Summary
입체 흐름 챔버 장치는 소설
Abstract
혈류에서 세포를 순환의 혈관 외 유출은 줄기 세포 유도하고 종양의 전이 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에서 중심적인 역할을한다. 입체 흐름 챔버 장치 (이하 3D 장치) 생리적 전단 응력을 재현하고 세포의 혈관 외 유출 폭포의 각 단계는 정량화 할 수 있도록 생체 기술의 소설이다. 3D 장치는 관심의 세포가 전단 응력에 따라 순환하는 상부 격실 및 관심 chemoattractants를 포함하는 정적 우물의 낮은 구획으로 구성되어 있습니다. 두 개의 격실은 내피 세포 (EC)의 단층으로 코팅 된 다공성 삽입으로 구분됩니다. 관심 미세 환경 세포와 선택적인 두 번째 삽입은 EC 레이어 바로 아래에 배치 할 수 있습니다. 가스 교환 장치는 최적의 CO 2 장력이 유지 될 수 있도록하고 동안 세포 나 물질을 추가하거나 철회 할 수있는 액세스 지점을 제공합니다실험. 테스트 셀은 연동 펌프에 의해 통제 원하는 전단 응력 (유량)에서 상단 구획에 순환. 실험의 끝에, 순환 및 마이그레이션 세포는 추가 분석을 위해 수집됩니다. 3D 장치는 케모카인 그라디언트, 전단 응력에 저항, 클러스터 형성 및 세포 생존에 대한 응답으로 전단 응력, 윤회에서 EC에 접착력 압연 셀을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 선택적인 두 번째 삽입은 EC와 미세 환경 세포 사이의 크로스 토크의 영향을 조사 할 수 있습니다. 3D 디바이스의 번역 응용 프로그램은 약물 후보의 테스트를 포함하는 표적 세포의 이동 및 정맥 주사 후 세포의 생체 내 행동을 예측. 따라서, 새로운 3D 장치는 세포의 혈관 외 유출을 중재하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 다양하고 저렴한 도구입니다.
Introduction
세포의 혈관 외 유출이 순환 세포가 혈류를 종료하고 몸에있는 많은 생리적 반응의 중요한 구성 요소입니다하는 과정입니다. 이 과정은 예를 들어 같은 조직 재생을 위해 중요하다, 혈관 (또는 정맥 주사)에 조직으로부터 동원 치료 세포가 혈관을 통해 마이그레이션 부상이나 변성의 사이트에 순환을 종료 할 때. 혈관 외 유출은 또한 염증, 면역 거부,자가 면역, 종양 전이 등 많은 질병의 발병의 중요한 구성 요소입니다.
혈관 외 유출은 생리 흐름 조건 하에서 내피 세포와 세포 (EC)를 순환의 상호 작용을 포함하는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. 이 과정은 (a) 세포 롤링, EC의 내강 표면 (B) 기업 접착 및 EC에 걸쳐 (C) 윤회를 포함한다. 중요한 것은, 넘쳐 폭포의 각 단계는 C의 하위 집합에 의해 규제됩니다ELL 유형별 종 특정 분자. 그러나 특정 세포 부분 집합의 혈관 외 유출을 조절하는 상세한 분자 메커니즘이 잘 주로 인해 혈류 조건 요약표의 기술적 어려움을 이해하지 않습니다. 새로운 3D 장치는 이러한 기술적 과제를 극복하고 세포 이주의 생물학 우리의 이해를 향상시킬 수행 할 실험을 할 수 있도록 설계되었습니다 여기에 설명.
세포 이동을 중재 분자는 중요한 치료 표적이다. 특정 세포 유형의 이동을 제어하는 분자 이벤트에 대한 자세한 이해는 치료 프로모션 또는 혈관 외 유출의 억제에 대한 새로운 목표를 식별 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 부상 또는 변성의 사이트쪽으로 치료 줄기 세포의 마이 그 레이션을 (성인 신생아 또는에서 태아 조직에서 유래 여부) 강화 중재 조직 재생에 큰 유틸리티 것입니다.만능 소스에서 파생 된 세포를 포함한 치료 줄기 세포의 체외 발생과 생체 조작 성체 줄기 세포 (확장 유전자 조작, 각종 효소 전처리) 1에서 관심이 증가하고있다. 따라서, 그들은 치료 목적을 위해 사용되기 전에 줄기 세포의 품질을 평가하는 새로운 기술에 대한 필요가있다. 다른 매개 변수 사이에, 세포는 다발성 질환에 대한 치료는 줄기 세포 2의 정맥 주사가 필요할 수 있기 때문에 효율적으로 순환을 종료 할 수 있어야합니다. 사실, 줄기 세포 생물학의 현재 과제 중 하나는 매우 낮은 효율을 극복하기 위해 어떤 조직 손상 3-6의 사이트에 줄기 세포 가정, 줄기 세포 이주에 대한 우리의 이해이 차이를 해결해야 할 필요성을 강조와 함께. 반면, 전략 특정 유도 분자를 대상으로 블록 세포의 마이 그 레이션에서의 치료에 유용 할 것이라고flammatory 및자가 면역 질환뿐만 아니라 전이성 암과 같은. 따라서, 세포 이동 및 혈관 외 유출하는 동안 순환 세포와 EC 간의 상호 작용을 중재하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 번역 의학 및 신약 개발뿐만 아니라 기초 과학에 관련이 있습니다.
세포 이주의 다양한 측면을 연구 할 수있는 방법의 숫자가 현재 있습니다. 그러나 이러한 방법은 새로운 3D 장치와 함께 극복 할 수 단점이있다.
동물 모델 :
이러한 면역 생쥐와 유전자 조작 생쥐와 같은 동물 모델은 생체 내에서 인간 세포의 이동을 연구하는 유용한 도구왔다. 그러나 이러한 모델에 하나의 중요한 단점은 인간의 세포는 많은 세포 표면 분자 종 특정 순서의 차이로 인해 부분에 마우스 EC에 존재하는 접착 분자와 제대로 상호 작용하는 것입니다. 따라서, 설치류의 사용은 공부인간의 세포 이동은 진정한 인간의 기관 고유의 혈관 침대의 이벤트를 반영하지 않을 수 있습니다. 또한, 생체 모델에서 약물 후보의 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다. 유도 세포를 연구하여 생체 모델에서 기존는 어려운 소설 유도 분자를 식별하고 대상으로하고, 넘쳐 폭포의 여러 단계를 구별하지 않습니다. intravital 현미경 접근 방식은 이러한 요구를 해결하기 위해 개발 된 유익한되어 있지만,이 기술은 매우 시간과 7,8 노동 집약적이다.
정적 윤회 분석 :
트랜스 웰 또는 다공성 막에 걸쳐 보이든 챔버 분석 측정 셀 마이 그 레이션 널리 마이그레이션 연구에 사용됩니다. 분석은 세포의 케모카인 매개 마이그레이션 또한이 세포 운동성 및 세포 - 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용뿐만 아니라 연구하는 데 사용할 수있는 장점을 가지고 있지만,다공성 막에 성장 EC 단일 층에 걸쳐. 불행하게도, 정적 조건에서 표현형과 EC의 기능은 생리 흐름 9,10 미만은 크게 다릅니다. 따라서, 트랜스 웰의 분석에서 발생하는 화학 주성 이벤트 충실히 전단 응력 하에서 이주 세포와 EC 간의 상호 작용을 모방하지 않습니다. 또한 전체 프로세스에 대한 선택의 여분의 차원을 추가 원점 복귀 폭포의 "롤링"단계는 정적 트랜스 웰의 분석에서 발생하지 않습니다. 이 기술은 EC 단일 층에 걸쳐 케모카인-매개 세포 이동의 정량적 평가를 할 수 수행하는 동안 따라서, 그것은 생체 내에서 혈액의 흐름을 모방 전단 응력을 제공하기 위해 무능력에 의해 제한됩니다.
전단 응력 하에서 분석 :
벽 전단 응력은 EC 기능 9,10 조절에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. 전단력은 신호 폭포의 빠른 활성화, transc을 유도ription 요인 및 EC 11,12에서 차동 유전자 발현. 이 정보는 접착 분석의 다음 세대의 발전에 주도 - 평행 층류 챔버 및 모세 혈관 - 압연 공부하고 전단 응력 7,13의 조건 하에서 EC에 세포를 부착 할 수 있습니다. 이러한 분석에 대한 제한 요인은 그들이 단지 압연 및 접착 측정 할 수 있지만 윤회에 갈 것이다 자기편 세포와 EC의 단일 층의 "체포"되고 윤회하지 않을 자기편 세포를 구별하지 않습니다. 또한, 이러한 분석은 케모카인 그라디언트 방향으로 세포의 이동을 측정 할 수 있습니다.
몇몇 보고서는 흐름 (14)의 조건에서 유리 슬라이드에 성장 EC 단일 층 아래에 크롤 링 부착 세포의 기능을 설명했습니다. 이 크롤링 기술에 대한 제한은 다음을 포함한다 : 그것은 세포의 단지 제한된 수의 분석, 그것은 비 정량적이며 그것은 매트릭스 CEL에 크롤 링 세포를 분석L 표면 아니지만 화성 그라데이션 방향으로 이동하고, 그것은 transmigrated 세포를 분리 할 수 없습니다. 이 분석은 EC 단일 층에 전단 응력을 적용하는 장점을 가지고 있지만, 따라서, 그것은 케모카인 그라디언트 방향으로 세포의 이동을 정량화 할 수 없습니다.
여기에 설명 된 새로운 3D 기술은 정적 케모카인 그라데이션 (낮은 칸막이)와 전단력 (상단 구획)를 결합하여 이러한 단점을 많이 극복하고 넘쳐 폭포 (그림 1)의 각 단계의 양적 평가를 허용합니다. 이 장치는 EC와 미시 사이의 크로스 토크가 순환 세포의 혈관 외 유출을 지원하기 위해 EC의 기능에 영향을 미치는 방법을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 3D 흐름 챔버 장치를 사용하는 단계별 방법을 설명합니다.
Protocol
1. 콜라겐 코팅에 의해 세포 성장을위한 상위 및 하위 삽입을 준비
- 실험에 필요한 삽입의 수를 계산합니다. 별도의 멸균 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)의 각 인서트를 놓고 조사 (11 Gy의)에 의해 소독.
- 50 ㎍ / ㎖, 삽입 당 154 μL (면적 1.54 cm 2를 삽입) : 막 코팅 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
- 삽입 막 (피펫 팁이 표면을 만지지 못하게)의 표면에 다음 조심스럽게에 하나의 큰 방울을 형성 나누어지는의 나머지 부분을 추가 원 콜라겐 용액의 몇 방울 (드롭 당 ~ 20 μl를) 배치 막 표면. 콜라겐 솔루션은 반구형 유지하고 막 표면에서 배출되지 않는 것을 확인합니다.
- 뚜껑이있는 페트리 접시를 커버하고 평평한 표면에 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 콜라겐 솔루션을 기음 160 μL PBS로 덮고 한 번 막을 씻는다.
- Aspira의테 PBS 뚜껑을 교체합니다. 같은 날을 사용하는 경우, 실온에서 건조한 장소에 페트리 접시를 놓습니다. 그렇지 않으면, 4 ° C에서 접시를 배치하고 7 일 이내에 삽입을 사용합니다.
2. 어퍼 삽입에 문화 내피 세포
- 원하는 문화 매체 EC 현탁액을 준비합니다. 세포 생존은> 98 %인지 확인하고 즉시 사용합니다.
참고 : 인간 제대 정맥 EC (HUVEC), 4에 대해 삽입 당 160 μL에서 x 10 5 세포를 사용합니다.
- 섹션 1에서 제조 콜라겐 코팅 인서트 페트리 접시를 타고, 요리의 삽입물을 제거하지 마십시오. 콜라겐 코팅 막 (피펫 팁 터치에게 표면을시키지 않는다)의 표면에 원형의 세포 현탁액 (드롭 당 약 20 μL)을 여러 개의 작은 방울을 놓고 조심스럽게 형성하는 세포 현탁액의 나머지 부분을 추가 하나의 큰 방울. 세포 현탁액은 hemis 유지되도록 pherical 및 막 표면에서 배출되지 않습니다.
- 뚜껑을 교체하고 조심스럽게 세포 막에 부착 할 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에서 (동요없이) 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터와 부화에 접시를 놓습니다.
- 부드럽게 삽입 접시의 바닥에 남아 완전히 매체에 의해 덮여되도록 각 페트리 접시에 배지 5 ㎖를 추가합니다. 뚜껑을 교체하고 조심스럽게 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. 37 ° C 하룻밤 문화가 세포.
- EC 층을 포함하는 삽입 아래에 배치 될 지역 미시를 나타내는 세포와 두 번째 (옵션) 낮은 삽입을 준비하기 위해 동일한 방법을 사용합니다.
참고 : 낮은 삽입이 실험에 포함 된 경우, 상단과 하단 삽입이 처음 3D 장치 (그림 4B)에 삽입하기 전에 서로 연결되어있다.
E "> 3. 3D 흐름 챔버 장치 조립- , 상부와 하부 플레이트를 함께 나사 튜브를 사용하여 가스 교환 장치에 플레이트를 연결 깨끗한 비닐 봉투에 조립 장치를 배치하고 조사하여 가방 및 내용 (11 Gy의)를 소독.
- 70 % 에탄올로 소독 조직 문화 후드, 스프레이로 세포 배양 인큐베이터 장소에서 트레이 선반을 제거 닦아하고 큰 멸균 냅킨 트레이를 포함한다.
- 후드에 조사 된 비닐 봉투를 놓고 멸균 보육 트레이의 가방과 장소에서 장치를 제거합니다. 제공되는 튜브와 연동 펌프에 장치를 연결합니다. 0.2 ML / 분의 최적의 속도 프로그램 펌프.
주의 : 전기 소켓과 펌프를 연결하려면, 보육의 뒷면에있는 구멍을 통해 전기 코드를 돌출. 구멍이 기밀임을 보장하는 코드의 주위에 강도 플러그를 사용합니다.
4. 주요 3D 흐름 챔버 장치
- 튜브 (튜브의 불임을 유지하기 위해 작은 살균 냅킨을 사용)에서 금속 바늘을 잡아 당겨 콘센트에서 흡입 튜브를 분리합니다. "입구"와 "출구"로 튜브의 분리 엔드로 튜브에 연결된 금속 바늘을 사용합니다. 미디어 15 ML 튜브에 금속 바늘 입구를 배치, 빈 15 ML 튜브에 콘센트를 배치합니다.
- 흐름이 0.2 ML / 분에서 시계 반대 방향으로 유량 설정되도록 펌프를 켭니다. 그것은 장치 (그림 2, 정지 # 1)에 연결하기 전에 매체 즉시 튜브의 끝에 도달하면 튜브에 15 ML 입구 관에서 매체를 그리 펌프를 중지 부정적인 압력을 허용합니다.
- 나사를 풀고 장치의 상부와 하부 플레이트. 메디칼의 1,550 μL - 조심스럽게 상부 플레이트와 장소 1500을 제거낮은 우물에 (어느 매체 혼자 또는 실험 케모카인 플러스) 음. 낮은 접시 위에 2mm - 잘 약 1 도달 반구를 형성하기에 충분한 매체를 포함해야합니다.
- 어떤 기포가 삽입 아래에 갇혀 있지 않은지 확인하고, 페트리 접시에서 멸균 집게를 사용하여 하부 플레이트의 우물에 준비된 삽입을 전송합니다. 플레이트가 건조한 상태를 유지하는 것이 보장하는 하부 플레이트의 표면에 나타나는 매체를 대기음. 하부 플레이트에 다시 상부 플레이트를 놓고 나사를 사용하여 판을 다시 연결합니다.
- 바로 연동 펌프를 켜고 3D 장치를 통해 흐름에 매체를 할 수 있습니다. 장치의 출구 끝을 올리고 플레이트 사이의 공간에 거품의 형성을 방지하기 위해이 위치에 챔버를 유지합니다.
- 매체가 가스 교환 장치에 챔버를 연결하는 챔버와 튜브를 채울 수 있습니다. 매체가 가스 전자에 도달하기 전에 즉시 펌프를 정지체인지 장치 (그림 2, # 2 중지). 가스 교환 장치에 매체의 장소 3 ML은 펌프를 켜고 기포가 가스 교환 장치를 통해 탈출 할 수 있습니다. 출구 배관 (그림 2, 정지 # 3)이 끝나기 전에 3cm - 매체 2에 도달 할 때 매체가 가스 교환 장치를 종료 튜브를 채우고 펌프를 정지 할 수 있도록 가스 교환 장치를 올린다.
- 작은 멸균 냅킨을 사용하는 콘센트에 입구 금속 바늘을 연결합니다. 그들은 가스 교환 장치를 도달하면 중간 가스 교환 장치를 향해 반대 방향으로 흐름 (시계 방향)과는 어떤 기포가 제거되도록 수 있도록 펌프를 재 프로그램. 기포가 시스템에 남아 있는지 확인합니다.
- 매체가 반 시계 방향으로 흐름 수 있도록 펌프를 재 프로그램. 가스 교환 장치에 테스트 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다. 가스 교환 장치의 뚜껑을 닫고 인큐베이터에 작업을 시스템 후면에 트레이를 배치하고 시험 세포가 circulat 수원하는 시간 37 ° C에서 3D 장치 전자.
참고 : 70 % 에탄올로 펌프의 전기 코드를 청소하고 보육의 내부에 배치합니다.
5. 테스트 종료 및 분석을 위해 샘플을 수집
- 인큐베이터와 후드 곳에서 작업 시스템 트레이를 제거합니다. 펌프를 정지, 입구와 출구를 분리하고 빈 멸균 15 ML 튜브로 끝을 놓으십시오.
- 필요한 경우 사용까지 얼음에 장소 세포 현탁액을, 펌프의 전원을 켜고 시스템에서 세포 현탁액을 수집합니다.
- 나사를 제거하고 상판을 들어 올려 챔버를 분해한다. 하부 플레이트에서 삽입물을 제거하고 배양 접시로 전송.
참고 : 삽입은 시각화 (크리스탈 바이올렛 dH보다 2 O 0.05 %), 현장에서 세포를 계산하는 염색하거나 추가에 대한 EC를 수집하는 트립신 할 수 있습니다테스트.
- 중간 및 낮은 우물에서 세포를 튜브에 210 X g에서 5 분간 원심 분리를 제거합니다. , 상층 액을 제거 세척하고 원하는 세포를 resuspend을, 및 특정 실험 목표 (더 아래에 설명)에 따라 세포를 처리합니다.
Representative Results
쥐 골수 유래 EC 라인 STR-12 5 μm의 기공과 삽입에 성장했다. EC의 성장 속도는 현미경으로 관찰되었으며, EC는 100 % 합류있을 때, 삽입은 3D 장치의 하부 구획에 우물로 옮겨졌다. 즉시 삽입하기 전에, 아래 칸의 우물 혼자 배지 (대조군)이나 기질 세포 유래 인자 - 1 (, 5 NG / ML 50 NG / ML SDF-1) 보충 배지로 가득 차 있었다. 그 후, 3D 장치가 조립되고 프로토콜에 설명 된대로 챔버 배지로 채워졌다. 장치의 위쪽 칸에 유통되는 시험 세포는 갓 생쥐 골수 세포 (챔버 당 3.5 × 10 6 세포) 수확 하였다. 0.8 DYN / cm 2의 정의 전단 응력은 0.2 ML / 분에 연동 펌프 속도를 설정하여 적용 하였다. 전체 작업 시스템은 다음 37 ° C와 CE에서 5 % CO 2 배양기에 배치되었다LLS는 4 시간에 대한 EC의 단일 층과 순환과 상호 작용을 할 수 있었다. 그 시간의 끝에, 순환 세포는 챔버가 분해되고, 수집하였으며, 프로토콜에서 설명한대로 삽입은 제거되었습니다. transmigrated 세포는 새로운 배지에 현탁 세척 낮은 우물에서 수확하고 식민지 - 형성 세포 (CFC) 분석 (그림 3)에 대한 조혈 성장 인자로 보충 메틸 문화로 옮겨졌다. 예상대로, 우리는 CFC의 상당히 높은 숫자가 우물 만 5 NG / ML SDF-1 또는 매체를 포함하는 50 NG / ML SDF-1을 포함하는 우물 EC 단일 층에 걸쳐 마이그레이션되었다고하였습니다.
앞에서 설명한 바와 같이, 세포의 이동을 연구 할 수있는 생체 기술의 현재의 아무도 마이그레이션 세포의 혈관 외 유출을 지원하기 위해 EC의 능력에 지역 미시의 효과를 테스트 할 수 없습니다. 이것은 3D 장치와 함께 달성 할 수있는 방법을 설명하기 위해EC의 레이어와 골수 기질 세포의 층에 걸쳐 조혈 세포를 순환 조사 넘쳐. 이를 위해, 기질 세포의 층을 포함하는 두 번째 (하단) 삽입은 하부 플레이트 (그림 4)에서 EC의 단일 층을 포함하는 상위 인서트 나란히했다. 위에서 설명한 transmigrated 세포가 우물에서 수확 계산 된대로 실험은 다음을 수행 하였다. 결과는 EC 단층 아래의 기질 세포의 추가 계층의 삽입이 크게 SDF-1을 향한 조혈 세포 (그림 4)의 이동을 증가 것을 보여 주었다. 이 발견은 지역 미시는 조직에 세포를 순환 모집에 기여한다는 생각과 일치한다.
그림 2. 3D 장치 시스템의 개략도 표현. 그림은 시스템을 조립하는 데 필요한 세 정거장을 보여줍니다. 문화 매체는 연동 펌프에 의해 생성 된 음의 압력에 의해 입구에서에 그려집니다. 매체의 흐름은 삽입이 장치에 배치 될 수 있도록 중지 # 1에 의해 차단됩니다. 챔버가 닫힌 후, 펌프 SWIT입니다다시 CHED 및 챔버 바로 삽입에 성장 세포의 건조를 방지하기 위해 중간으로 가득합니다. 정지 중 2 위 가스 교환 장치에 배치 할 매체 수 있습니다. # 3 중지 흐름 입구와 출구의 연결을 중지 할 수 있습니다. 흐름은 펌프 스위치를 사용하여 가스 교환 장치를 통해 공기 방울을 제거하기 위해 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 방향을 지시 할 수 있습니다.
그림 3. 3D 장치는 생리적 전단 응력 조건에서 조혈 전구 세포의 SDF-1-매개 이주를 지원합니다. A : 세 가지 장치 (낮은 구획의 각 포함 3 우물) 조립 및 병렬로 실행되었다. 혼자 중간 또는 5 또는 50 NG / ML에서 SDF-1을 포함하는 매체는 낮은 컴 우물에 추가되었습니다. 쥐 보NE 골수 세포는 4 시간 동안 장치에서 순환 할 수 있었다. 그 후, 각 장치는 분해되었고, SDF-1 (노란색)쪽으로 transmigrated 한 세포는, 낮은 우물에서 수집 된 계산 및 조혈 성장 인자 (GF)로 보충 메틸 셀룰로오스에서 배양 하였다. 십사일 후, 식민지 현미경으로 득점했다 B :. 낮은 컴에서 복구 조상의 수 (식민지 - 형성 세포, CFC)는 평균 ± 조건에 세 우물 SD로 표시됩니다. * P <0.05.
그림 4. 조혈 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용에 미세 효과. A : 그림은 교양 성을 가진 초 다공성 멤브레인의 위치를 보여줍니다EC와 상부 막 아래 romal 섬유 아세포 (SF). . 다른 약어는 그림 1A B에 대해 설명합니다. 배양 SF는 상부 막 아래 삽입과 추가 멤브레인 (아래 삽입) C는 세 가지 장치 (각 포함 3 우물) 병렬로 실행되었습니다. 혼자 중간 또는 50 NG / ML SDF-1에서 SDF-1을 포함하는 매체는 낮은 컴 우물에 추가되었습니다. 부정적인 제어 챔버 SC, SDF-1, 또는 둘 모두를 생략. 골수 세포는 37 ℃에서 4 시간 동안 순환 할 수 있었다 그 후, 각 장치는 분해되고 transmigrated 세포는 낮은 컴 우물에서 수집하고 계산 하였다. 복구 transmigrated 세포의 수는 조건에 세 우물의 평균 ± SD로 표시됩니다. * P <0.05.
Discussion
3D 장치는 줄기 세포 생물학, 혈관 생물학, 혈액학, 종양학,자가 면역, 염증 등 다양한 분야의 연구를위한 유용한 기술이 될 수 있습니다. 3D 장치 연구팀은 줄기 세포 넘쳐 폭포의 각 단계를 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 조혈, 중간 엽, 신경 및 다른 줄기 세포를 연구하는 데 특히 유용합니다. 세포 이동을 공부 연구원은 또한 T-및 B-림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, NK 세포 및 다른 철새 세포의 서로 다른 철새 메커니즘을 조사하기 위해이 장치를 사용할 수 있습니다. 혈관 생물학, 장치는 세포의 채용을 지원하고 체외에서 혈액 - 뇌 장벽을 모방 EC의 능력에 지역 미시의 효과를 평가하기위한 유용합니다. 질병의 병인에 초점을 맞추고 연구원, 장치 유형 I 당뇨병, 미시간 중 췌장에 세포 독성 T 세포의 이동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다천식 환자, 호중구의 이동, 단핵구 및 질환의 다양한 치료 사이트를 상처 세포의 모집, neovasculature와 세포 독성 T 세포의 상호 작용 염증의 사이트에 림프구의 폐에 호산구의 gration 및 모집 종양으로 세포 독성 T 세포.
새로운 차원의 장치는 또한 번역 과학 및 임상 의약품 개발 및 심사를위한 유용한 도구가 될 것입니다. 예를 들어, 장치, 정맥 투여에 대한 치료 세포 현탁액의 준비를 최적화하기 위해 정상 조직 대 부상 조직에 치료 세포의 모집을 테스트하고, 특정 기관 또는에서 조직의 내피 세포와 미세 환경의 역할을 검토하는 데 사용할 수 있습니다 프로세스입니다. 약물 개발을 위해, 장치를 대상으로 종양 세포 약물 후보를 테스트 넘쳐 폭포의 각 단계를 차단하는 약물 전달로 마이그레이션 세포를 테스트하는 데 사용할 수종양의 사이트에 y를 차량, 인간의 기관 고유의 내피 세포 또는 지방 조직 특이 미시의 기능을 조절하고, 원점 복귀 폭포의 여러 단계를 조절하는 약물의 조합을 테스트하는 약물을 테스트합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시스템으로 변환 할 때, 장치는 표적 분자 세포 인신 매매를 중개하는 작은 분자, 펩티드, 항체를 선별 사용할 수 있습니다.
기술 정보 및 팁
흐름에 따라 롤링 접착 넘쳐 폭포에서 중요한 단계이며, 생체 내에서 세포 이동의 효율성에 크게 기여하고있다. 특히,이 단계는 체외에서 정적 분석에 영향을주지 않습니다. 그러나 정적 윤회의 분석은 선호도가 낮은 상호 작용 (롤링) 확고한 접착을 지원하기 위해 EC의 기능을 포함하여 세포의 생존과 기능에 전단 응력의 효과를 테스트 실험에서 음성 대조군으로 유용합니다.
3D 장치 실험 매체의 선택은 중요합니다. 미디어, 특히 긴 배양 시간 동안 순환 세포의 생존에 영향을 미칠 수있는 여러 성장 인자가 포함되어 있습니다. 또한, 칼슘의 농도는 +와 마그네슘 2 +, 생리 흐름 조건 하에서 접착제의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 상업 문화 매체에서 상당히 다릅니다. 3D 장치와 실험을 계획 할 때 고려해야 할 다른 기술적 인 세부 사항이 아래에 설명되어 있습니다.
EC 단층의 선택
EC의 세포 표면 서명은 실험 설계에서 고려되어야한다 종 기원과 세포 배양 조건의 조직 등 다양한 변수에 의해 영향을 받는다. 일반적으로 사용되는 EC 폐 유래 혈관 EC (LDMVEC), 뼈 EC (BMDEC), 뇌 파생 EC에게 (BDEC) 골수 유래, 그리고 HUVEC 있습니다.EC의 특성은 또한 그들의 기원에 따라 달라집니다. 예를 들어, 압연 및 접착에 대한 책임은 BMDEC 구조적으로 표현 셀렉틴과 VCAM-1, BDEC, LDMVEC 및 HUVEC은 정상적인 조건에서 이러한 분자를 표현하지 않는 반면. 따라서 BDEC, LDMVEC 및 HUVEC 코팅 삽입은 TNF α (10 NG / ML, 4 시간) 또는 염증을 모방 유도 분자의 발현을 유도 할 수있는 다른 요인 전처리 할 수 있습니다.
지역 미세과 크로스 토크 테스트
지역 미시는 EC의 기능을 조절하고 세포의 혈관 외 유출에 참여하는 방법을 이해 관심이 증가하고있다. 우리의 결과는 EC 단층 아래의 기질 세포의 단일 층의 삽입이 크게 세포를 순환의 혈관 외 유출을 증가한다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 EC와 기질 사이의 크로스 토크가 순환 세포의 혈관 외 유출을 지원하는 EC의 능력을 향상하는 방법을 보여줍니다. Moreo버전, 다른 미세 환경 (예를 들어, 중간 엽 줄기 세포, 폐 섬유 아 세포, 종양 세포, 성상 세포)의 세포의 삽입은 특정 혈관 침대를 모방하기 위해 도움을 줄 수 있습니다. 특히 두뇌 파생 EC와 성상 세포의 조합은 혈액 - 뇌 장벽을 모방하는 유용한 방법이 될 수 있습니다. 마찬가지로, 환자, 또는 체외에서 조작 정상 세포에서 얻은 세포는 특정 질병 미세을 모방 도울 수 있었다.
우리의 연구에서, 우리는 50 %의 합류로 성장 기질 세포와 낮은 삽입을 사용했다. 삽입에 미세 환경 세포의 최적 밀도는 연구의 목적에 따라 달라집니다 만, 이것은 쉽게 조작하고 제어 할 수 있습니다.
전단 응력 속도를 선택
이것은 폰 애드리안 등에 의해 증명 되었기 때문에 0.8 DYN / cm 2의 전단 응력은 여기에 사용되었다. 골수 microvasculatur에서 전단 응력 할 수조혈 전구 세포는 혈액 순환을 종료하고 정상적인 생리 조건 15에서 조직을 입력하고 전자. 반면, 전단 응력의 높은 수준은 세포의 혈관 외 유출이 제한되어 큰 혈관에서 관찰된다. 따라서, 높은 전단 응력의 비율은 다양한 세포 유형의 혈관 외 유출을 조사 실험을위한 추가 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
전단 응력 하에서 세포의 생존은 세포 종류와 생체 세포 치료 (곤 차로 바 등., 출판 관찰) 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다, 따라서주의 깊게 시험 중 평가되어야한다. 전단 응력의 다른 수준 (전단 응력 저항)에 세포의 감도가 0.8 DYN / cm 2 ~ 6 DYN / cm 2에서 점진적으로 전단 응력 속도를 높이기 위해 연동 펌프를 프로그래밍에 의해 평가 될 수있다. 이 시험 동안, 세포로 사용하여 세포 죽음을 모니터링하는 가스 교환 챔버에서 주기적으로 수집 할 수이러한 판 블루 배제, 아 넥신 V와 PI 염색 및 세포 사멸 마커 식으로 말한다.
실험은 실질에서 파생 된 생체 공학 세포 또는 세포의 전단 응력 저항을 테스트 할 수 있도록 설계하는 경우, 그러한 혈액을 매개로 세포와 같은 추가적인 긍정적 인 컨트롤, 실험에 포함하는 것이 좋습니다.
삽입 기공 크기 및 ECM 코팅의 선택
삽입은 몇몇 기공 크기 (3, 5, 8 μm의)와 함께 사용할 수 있습니다. 기공 크기의 선택은 순환 시험 세포의 크기와 특성에 따라 달라집니다, 이것은 또한 정적 트랜스 웰 분석의 경우입니다. 큰 기공 크기 (8 μm의)와 삽입은 이러한 상피 기원의 종양 세포와 같은 큰 세포의 혈관 외 유출을 테스트하는 것이 좋습니다. 백혈구 나 조혈 줄기 세포는 더 일반적으로 5 μm의 기공 인서트 테스트, 3 μm의 기공 삽입은 가장의의 혈관 외 유출을 테스트 용으로 예약되어 있습니다1MW보다 작은 PV 시스템 세포. 그러나 혼자 테스트 셀 크기가 유일한 중요한 요소가 아닙니다 우리는 여러 기공 크기와 삽입 테스트를 권장합니다.
우리의 초기 연구에서, 우리는 삽입에 대한 EC의 성장을 지원하고> 4 시간 동안 전단 응력에 견딜 수 있도록 자신의 능력에 대한 다양한 ECM을 테스트했습니다. ECM은 마트 리젤, 폴리 - D - 라이신, 피브로넥틴, 라미닌, 입력을 포함 시험 콜라겐, 하이드로 겔, 메타 각질 I, II, III, IV, 그리고 Extracel. EC 성장을위한 최상의 결과 Extracel, 피브로넥틴, 그리고 콜라겐 하였다. 그러나 우리 손에, 0.8 ㎍ / cm 2에서 Extracel 크게 막에 걸쳐 테스트 세포의 윤회를 감소시켰다. 그러므로 우리는 이제 삽입 코팅 피브로넥틴 (5 ㎍ / cm 2) 또는 콜라겐 (5 ㎍ / cm 2)를 사용합니다. 그러나 ECM의 최적 선택은 아마도 EC의 유형 및 테스트 셀의 transmigratory 속성을 모두에 의해 영향을받을 것입니다. 예비 실험 integri을 테스트하기 위해 수행해야EC의 단일 층의 타이가 선택한 ECM에 성장. 예를 들어, 배양 배지로 가득 배양 접시에있는 EC의 단일 층과 장소는 사전 코팅 인서트, 전단 응력 (낮은 설정)을 작성 쉐이커에 요리를 배치하고 37 품어 ° C와 5 % 12 시간 동안 CO 2. 전단 응력에 노출 된 후 EC의 무결성은 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 평가할 수 있습니다.
최적의 테스트 세포 농도의 선택
혈액 순환을 종료 테스트 세포의 기능은 각 세포 유형에 특정한 다양한 특성에 따라 달라집니다. 통계적으로 의미있는 결과를 생성하는 순환 세포 밀도는 세포의 충분한 수의 긍정적 인 제어 우물로 마이그레이션 할 수 있도록 최적화해야합니다. 그러므로, 우리는 시스템에로드 된 세포의 수 사이의 관계를 이해하기 위해 세포 밀도의 범위 (예를 들어 10 3 / ㎖ ~ 10 7 / ㎖)로 초기 테스트를 수행 좋습니다윤회를 겪는 세포의 수.
또한, 최적의 순환 농도는 서로 다른 소스에서 얻은 동일한 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, CD34 + 세포는 조혈 줄기 세포와 헌신적 인 혈통 특정 조상 모두를 포함하는 이기종 세포 인구입니다. 그들은 골수에서 얻을 수 있습니다, 말초 혈액을 동원하고, 탯줄 혈액. 이 세 가지 소스에서 파생 된 CD34 + 세포는 서로 다른 원점 및 engrafting 능력 16-18을 가지고, 그래서 3D 장치에서 이러한 세포를 테스트하기위한 조건은 본격적인 연구하기 전에 최적화해야한다.
최적의 세포 순환 시간의 선택
최적의 순환 시간은 각 세포 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 순환에 필요한 최소 시간은 정적 마이그레이션 분석의 결과에서 추정 할 수 있지만이 exten 확장 할 수 있습니다세포는 전단 응력에 노출 될 때 DED. 4 96 시간 사이의 순환 시간을 테스트 파일럿 연구를하는 것이 좋습니다.
가스 교환 장치
가스 교환 장치의 주요 목적은 표준 조직 문화 인큐베이터의 설정과 비슷한 3D 장치를 통해 순환 매체에서 CO 2의 최적 농도를 유지하는 것입니다. 가스 교환 장치는 테스트 전지와 화합물을 추가하고 테스트 중에 프로브와 샘플을 수집하기 위해 사용될 수 있습니다.
시험 세포 수의 평가
순환 세포는 가스 교환 장치를 통해 실험 기간 동안 다양한 시간에 샘플링 할 수 있습니다. 실험의 끝에 순환에 남아있는 세포를 콘센트에서 수집 할 수 있습니다. 3D 장치가 실험의 끝에서 분해 될 때, transmigrated 세포는 낮은 우물에서 수확와 f를 수집 할 수 있습니다또는 추가 분석. 입력 셀에 레이블이있는 경우, transmigrated 세포는 판 블루와 현미경 열거 라이브 / 죽은 세포를 염색 할 수 있습니다. 또한, 입력 셀은 3D 장치에 적재하기 전에 라이브 셀 이미징에 사용할 수있는 많은 "셀 추적"염료 중 하나가 표시 될 수있다,이 경우 수확은 세포의 형광 정량을위한 용해되어야한다 transmigrated.
최적 표본 크기의 선택
통계 분석을 허용하려면, 샘플 크기는 양면 t-검정을 사용하여 0.05의 유의 수준에서 테스트 두 그룹 사이의 평균 퍼센트 변경 가상의 차이를 감지하는 약 80 %의 전력을 제공 할 것 선택해야합니다. 골수 세포와 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 3D 장치 실험 실험 조건 당 세 개의 우물을 사용합니다. 그러나, 최적 표본 크기는 실험의 목적에 따라 달라질 수와 E 결정되어야한다mpirically. 다중 회귀 통계 테스트 양면 T-테스트 및 분산 분석은 결과의 통계적 관련성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
케모카인의 선택
모든 윤회 분석 등 화학 주성의 선택은 시험 세포의 특성과 연구의 목적에 의해 결정됩니다. SDF-1은 조혈 세포에 대한 잘 확립 화학 주성입니다. 우리 손에, 50 NG / ML SDF-1의 농도는 골수 유래 조혈 전구 세포의 혈관 외 유출을 자극하는 최적이었다. 우리는 또한 중간 엽 줄기 세포 19 chemoattractants으로 C3A와 bFGF를 사용합니다. 그러나, 우리는 본격적인 연구하기 전에 최적의 농도 범위를 식별하는 케모카인의 각 케모카인 및 교차 적정 조합을 적정 권장합니다. 특정 세포 유형의 화학 주성 인자의 조합이 도움이 될 수 있습니다. 특정 테스트 셀에 대한 케모카인은 사기꾼 알 수 없거나 사용할 수없는 경우자극 림프구, 섬유 아세포, 그리고 다른 세포 ditioned 미디어 chemoattractants의 소스로 사용할 수 있습니다.
판독 매개 변수의 선택
3D 장치의 다양성을 수행 할 수있는 윤회 실험의 종류를 확대하고, 실험의 성공은 판독 매개 변수의 사려 깊은 배려와 디자인에 따라 달라집니다. 일반적으로 세포는 상부 (순환) 구획에서 수집 낮은 정적 구획 세포 계수와 동시에 생존을 위해 테스트해야합니다. 일부 세포는 미세 혈관에서 관찰 된 생리적 전단 응력에 대한 낮은 내성을 가지고있다. 이 경우, 죽은 세포의 수는 위의 구획에 증가 될 것이다. EC의 레이어 (또는 트랩) 체포 자기편 세포의 수는 시험 세포에 의해 구체적으로 표현 마커의 면역 세포에 의해 평가 될 수있다. CD31과 vWF가 특정 항체를 사용할 수 있습니다EC를 감지하고 테스트 세포와 EC 사이의 차별을 허용 할 수 있습니다. 또한, EC 단층의 무결성은 각 테스트의 끝에서 모니터링해야한다.
수집 된 세포와 수행 분석의 유형은 연구자 '실험의 목표에 따라 달라집니다,하지만 마이크로 어레이 및 qPCR에, FACS 분석에 의해 표면 분자 발현, FACS와 서부 내듯 신호 전달 경로의 활성화, 그리고 요인에 의해 유전자 발현의 분석 변화를 포함 할 수 있습니다 ELISA에 의해 분비. 우리는 transmigrated 골수 세포가 조혈 전구 세포 (그림 3) 열거 할 교양있는 우리의 자신의 작품에 의해 입증으로 기능 테스트의 거대한 배열, 체외에서 수집 된 세포에 가능합니다. 수집 된 시료는 생체 분석에서의 다양한 테스트를 할 수 있습니다.
생체 내 시험 세포의 행동을 예측하는 데 도움이 하나의 중요한 매개 변수는 경향이있다전단 응력의 다른 비율에 따라 집합체를 형성하는 몇 가지 세포 ency을. 예를 들어, 3D 장치 집계 형성을 받아야 치료 세포는 정맥 주사를 수행 덩어리를 형성하고 생체 (곤 차로 바 등., 게시되지 않은 관찰)의 급성 혈관 폐색을 일으키는 원인이 더 큰 경향이 있습니다. 집계 형성은 3D 장치 실험 완료시 또는 이후에 테스트 세포를 채취하여 현미경으로 관찰 할 수 있습니다.
Disclosures
캐스케이드 LifeSciences는 주식 회사 "유동 조건 및 그 용도 법에 따라 시험 관내 세포의 이동에 평가하기위한 장치"특허 제 미국 7,927,867 B2에 대한 독점 권한을 보유하고 있습니다. SKK는 3D 흐름 챔버 장치 기술의 발명가 캐스케이드 LifeSciences는 주식 회사의 공동 설립자 과학 및 주주
Acknowledgments
우리는 CBS 과학 회사 주식 회사 (에서 척 스캇과 빅터 일행 감사 www.cbsscientific.com 엔지니어링 지원 및 3D 챔버, 가스 교환 장치, 삽입의 제조를 위해). 이 작품은 국립 보건원 (부여 R21DK067084 및 R43CA141782에 SKK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133) | Lonza | CC - 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER - CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 - 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 - 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 | |
References
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