Summary
הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.
Abstract
אזור subventricular (SVZ) הוא אחת מהנישות העצביות העיקריות במוח לאחר הלידה. כאן, אבות עצביים להתרבות ולהצמיח neuroblasts מסוגל לנוע לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB). נדידה למרחקים ארוכים זו נדרשת להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד בOB, אבל המנגנונים המולקולריים המסדירים את התהליך הזה עדיין אינם ברורים. חוקר את מסלולי איתות שליטה תנועתיות neuroblast יכול לא רק לעזור להבין צעד מהותי בנוירוגנזה, אבל יש גם פוטנציאל התחדשות טיפולי, בהתחשב ביכולת של neuroblasts אלה כדי למקד לאתרים במוח מושפעים מפציעה, שבץ מוחי או ניוון.
בכתב היד הזה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לin vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות ההדמיה הבאה של הגירת neuroblast בRMS העכבר. electroporation אחרי הלידה יכול ביעילות transfect אב SVZתאים, אשר בתורו ליצור neuroblasts נודד לאורך RMS. באמצעות confocal ספינינג מיקרוסקופיה זמן לשגות דיסק בתרבויות פרוסה מוח חריפים, הגירת neuroblast ניתן לנטר בסביבה הדומה למצב in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, תנועתיות neuroblast יכולות להיות במעקב וכמותית מנותחת. כדוגמא, אנו מתארים כיצד להשתמש בvivo electroporation לאחר הלידה של פלסמיד-GFP-לבטא לתייג ולדמיין neuroblasts נודד לאורך RMS. גם electroporation של פלסמידים-להביע recombinase shRNA או CRE בעכברים בנוקאאוט מותנים העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד הגנים של עניין. מניפולציה תרופתית של תרבויות פרוסה מוח חריפות ניתן לבצע כדי לחקור את התפקיד של מולקולות איתות שונות בהגירה neuroblast. על ידי צימוד ב electroporation vivo עם הזמן לשגות הדמיה, אנו מקווים להבין את המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוחment של גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.
Introduction
במוח של היונקים, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאחר לידה בעיקר בשני אזורים, אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular ברכס משוננת של ההיפוקמפוס 1. ראיות רבות שנאספו בשנים האחרונות תומכת בתפקיד קריטי לנוירוגנזה לאחר לידה בתפקודי זיכרון הנורה בהיפוקמפוס וחוש ריח 1-3. חשוב לציין, נוירוגנזה לאחר הלידה גם בעל פוטנציאל טיפולי בגלל מערכת היחסים שלה עם הפרעות נוירולוגיות ניווניות, ואת היכולת של neuroblasts להגר לאתרים פגועים במוח 4-6.
אזור subventricular (SVZ) התפתחה לאחרונה כנישת נוירוגנית מכרעת. neuroblasts נגזרת SVZ נודדות לכיוון הנורה חוש הריח (OB) דרך הזרם מקורי נודד (RMS), מה שהופך את זה לתהליך ההגירה הארוך ביותר ב1,7,8 המוח לאחר הלידה. / RMS / מערכת OB היונקים SVZ הפכהמודל שימושי ללמוד צעדים שונים בנוירוגנזה, כגון התפשטות, הגירה ו1,8 בידול. גורמי גדילה רבים ורמזים תאיים להסדיר נוירוגנזה SVZ והגירה לאורך RMS, אבל המנגנונים המולקולריים תאיים רחוקים מלהיות באופן מלא הבינו 1,9. הגירה נכונה לאורך RMS היא קריטית להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד 10. בנוסף, חלק מהמחקרים הראו כי neuroblasts נגזרת SVZ יכולה להעביר מתוך RMS לאתרי פגיעה מוחית 4-6,11-13. לכן, חוקר את נדידת neuroblast ויסות מנגנוני איתות הוא יסוד לא רק להבין נוירוגנזה אלא גם ליישומים טיפוליים פוטנציאליים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתייג אבות עצביים SVZ ידי in vivo electroporation לאחר הלידה ולעקוב אחר הנדידה שלהם לאורך RMS בתרבויות פרוס מוח חריפות באמצעות microsco confocal הדיסק מסתובב זמן לשגותpy. Electroporation נעשה שימוש נרחב במחקרים התפתחותיים מעובריים לשלבים בוגרים 14-18. זהו כלים רבי עוצמה כדי לכוון ולתפעל אבות עצביים SVZ ומהווה חלופה זולה יותר והרבה יותר מהר להזרקת stereotactic של וקטורים או דור ויראלי של מודלים מהונדסים 1,15,19,20. זהו הליך פשוט יחסית, שאינו זקוק לניתוח ויש לו שיעורי הישרדות גבוהים. Electroporation של shRNA או פלסמידים-להביע recombinase CRE במודלים גנטיים עכבר העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד גנים של עניין או להשיג תיוג קבוע של אבות SVZ, ובכך מייצג את כלי שימושי ללימודי neurogenesis למבוגרים 21,22.
הגירת neuroblast RMS הדמיה במוח השלמה היא עדיין מאתגרת בשל מגבלות טכניות הנוכחיות. עם זאת, ניתן לנטר את התהליך הזה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות ספינינג confocal דיסק של פרוסות מוח חריפות, המספקות syst מתאיםשלהם דומים מאוד מצב in vivo גם נתונים למניפולציה תרופתית 23,24. הצימוד ב electroporation vivo לאחר הלידה עם הזמן לשגות הדמיה יקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוח גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה.
1. אחרי הלידה Electroporation
1.1. הכנת זכוכית נימים, ה-DNA הפתרון וelectroporator
- הכן את הנימים משכו זכוכית (OD: 1.5 מ"מ, מק"ט: 0.86 מ"מ) להזרקת ה-DNA. (הגדרות אינדיקטיביים לחולץ נימי סאטר P-97 הן: חום 283; משכו 50; Velocity 90; זמן 50). להטביע את חותמו על הנימים המקביל להיקף של כ 2 μl.
- הגדר את המתח של electroporator ל5 פולסים מרובעים, 50 msec / דופק ב100 V, עם 850 מרווחים אלפיות שניים (100V, דופק על 50 אלפיות שני, דופק OFF 850 אלפיות שני, דופק 5).
- לדלל טוהר גבוה (OD 260/280> 1.80) פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי לריכוז סופי של 1-2 מיקרוגרם / μlעם רעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA או PBS. מומלץ להוסיף 0.1% ירוקים מהירה לפתרון ה-DNA (הצבע צריך להתפשט בחדר כאשר הוא מוזרק בהצלחה).
- הכן את האלקטרודות מ"מ 5-7, ג'ל האלקטרודה ולחמם את כרית החימום.
1.2. Electroporation
- הסר את גור עכבר לאחר לידה יום 2 מכלוב ולהרדים אותו על ידי שאיפת isoflurane (בזרימה ~ 0.6 L / min).
- לאחר כ 1 דקות, לקבוע את המצב של הרדמה באמצעות תגובת דחק רגל. אם אין תנועה מתרחשת, להמשיך בהזרקה תוך חדרי.
- טען מחט נימים עם 1-2 μl של ה-DNA באמצעות צינור aspirator מחובר לנימים.
- תחת מקור אור קר, להחזיק את הראש של הגור בין אגודל ואצבע מורה של היד פחות הדומיננטית שלך. מעט למשוך את העור בחזרה על הראש כדי לעזור לזיהוי של נקודת ההזרקה הנכונה.
- קחו למשל קו וירטואלי בין העין ולאהוא craniometric מבדה ציון הדרך (איור 1 א). הכנס את מחט נימים כבשליש מאורכו של קו זה ממבדה (כ 1 מ"מ מנקודת אמצע הקו) 15. הכנס את הנימים על 2 מ"מ עמוק, והקפד להימנע מחדירה עמוקה במוח.
- הזרק פלסמיד על ידי נשיפה לאט דרך פה (יכול לשמש גם מזרק מחובר לנימים). במהלך הליך זה, וודא שאצבעותיך אינן הפעלת לחץ רב מדי על המוח, כמו זה יכול למנוע הזרקת פלסמיד מוצלחת.
- תפסיק הזרקה כאשר כמות מינימאלית של פתרון ה-DNA נשארה בנימים. מומלץ להזריק פחות מ 1 μl כדי למנוע עלייה מזיקה בלחץ תוך גולגולתי.
- מעיל שני אלקטרודות עם הג'ל ומניחים אותם בצד החיובי בצד הלטרלי של האונה שבו את ה-DNA שהוזרקה (איור 1 א). לשילוב ה-DNA לתוך SVZ מקורי, אלקטרודות מקום מקורי מעטנקודת הזרקה. משתנה עמדת האלקטרודה יכול להשיג סגוליות אזורית של electroporation באזורים שונים של SVZ 22,25.
- ליזום העברה שוטפת על ידי לחיצה על דוושת footswitch הדופק. כאשר electroporation יושלם, לבדוק את המתח בתצוגת electroporator (ערכי מתח לא צריכים להיות מתחת 90 V, שכן ערכי מתח נמוך לתאם עם יעילות electroporation עני).
- להחיות מחדש את הגור תחת חמצן בכרית חימום לכמה דקות ולהחזיר אותו לכלוב, להניח אותו מאמו. ודא האם מאחזרת את הגור ומתאחדת זה עם שאר האשפה. לאחר electroporation, להשאיר גורים עם אמם ל4-7 ימים לפני השלב הבא.
2. הכנת תרבויות חריפות המוח פרוס
2.1. הכנה של פתרונות וכלים
- הפתרונות הבאים נדרשים (אפשר גם להשתמש DMEM גבוה של גלוקוז ללנתח והדמיה17):
נתיחה בינונית (500 מיליליטר)
התקשורת מאוזנת של הגיי - 500ml
גלוקוז 45% - 5 מ"ל
סרט בינוני (10 מיליליטר)
גלוקוז 45% - 0.110 מיליליטר
1 HEPES M - 0.100 מיליליטר
פן / סטרפטוקוקוס - 0.100 מיליליטר
FCS - 0.500 מיליליטר
B27 - 0.100 מיליליטר
גלוטמין - 0.200 מיליליטר
נשר בינוני Dulbecco שונה (אדום ללא פנול) - 8.89 מיליליטר - להתחמם בינוני סרט ב 37 ° C.
- הנח Millicell מוסיף למנת תרבות תחתית כוס 35 מ"מ המכילה 1 מיליליטר של מדיום קולנוע ומקום בחממה humidified על 37 ° C / 5% CO 2.
- הכן vibratome אביזרים (מברג, קאמרי, סכיני גילוח, דבק).
- הכן את הכלים לנתיחה: מספריים, מרית קטנה, מלקחיים ישרים.
- הכן את הכלים לטיפול בפרוסות: מכחול קטן או inoculating לולאה רכה (גודל: 10 μl), טפטפות פסטר מפלסטיק, תיבת קרח וכמה צלחות פלסטיק 6 סנטימטר.
- Precool המדיום לנתיחהב2-4 ° C.
2.2. הכנת פרוסות המוח
- למלא צלחת 6 סנטימטר עם מדיום לנתיחה precooled ולמקם אותו על קרח (כדי לשמור על פרוסות טריות חתוך).
- בעקבות נקע בצוואר הרחם, להשתמש במספריים כדי לערוף את גור העכבר. הסר את הקרקפת עם אזמל, לחתוך את הגולגולת לאורך תפר אמצע sagittal מOB למוח הקטן ולהסיר בעדינות את דשי הגולגולת באמצעות מלקחיים. ודא שכל המוח חשוף ובזהירות לנתח אותו בעזרת מרית, מטפלת מיוחדת שלא לפגוע ברקמות. הנתיחה צריכה להיעשות בזהירות, אבל באותו הזמן מהר מאוד (פחות מדקה במידת האפשר). נקע בצוואר הרחם הוא השיטה המועדפת שלנו בגלל הרדמה מסוף עם הרדמה סמים / גז יכולה להשפיע על מאפייני הנדידה של neuroblasts והמצב בריא של התרבויות הפרוסה המוח, אשר צריכה להיות צילמו במהירות יחסית לאחר הקרבת בעלי החיים.
- Hemisect המוח עם רזאו להב (איור 2). השלך חצי כדור uninjected או להשתמש בניסויים אחרים.
- מניחים חתיכה קטנה של סרט על בעל vibratome ולהשתמש בכמות המינימלית הכרחית של דבק לצרף את האונה במוח על גבי זה (איור 2). זה מונע פגיעה של פני השטח בעל בשל יישומי דבק חוזרים ונשנים.
- תן לדבק להתייבש במשך כמה שניות.
- הנח בעל במגש vibratome מלא פתרון לנתיחה precooled. כוון את הנורה חוש הריח לכיוון הלהב (איור 2).
- בגין חיתוך האונה המוח באמצעות הגדרות מתאימות. הפרמטרים הבאים מומלצים: עובי פרוס 300 מיקרומטר; מהירות ~ 3-5; תדירות ~ 9. תדר גבוה ומהירות נמוכה מומלצים כדי למנוע נזק לפרוסה.
- לאסוף פרוסות באמצעות מכחול קטן או inoculating לולאה רכה. לשמור רק פרוסות עם OB הגלוי (בדרך כלל 2-3 פרוסות / מוח). בדרך כלל, ca הפרוסה המכילה את רוב RMSn ניתן למצוא ב ~ 300 מיקרומטר מהמשטח התחתון.
- בדקו פרוסות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי עבור אות ה-GFP (לוודא כדי להעיף אותם כדי לבדוק את הקרינה משני הצדדים), ולבחור את אלה המראים הקרינה בהירה לאורך רוב RMS.
2.3. פרוסות מוח Culturing
- במכסת מנוע בתרבית תאים, לחתוך את הזנב השלישי ביותר של פרוסת המוח ולהסיר כל עקבות דבק באמצעות פינצטה ישר קנס או אזמל microdissection.
- בעדינות לשאוב פרוסה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את הקצה של פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר, זה לא לגרום הניזק לפרוסה) ולמקם אותו במרכזו של Millicell prewarmed להוסיף.
- ודא שהצד עם אות הניאון הבהירה ממוקם במגע עם Millicell להכניס (להדמיה עם מיקרוסקופ הפוך).
- הסר פתרון לנתיחה עודף על גבי להכניס את עם טפטפת.
- השאר תרבויות פרוסה ללהתיישב בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות במשך שעה לפחות 1 לפני ההדמיה.
3. זמן לשגות הדמיה של הגירת neuroblast
- לפחות 2 שעות לפני ההדמיה, להפעיל את מערכת פרקין אלמר UltraViewVoX ספינינג confocal הדיסק, מיקרוסקופ ניקון Ti-E ההפוך, האמאמטסו C10600-10B (ORCA-R2) מקוררת מצלמת CCD דיגיטלית, ומערכת חימום (Solent המדעית) נקבעה על הקבוע טמפרטורה של 37 ° C.
- פתח את המודול רכישת תוכנת Volocity ולחץ על כפתור "דהינו" ובחר את הלייזר (ים) להדמיה.
- תוך 2 שעות של הכנת פרוסה מוח, למקם את צלחת תחתית זכוכית המכילה פרוסת המוח בחדר ההדמיה על הבמה מיקרוסקופ.
- השתמש אובייקטיבי Nikon CFI Super תכנית פלואוריד ELWD 20X/0.45 תחת אור הניאון המתאים כדי לבחור ולהתמקד באזור של הפרוסה שיהיה צילם (למשל חלק יורד הראשון של RMS רק לאחר הזריקה, או אלבוw האזור של RMS, או רק אחרי המרפק לפני neuroblasts להיכנס OB).
- הגדר את הזמן לשגות הדמיה עם הפעולות הבאות:
- במיקרוסקופ, לחץ על כפתור L100 כדי לאפשר סריקת לייזר של המדגם.
- בVolocity, פתח UltraView לייזר מחלף על ידי בחירה בלייזר המתאים (למשל לייזר ננומטר 488 לGFP).
- קבע את זמן החשיפה (בדרך כלל בין 100-500 האלפיות שני) ואת עוצמת הלייזר (בדרך כלל 20-30%) בהתאם לעוצמת אות הניאון.
- התאם את הרווח דיגיטלי תמונה כדי לשפר את ההדמיה נייד.
- בחר את מרווח Z-מחסנית לתמונה בתוך פרוסת המוח (בדרך כלל מעל 100-120 מרווח מיקרומטר). בחר מרווח עם מספר מתאים של תאים מבודדים, כדי למנוע אפשרי חופף ככל האפשר (זה יקל על ניתוח מעקב לאחר מכן).
- בחר את המרווח בין כל תמונת Z-מחסנית (בדרך כלל 2-4 מיקרומטר).
- בחר int הזמןerval בין כל לכידת Z-מחסנית (למשל 3 דקות) ומשך ההדמיה הכולל (לדוגמא 3 שעות).
- לחץ על האייקון של "השמור" כדי לשמור את השינויים בפרמטרי ההדמיה.
- לחץ על לחצן ההקלטה כדי להתחיל הדמיה.
- הדמיה חלופית של דגימות בקרה וניסוי (למשל רכב / טיפול תרופתי או פלסמידים שונים electroporated) לאורך כל אותו היום.
4. ניתוח הגירת neuroblast
- במודול Volocity Quantitation, פתח את הספרייה הרצויה שנוצרה לאחר שסיים את ניסוי הזמן לשגות. בחר "פוקוס מורחב" מהתיבה השמאלית העליונה (איור 4 א, שלב 1).
- לחץ על הלשונית "מדידות" כדי להציג את חלון המדידה (איור 4 א, שלב 2).
- רשימת המשימות גלויה בפינה השמאלית התחתונה של המסך. גרור "מסלול" (הווה תחת "שונים" כותרת בתחתיתהרשימה) על השטח הנ"ל. פעולה זו תנחה את הפתיחה של חלון חדש בשם "מסלול" בחלקו השמאלי העליון של המסך (איור 4 א, שלב 3).
- בחר "נקודות" מכרטיסיית "הקלט" בחלון המסלול (איור 4 א, שלב 4).
- לחץ על כלי הנקודות (איור 4 א, שלב 5).
- להתחיל מעקב neuroblast נודד על ידי לחיצה עם העכבר על האזור של גוף התא המרכזי ולשמור על מעקב אחר תנועת התא עד לנקודת הזמן האחרונה של הזמן לשגות הוא הגיע (לדוגמה מספר נקודה 61 לסרט באורך שעות 3) .
- כדי לקבל נתונים לבחור "הפוך פריט מדידה" מתפריט המדידות (איור 4 ב ', על השלבים 6-7). חלון יופיע במרכז המסך.
- בחלון זה, בחר "פריט חדש מדידה הנקרא:" והקלד שם (איור 4C, שלב 8). זכור לבחור באפשרות "כל הנקודות הזמן" לפני יחסי הציבורEssing על אישור (איור 4C, שלב 9). קובץ פריט מדידה יופיע תחת קובץ הזמן לשגות ויכיל פרמטרים לניתוח כמוני (לדוגמא מרחק הגירה, מהירות, עקירה, ושיעור תזוזה).
- לחץ לחיצה כפולה על קובץ פריט מדידה כדי לפתוח אותו כמו חלון (איור 4D, צעד 10).
- כדי להמחיש את שירים, אחד של תאים נותחו, לבחור "נקודת מעקב" מהאפשרויות "התצוגה" (איור 4D, צעד 11).
- לחץ לחיצה ימנית על קובץ פריט המדידה ולייצא אותו כקובץ טקסט, אשר לאחר מכן ניתן לייבא בתוכניות כמו Excel לניתוח פרמטרים הגירה.
- כדי למדוד תנועות בין מסגרות רצופות והפסקות שנעשו על ידי כל תא בתקופת הצילומים, בקובץ פריט המדידה בחרו מבין האפשרויות "התצוגה" "נקודה" או "אוכלוסיות" ולחצו על זיהוי (לכל מסלול זיהוי ייחודי). לייצא את הקובץ שנוצר על ידי להמשיךing כמוסבר בשלב 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיוג של neuroblasts נודד נגזר SVZ ניתן לצפות יחד RMS, בדרך כלל 4-8 ימים לאחר electroporation מוצלח (איור 1). יכולות להיות גם שנבחרו נקודות זמן ארוכות יותר, אך פחות תאים יימצאו בRMS מאחר שרובם יהיה נכנסו OB. Neuroblasts להתחיל לרכוש מורפולוגיה ותכונות אופייניות של תאי גרגיר בוגרים בOB סביב 2-3 שבועות לאחר electroporation (לא מוצגת). לאחר culturing ל~ 1 שעות, פרוסות מוח מגורי עכבר electroporated ניתן הדמיה באופן אמין לתקופה של עד 3-4 שעות. כפי שדווח בעבר 23,26, neuroblasts יכולה להציג דינמיקת הגירה מורכבת (איור 3 ו 1 וידאו), אשר יכול להיות כמותית נותחה באמצעות תא מעקב (איור 4).
איור 1. Postna vivo electroporation טל ב. () ציור סכמטי של electroporation vivo של גור עכבר לאחר לידה יום 2. קו מקווקו (אדום) המחבר את העין למבדה ציון craniometrical משמש כסמן positional להכנסה נימים. נקודת ההזרקה מצויינים כנקודה ירוקה. צורות סגלגלות אפורים מצביעות על עמדת אלקטרודה כפי שמתוארת בBoutin et al. 15 פרוסת מוח קדמי (B) sagittal עכבר immunostained עבור ה-GFP 5 ימים לאחר electroporation של פלסמיד-GFP-לבטא. נגזרת SVZ neuroblasts הנודדת גלויות לאורך RMS וכמה מהם החלו להגיע OB. CTX: קליפת המוח; SVZ: אזור subventricular; RMS: זרם מקורי נודד; OB: הנורה חוש הריח. בר, 400 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" "/> 500px
איור 2. צעדי סכמטי בהכנת תרבויות פרוסה מוח חריפים להדמיה. () הזנב וקיצוצי intrahemispheric (קווים מקווקווים) מתבצעים במוח טרי גזור. (ב ') בחצי הכדור מוח electroporated מושם על בעל vibratome. (C) פרוסות sagittal מתקבלות עם vibratome ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי Slices. (ד ') עם אות ה-GFP הטובה ביותר הם בתרבית למשך שעה לפחות 1 בMillicell להכניס בתוך צלחת זכוכית תחתונה, ו( ה') הונח לאחר מכן בחדר סביבתי להדמיה על ידי confocal הפוך ספינינג דיסק מערכת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
"Width =" les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "/> 500px
איור 3. זמן לשגות הדמיה של נודדות neuroblasts. (א) זמן לשגות תמונות ספינינג דיסק של neuroblasts נלקח מפרוסת מוח sagittal עכבר 5 ימים לאחר electroporation של פלסמיד-GFP-לבטא. תמונות הן 1 שעות זה מזה. כל פנל הוא השלכה Z-מחסנית של 28 תמונות רצופות לגזרים 4 מיקרומטר. ראשי חץ עולה 4 neuroblasts נציג נודדת לאורך RMS לכיוון הנורה חוש הריח (נמצאת מחוץ לתמונה בפינה ימנית התחתונה). (ב) נתיבי נדידת נציג המתקבלים מהזמן לשגות הדמיה של 4 neuroblasts מודגשים (). (C) תרשים המראה את המרחק היגר עם זמן על ידי 2 neuroblasts נציג. תאים להציג התנהגות ניעתי קופצנית טיפוסית. בר, 70 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
er.within-page = "תמיד"> 
איור 4. מעקב וניתוח של נודדות neuroblasts. צעדי סדרתית משמשים למעקב neuroblasts נודד באמצעות תוכנת Volocity. אנא ראה טקסט עבור תיאור מפורט. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
וידאו 1:. זמן לשגות הדמיה של neuroblasts הנודד הסרט מראה קטע של RMS העכבר עם neuroblasts נודד-GFP שכותרתו השיגה 5 ימים לאחר electroporation של פלסמיד-GFP-לבטא. OB נמצא מחוץ לתצוגה לכיוון הפינה ימנית התחתונה. Z-ערימות confocal נתפסו על confocal דיסק מסתובב עם מטרת 20X כל 3 דקות במשך 3 שעות על מרווח מיקרומטר 120. משחק מהיר: 10 מסגרות / sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגירה יעילה של אבות עצביים לאורך RMS מבטיחה ההתבגרות הבאה שלהם לתוך הנוירונים פונקציונליים 10. בולטים זרמים של אבות עצביים מכוונים OB גלויים בינקות אדם ועשויים לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות המוח האנושי לאחר לידה המוקדמת 27. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים למקד לאתרים של המוח המושפע מפציעה ו4,28 ניוון מוחיים. היכולת לפקח בזמן אמת האפקט של מניפולציה גנטית על דינמיקת neuroblast הופכת להיות חיונית כדי להבין איך תנועת neuroblast מונחה ומוסדרת.
כאן יש לנו תיארתי פרוטוקול כדי לפקח על הגירת neuroblast נגזרת SVZ ידי צימוד in vivo electroporation לאחר הלידה עם מיקרוסקופיה ספינינג confocal דיסק הזמן לשגות של תרבויות פרוסה מוח חריפים. באופן ספציפי, יש לנו הראינו כיצד נודדת אבות עצביים יכול להיות מתויג על ידי electroporating בSVZ ENC פלסמידoding ה-GFP. בהתאם לצורך של המחקר, ניתן להשתמש בם מספר סוגים של פלסמידים (לדוגמא המאפשרים ביטוי של חלבוני ניאון אחרים או שיתוף ביטוי של סוג בר / חלבוני מוטציה של עניין, recombinase CRE, או shRNA יחד עם חלבוני ניאון). אנו ממליצים בחום להשתמש בפלסמידים המכילים את אמרגן CAG אקטין בטא עוף 29 לביטוי בגוף החי. גם הדמיה של פרוסות מוח המתקבלות מבעלי החיים electroporated יכולה לשמש כדי לפקח על ההגירה הרדיאלי של אבות עצביים בOB בנקודות יותר זמן (7-10 ימים) לאחר electroporation 30.
לאחר תקופה ראשונית של תרגול, in vivo electroporation לאחר הלידה הופך לשיטה אמינה מאוד, המאפשרת תיוג neuroblast החזקה עבור שני הזמן לשגות הדמיה וניתוח immunofluorescence. יתר על כן, טכניקה זו מקנה יתרון מהותי על פני עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון מתחת ליזמי neuroblast הספציפית,שבו רוב של neuroblasts מסומנים. ואכן, electroporation מאפשר תיוג דליל של neuroblasts, ובכך מאפשר ניתוח מפורט של דינמיקת המורפולוגיה והגירה שלהם. בהשוואה למשלוח stereotactic של וקטורים ויראליים ביום 31, טכניקה זו היא זולה יותר, מהירה יותר ונסבלת היטב על ידי גורי עכבר. החסרון העיקרי מורכב בעובדה שהוא מוגבל לשלבי לידה מוקדמים. ואכן, אנו ממליצים בחום להשתמש ביום הלידה 2 גורי עכבר, שכן אנו נצפו ירידה משמעותית ביעילות תיוג בתקופות מאוחרות יותר, כאשר שיטות משלוח ויראלי להיות יותר מתאימות ביום 31. עם זאת, אסטרטגיות כמו electroporation של פלסמידים מבטא-CRE במודלים גנטיים עכבר מתאימים יכולות לשמש כדי לחקור נוירוגנזה במבוגר בשלבים 22.
שני פוטונים, confocal הסטנדרטי, confocal הדיסק מסתובב, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום יכולים לשמש כדי להמחיש הגירת neuroblast 17,23,24. קון דיסק ספינינגמיקרוסקופיה מוקד היא אלטרנטיבה זולה יותר לשני פוטונים במיקרוסקופ. זה מאפשר הדמיה 3D במהירות גבוהה יותר באמצעות מטוסי z מרובים, הגבלת photobleaching השוואה למיקרוסקופיה confocal סטנדרטית ומציע רזולוציה גבוהה יותר מאשר דימות פלואורסצנטי רחב בתחום 31-33. רוב neuroblasts נודד לי סומה נראית בבירור ותהליך מוביל דינמי מאוד שקצהו עם חרוט צמיחה.
כפי שתואר על ידי אחרים 17, בעל תא זלוף יאפשר להעריך באופן ישיר את ההשפעות של שליטה וטיפולים תרופתיים באותה פרוסת המוח. בזמן שאנחנו רואים את זה יתרון חשוב, הפרוטוקול המתואר כאן מראה שזה לא הכרחי לכדאיויות תא לינקב פרוסות בנוזל החומץ מלאכותי השדרתי (aCSF) או DMEM גלוקוז גבוהה 17,33. יתר על כן, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מאפשר מניפולציה מטרה קלה יותר בהשוואה למיקרוסקופים זקופים מצוידים במטרות טבילה במים.מצאנו כי באמצעות מטרה למרחקים ארוכים 20X הוא פשרה אופטימלית, המאפשר מעקב אחר מספר לא מבוטל של תאים (בדרך כלל 25-40 לכל פרוסה) והפקת תמונות ברזולוציה טובה (וידאו 1). מעקב אוטומטי הוא גם אפשרי, אבל זה לא תמיד אמין. מסיבה זו אנו ממליצים חזותיים ובמידת צורך, אימות ידנית של נתוני מעקב אוטומטיים. הדמיה בהגדלה גבוהה יותר של neuroblasts הבודד יכולה להתבצע באמצעות מטרת ניקון פלואוריד דסק"ש M/N2 40X/0.80W. תוסף ImageJ זמין באופן חופשי גם MTrackJ ניתן להשתמש כדי למדוד את הנתונים הסטטיסטיים מסלול בסיסי 33, עם זאת כמה קבצי נתונים רכישת גלם עשוי להיות בקנה אחד עם תוכנה זו, וייתכן שיהיה הצורך להמיר לפורמטים המתאימים לניתוח, שבמקרים מסוימים יכולים להיות זמן רב . השילוב של מודולים רכישת תמונה וניתוח הניתן על ידי תוכנת Volocity מאפשר מעבר מיידי מלכידת תמונה / עיבוד לניתוח כמותי של parame נודדters (מהירות, עקירה, וכו '), אשר ניתן דמיינו בקלות במגוון רחב של גרפים (למשל מראה דפוסי נדידה / מרחק / יווניות / מהירות / התמדה / משך זמן ללא תנועה, וכו').
Neuroblasts להציג תנועה קופצנית, לסירוגין נודדת לשלבים נייחים 34,35 (איור 3 ג). לאור העובדה ששלבים נייחים יכולים להיות בין 4-10 דקות 32, אנו מאמינים כי לכידת תמונות כל 3 דקות מייצגת פשרה טובה לעקוב נודדות neuroblasts עם תאורה וניזקים מינימליים. אנחנו כמעט ולא רואים תאים לעצור ליותר מ -6 דקות, ומצאנו כי, על פני תקופה של 3 שעות, שהם בדרך כלל מבלים בממוצע 30 נייחים דקות. על פי דיווחים קודמים, יש לי neuroblasts מהירות ממוצעת של 60-100 מיקרומטר / שעה ומדד ממוצע מתפתל (עקירה בפועל על פני המרחק היגר), מעט מעל 0.6 23,36, אשר בהסכם עם התצפיות שלנו. Typicברית, כ -60% מתאים מראים התנהגות "נודדת" (למשל בעקבות נתיבי נדידה כמעט ליניארי, עם מדד המתפתל בין 0.6-1) ו20-25% הם "גישוש" (עם מדד מתפתל בין 0-.4), בעוד שנותר ~ 20% יכולים להיות מסווגים כ "ביניים" (לסירוגין שלבי נדידה וגישוש, עם מדד המתפתל בין 0.4-0.6).
אנו מכירים בכך שעדיין יש מגבלות לטכניקה זו, שכן אנחנו לא יכולים לצלם neuroblasts ליותר מ 3-4 שעות בלי התבוננות שינויים משמעותיים בתנועתיות שלהם. משך צילומים יכול להיות מוגבר על ידי הפחתת תדירות הדמיה (עם זאת זה ישפיע על הדיוק של ניתוח ההגירה), כמו גם על ידי אימוץ תא זלוף כדי לייעל את התנאים סביבתיים להדמיה. עם זאת, הפרוטוקול מתואר כאן כולל תקופת 3-4 הדמיה hr מייצג פשרה מתאימה המאפשרת איסוף נתונים מספיקים לניתוח כמותי שלהגירה. ואכן, עד כה הצלחנו לזהות את תופעות המיוצרים על הגירה על ידי ביטוי יתר של חלבון / downregulation 37 או על ידי מניפולציה תרופתית לאחר השוואה עם פקדים מתאימים (Sonego וג'ואו, תוצאות לא פורסמו).
לסיכום, השילוב של electroporation לאחר הלידה in vivo עם הדמיה דיסק מסתובב של תרבויות פרוסה המוח מהווה כלי רב עוצמה למעקב אחר הדינמיקה של הגירת neuroblast במערכת הדומה לסביבת in vivo באופן הדוק, ומציע את האפשרות לחקור לעומק את המנגנונים המולקולריים שליטה neuroblast תנועתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
טרשת נפוצה וYZ נתמכים על ידי studentships PhD KCL וKCL-סין. MO מומן על ידי מלגת לימודי דוקטורט ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים מאסארו Okabe ויוני ichi מיאזאקי לפלסמיד PCX-EGFP ואלן Chedotal ויתנה Ypsilanti לייעוץ רב ערך על electroporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A.
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
