतौर पर 25-40) की ट्रैकिंग सक्षम और अच्छे संकल्प छवियों (वीडियो 1) के उत्पादन, एक इष्टतम समझौता है कि पाया. स्वचालित ट्रैकिंग हालांकि यह हमेशा विश्वसनीय नहीं है, यह भी संभव है. इस कारण से हम दृश्य और, यदि आवश्यक हो तो, स्वचालित ट्रैकिंग डेटा का मार्गदर्शन सत्यापन की सलाह देते हैं. एकल neuroblasts के उच्च बढ़ाई इमेजिंग एक Nikon Fluor डीआईसी M/N2 40X/0.80W उद्देश्य का उपयोग किया जा सकता है. MTrackJ भी बुनियादी ट्रैक आँकड़े 33 मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आसानी से उपलब्ध ImageJ प्लगइन, लेकिन कुछ कच्चे डेटा अधिग्रहण फ़ाइलें इस सॉफ्टवेयर के साथ असंगत हो सकता है और कुछ मामलों में समय लेने वाली हो सकती है, जो विश्लेषण के लिए उपयुक्त स्वरूपों में परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है . Volocity सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की छवि अधिग्रहण और विश्लेषण मॉड्यूल के संयोजन की अनुमति देता प्रवासी पैरामो की मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए छवि पर कब्जा / एजेंसी से एक तत्काल संक्रमणतत्काल रेखांकन की एक किस्म में देखे जा सकते हैं जो मंत्रियों (गति, विस्थापन, आदि), (प्रवासी पैटर्न / दूरी / दिशात्मकता / गति / हठ / समय दिखा आदि जैसे, स्थिर खर्च).

Neuroblasts स्थिर चरणों 34,35 (चित्रा -3 सी) के लिए प्रवासी बारी, एक नाटकीय आंदोलन प्रदर्शित करते हैं. स्थिर चरणों 4-10 मिनट 32 के बीच हो सकता है कि इस तथ्य के प्रकाश में, हम छवियों हर 3 मिनट पर कब्जा न्यूनतम रोशनी और photodamage साथ neuroblasts पलायन का पालन करने के लिए एक अच्छा समझौता प्रतिनिधित्व करता है. हम शायद ही कभी एक 3 घंटा अवधि के दौरान, वे आम तौर पर 30 मिनट निश्चल के एक औसत खर्च करते हैं, कोशिकाओं को अधिक से अधिक 6 मिनट के लिए रोक देखते हैं, और हैं. पिछली रिपोर्टों के अनुसार, neuroblasts हमारी टिप्पणियों के साथ समझौते में है, जो थोड़ा 0.6 23,36 ऊपर, 60-100 माइक्रोन / घंटा की औसत गति से और एक औसत चकरा सूचकांक (माइग्रेट दूरी पर वास्तविक विस्थापन) है. Typicसहयोगी, कोशिकाओं के बारे में 60% एक "प्रवासी" व्यवहार दिखाने (जैसे 0.6-1 के बीच एक घुमावदार सूचकांक के साथ, लगभग रैखिक प्रवास पथ के बाद) और 20-25% (0-0.4 के बीच एक घुमावदार सूचकांक के साथ) "खोजपूर्ण कर रहे हैं" शेष ~ 20% (0.4-0.6 के बीच एक घुमावदार सूचकांक के साथ, प्रवासी और खोजपूर्ण चरणों बारी) "मध्यवर्ती" के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है.

हम उनकी गतिशीलता में काफी परिवर्तन देख बिना अधिक से अधिक 3-4 घंटे के लिए neuroblasts फिल्म नहीं कर सकते हैं क्योंकि हम इस तकनीक के लिए सीमाओं कि वहाँ अभी भी पहचानते हैं. फिल्माने अवधि इमेजिंग आवृत्ति (हालांकि इस स्थानांतरण विश्लेषण की सटीकता को प्रभावित करेगा) के साथ ही इमेजिंग के लिए पर्यावरण की स्थिति का अनुकूलन करने के लिए एक छिड़काव चैम्बर अपनाकर कम करके बढ़ाया जा सकता है. हालांकि, प्रोटोकॉल एक 3-4 घंटा इमेजिंग अवधि की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा के संग्रह को सक्षम करने के लिए एक उपयुक्त समझौता का प्रतिनिधित्व सहित यहाँ वर्णितमाइग्रेशन. दरअसल, अब तक हम उचित नियंत्रण (Sonego और झोउ, अप्रकाशित परिणाम) के साथ तुलना के बाद प्रोटीन overexpression / डाउनरेगुलेशन 37 से या औषधीय हेरफेर से माइग्रेशन पर उत्पादित प्रभाव का पता लगाने में कामयाब रहे हैं.

अंत में, मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की कताई डिस्क इमेजिंग के साथ vivo में प्रसव के बाद electroporation के संयोजन गहराई में नियंत्रित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए संभावना की पेशकश, बारीकी से vivo में पर्यावरण जैसी एक प्रणाली में Neuroblast प्रवास की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है गतिशीलता Neuroblast.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एमएस और YZ KCl और KCL चीन पीएचडी द्वारा समर्थित हैं. एमओ एक जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम electroporation पर मूल्यवान सलाह के लिए Masaru Okabe और जून इची मियाज़ाकी PCX-EGFP प्लाज्मिड के लिए और एलेन Chedotal और एथेना Ypsilanti धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 81 समय चूक इमेजिंग सेल प्रवास assays electroporation न्यूरोजेनेसिस Neuroblast प्रवास तंत्रिका स्टेम सेल subventricular क्षेत्र (SVZ) विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा (आरएमएस) नवजात माउस पिल्ले electroporation समय चूक इमेजिंग मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति सेल ट्रैकिंग
माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के <em>विवो</em> प्रसव के बाद electroporation <em>में</em> और समय चूक इमेजिंग
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Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

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