A Novel Tredimensjonal Flow Chamber Device å studere Chemokine, rettet Ekstravasering Celler Sirkulerende under fysiologiske strømningsforhold

Summary

Den tredimensjonale strømningskammer enheten er en roman

Abstract

Bloduttredelse av sirkulerende celler fra blodet spiller en sentral rolle i mange fysiologiske og patofysiologiske prosesser, herunder stamcelleforskning homing og tumor metastasering. Den tredimensjonale strømningskammer enhet (heretter 3D-enhet) er en ny in vitro teknologi som gjenskaper fysiologisk skjærspenning og tillater hvert trinn av cellen ekstravasasjon kaskade som skal kvantifiseres. Den 3D Innretningen består av et øvre kammer hvor cellene av interesse sirkulere henhold skjærspenning, og en nedre avdeling av statiske brønner som inneholder chemoattractants av interesse. De to rommene er adskilt av porøse innsatser belagt med et monosjikt av endotelceller (EC). En valgfri andre innlegg med microenvironmental celler av interesse kan plasseres rett under EF-lag. En gassutveksling som muliggjør optimal CO ₂ spenning skal opprettholdes og gir et tilgangspunkt for å legge til eller trekke tilbake celler eller forbindelser i løpet aveksperiment. Testcellene sirkulere i det øvre kammer om ønsket skjærspenning (flow rate) som styres av en peristaltisk pumpe. Ved slutten av forsøket, blir de sirkulerende og migrerte celler oppsamlet for videre analyser. 3D-enhet kan brukes til å undersøke celle rulle på og vedheft til EC i skjærspenning, sjelevandring i respons til chemokine gradienter, motstand mot skjærspenning, cluster formasjon, og celle overlevelse. I tillegg gjør muligheten for en ekstra innsats effekten av crosstalk mellom EU og microenvironmental celler til å bli undersøkt. Translasjons anvendelser av 3D-enheten omfatter testing av stoffet kandidater som målcellen migrasjon og forutsi in vivo-oppførsel av celler etter intravenøs injeksjon. Således er den nye 3D-enheten en allsidig og billig verktøy for å studere de molekylære mekanismer som formidler cellulær ekstravasasjon.

Introduction

Cell ekstravasasjon er den prosess ved hvilken sirkulerende celler ut av blodet og er en kritisk komponent i mange fysiologiske reaksjoner i kroppen. Prosessen er også viktig for vev gjenfødelse, som for eksempel når terapeutiske celler mobilisert fra vev inn i blodårene (eller injiseres intravenøst) vandrer gjennom blodkar og avslutte blodsirkulasjonen til områder av skade eller degenerasjon. Ekstravasasjon er også en kritisk komponent av patogenesen av mange sykdommer, inkludert inflammasjon, immun-avvisning, autoimmunitet, og tumormetastase.

Ekstravasasjon er en kompleks multi-trinns prosess som involverer interaksjon av sirkulerende celler med endotele celler (EC) under betingelser med fysiologisk strømning. Fremgangsmåten omfatter (a) celle rullende, (b) fast adhesjon til den luminale overflaten til EC, og (c) transmigrasjon tvers EF. Viktigere er hvert trinn i bloduttredelse kaskade regulert av en undergruppe av cell type-spesifikke og artsspesifikke molekyler. Imidlertid er de detaljerte molekylære mekanismene som regulerer ekstravasasjon av spesifikke celle undergrupper ikke godt forstått, hovedsakelig på grunn av tekniske problemer av rekapitulere forholdene i blodet. Romanen 3D enheten som beskrives her er utformet for å overvinne disse tekniske utfordringer og la eksperimenter som skal utføres det vil forbedre vår forståelse av biologi celle migrasjon.

Molekylene som formidler celle migrasjon er viktige terapeutiske mål. En detaljert forståelse av de molekylære hendelser som kontrollerer overføringen av spesifikke celletyper vil være behjelpelig med å identifisere nye mål for den terapeutiske fremme eller inhibering av ekstravasasjon. For eksempel vil intervensjoner som forbedrer migrering av terapeutiske stamceller (enten avledet fra voksne, neonatal eller fra fostervev) mot steder av skade eller degenerering være av stor nytte i vev regenerering.Det er økende interesse for in vitro generasjon av terapeutiske stamceller, inkludert celler avledet fra pluripotente kilder, og i ex vivo manipulert adulte stamceller (utvidet, genetisk manipulert, og forbehandlet med ulike enzymer) ^1. Således er det et behov for nye teknologier for å evaluere kvaliteten av stamceller før de brukes for terapeutiske formål. Blant andre parametre, må cellene være i stand til effektivt å gå ut av sirkulasjon, fordi behandlinger for multifokale lidelser kan kreve intravenøs administrering av stamceller ^2. Faktisk er en av dagens utfordringer i stamcelleforskningen biologi for å overvinne den ekstremt lave effektiviteten som stamceller hjem til områder av vevsskade ^3-6, understreker behovet for å ta opp dette gapet i vår forståelse av stamcelleforskningen migrasjon. I kontrast, strategier som blokkerer celle migrasjon ved å målrette spesifikk målsøkende molekyler vil være nyttige for behandlingen av inflammatory og autoimmune sykdommer så vel som metastatisk kreft. Således forstå de molekylære mekanismer som formidler interaksjonen mellom sirkulerende celler og EC under cellemigrering og ekstravasasjon er relevant for translasjonsmedisin og medisiner, så vel som til grunnforskning.

Det finnes i dag en rekke metoder for å studere ulike aspekter av celle migrasjon. Men disse metodene har svakheter som kan overvinnes med den nye 3D-enheten.

Dyremodeller:

Dyremodeller, som immunsupprimerte mus og genetisk manipulerte mus, har vært nyttige verktøy for å studere migrasjon av humane celler in vivo. Det er imidlertid en betydelig ulempe for disse modellene som menneskelige celler kommuniserer dårlig med adhesjonsmolekyler tilstede på mus EC, delvis på grunn av artsspesifikke sekvens forskjeller i mange celleoverflatemolekyler. Således kan bruk av gnagere studeremenneskelig celle migrasjon er neppe autentisk reflektere hendelsene i menneskets organspesifikke vaskulære senger. I tillegg, in vivo-modeller er ikke egnet for high-throughput screening av narkotika kandidater. Den konvensjonelle in vivo modeller ved hjelp av å studere celle homing ikke diskriminerer mellom de ulike trinnene i bloduttredelse kaskade, noe som gjør det vanskelig å identifisere og målrette nye målsøkende molekyler. Den intravital mikroskopi tilnærmingen ble utviklet for å dekke dette behovet og har vært informativ, men denne teknikken er ekstremt tid-og arbeidskrevende ^7,8.

Statiske sjelevandring analyser:

Transwell eller Boyden kammer assays måle cellemigrering over en porøs membran, og er mye brukt i migrering studier. Analysen har den fordel at det kan benyttes for å undersøke ikke bare cellemotilitet og celle-ekstracellulære matriks (ECM) interaksjoner, men har også kjemokin-mediert migrasjon av cellerover en EC monolag dyrket på de porøse membraner. Dessverre, fenotype og funksjon av EC under statiske forhold skiller seg vesentlig fra de under fysiologiske flyt ^9,10. Dermed trenger de kjemotaktiske hendelser som oppstår i Transwell analyser ikke trofast etterligne samspillet mellom trekkende celler og EC i skjærspenning. I tillegg vil "rullende" trinn av homing kaskade, som gir en ekstra dimensjon av selektivitet til den totale prosessen, ikke forekommer i statiske Transwell analyser. Således, mens denne teknologien tillater kvantitativ evaluering av kjemokin-mediert celle-migrering over EC monolaget er imidlertid begrenset av dens manglende evne til å gi den skjærspenningen som etterligner blodstrøm in vivo.

Analyser henhold skjærspenning:

Veggen skjærspenning er kjent for å spille en viktig rolle i regulering av EC-funksjon ^9,10. Skjærkrefter indusere rask aktivering av signalering kaskader, Transcription faktorer, og differensial genuttrykk i EC ^11,12. Denne informasjonen førte til utviklingen av neste generasjon av vedheft analyser - parallelle LAF kamre og kapillærer - å studere rulle og vedheft av celler til EC under forhold med skjærspenning ^7,13. Den begrensende faktoren for disse analysene er at de kan måle bare rullende og heft, men skiller ikke mellom en tilhenger celle som skulle gå videre til transmigrate og en tilhenger celle som er "arrestert" på EC monolag og ville ikke transmigrate. Videre kan disse analysene ikke måle migrering av celler mot en kjemokin gradient.

Flere rapporter har beskrevet muligheten av adherente celler til å krype under en EC monolag dyrket på glassplater under forhold med strømning ^14.. De begrensninger i denne krypende teknikk omfatter: den analyserer bare et begrenset antall celler, det er ikke-kvantitativ, den analyserer celle krypende på matrisen og cell overflate, men ikke mot et kjemotaktisk migrering gradient, og det tillater ikke de transmigrated cellene å bli isolert. Således, selv om denne assay har fordelen av å anvende skjærspenning til EF-monolaget, kan det ikke kvantifisere migrasjon av celler mot en kjemokin gradient.

Den nye 3D-teknologi er beskrevet her overvinner mange av disse mangler ved å kombinere skjærkraft (øvre kammer) med en statisk kjemokin gradient (nedre kammer) og tillater kvantitativ vurdering av hvert trinn av ekstravasasjonen kaskade (Fig. 1). Anordningen kan også brukes til å undersøke hvor krysstale mellom EC og mikromiljøet påvirker evnen av EC å støtte ekstravasasjon av sirkulerende celler. Følgende protokoll beskriver steg-for-trinn metode for å bruke 3D strømningskammer enhet.

Protocol

En. Forbered øvre og nedre Setter inn for cellevekst av kollagen Coating

1. Beregn antall innsatser som er nødvendig for forsøket. Plasser hver pakning i en separat steril petriskål (35 x 10 mm) og sterilisere ved bestråling (11 Gy).
2. Klargjør kollagen løsning for belegning av membraner: 50 ug / ml, 154 ul pr innsatsen (insert overflateareal 1,54 cm ^2).
3. Plassere flere dråper (~ 20 mL per dråpe) av kollagen-løsning i en sirkel på overflaten av det innlagte membran (ikke la pipettespissen berøre overflaten) og deretter forsiktig tilsett resten av alikvoten for å danne en stort fall på membranoverflaten. Sørg for at kollagen løsningen forblir halvkuleformet og tapper ikke fra membranen overflaten.
4. Dekk petriskål med et lokk og inkuberes i 1 time ved romtemperatur på en flat overflate.
5. Sug kollagen løsning og vaske membranen gang ved å dekke med 160 mL PBS.
6. Aspirate PBS og sett på lokket. Hvis du bruker samme dag, plasserer petriskål på et tørt sted ved romtemperatur. Ellers sett formen på 4 ° C og bruke innsatsen innen 7 dager.

2. Kultur endotelceller på øvre Setter

1. Forbered EC suspensjon i ønsket kultur medium. Sørg for at cellen levedyktighet er> 98% og bruke den umiddelbart.

Merk: For menneskelig umbilical vein EC (HUVEC), 4 x 10 ⁵ celler i 160 mL per påfylling brukes.

2. Ta petriskåler med kollagen-belagte inserts utarbeidet i § 1, ikke fjerne innleggene fra rettene. Plasser flere små dråper av celle-suspensjonen (ca. 20 ul per dråpe) i en krets på overflaten av kollagen-belagt membran (ikke la pipettespissen berøre overflaten) og deretter forsiktig tilsett resten av cellesuspensjonen for å danne en stor dråpe. Sørg for at cellen suspensjon fortsatt Hemis pherical og tapper ikke fra membranen overflaten.
3. Erstatte lokkene og nøye plassere retter i en 5% CO ₂ cellekultur inkubator og inkuberes (uten risting) ved 37 ° C i 30 min for å tillate at cellene fester til membranen.
4. Tilsett 5 ml kulturmedium til hver petriskål slik at innsatsen blir stående på bunnen av skålen og er fullstendig dekket av mediet. Bytt lokkene og nøye sette retter tilbake i kuvøse. Kultur cellene ved 37 ° C over natten.
5. Bruke samme fremgangsmåte for å tilberede den andre (valgfritt) nedre innsats med celler som representerer den lokale mikromiljøet, som vil bli plassert under innsatsen som inneholder EC-laget.

Bemerk: Dersom de nedre innsatser er inkludert i forsøkene, er de øvre og nedre kobler først forbindes med hverandre før de plasseres innsatsene inn i 3D-enheten (figur 4B).

e "> 3. Monter 3D Flow Chamber Device

1. Skru sammen de øvre og nedre plater, koble platene til den gass sentral-enhet ved hjelp av rør, plasserer den sammensatte enhet i en ren plast-pose, og posen og sterilisere innholdet etter bestråling (11 Gy).
2. Ta en skuff-sokkel fra cellekultur inkubator, sted i en steril vev kultur hette, spray med 70% etanol, tørk av, og deretter dekke brettet med en stor steril serviett.
3. Plasser bestrålt plastpose inn i panseret, fjerne enheten fra posen og legg den sterile kuvøse skuffen. Koble enheten til den peristaltiske pumpen med slange gitt. Program pumpen i en optimal hastighet på 0,2 ml / min.

Merk: For å koble pumpen med stikkontakten, extrude den elektriske ledningen gjennom hullet i baksiden av inkubatoren. Bruk røver plug rundt ledningen for å sikre at hullet er lufttett.

4. Prime 3D-Flow Chamber Device

1. Koble innløpsslangen fra stikkontakten ved å dra i metall nål fra slangen (bruk små sterile servietter å opprettholde sterilitet av slangen). Bruk metall nål koblet til røret som en "innløp" og frakoplet enden av slangen som en "utløp". Plasser metall nål innløp i 15 ml tube med media; plassere uttaket i tomt 15 ml tube.
2. Slå på pumpen, slik at strømningen mot urviseren og angi strømningshastigheten ved 0,2 ml / min. Tillat den negativt trykk for å trekke mediet fra de 15 ml innløpsrøret inn i røret og stanse pumpen når mediet når enden av slangen umiddelbart før den kobles til enheten (figur 2, nr. 1 Stopp).
3. Skru av de øvre og nedre plater av enheten. Fjern forsiktig den øvre plate og sted 1500 - 1550 ul av medium (enten bare medium, eller i tillegg til de eksperimentelle kjemokiner) inn i de nedre brønnene. Sørg for at brønnen inneholder tilstrekkelig medium for å danne en halvkule som når ca 1-2 mm over nedre plate.
4. Overfør den klargjorte innsatsen fra petriskålen til brønnene til den nedre plate ved hjelp av sterile pinsetter, å sørge for at ingen bobler blir fanget under skivene. Aspirer ethvert medium som kommer frem på overflaten av den nedre plate for å sikre at platen forblir tørt. Plasser den øvre platen tilbake på nedre plate og koble platene hjelp av skruer.
5. Umiddelbart slå på den peristaltiske pumpe og tillate medium å strømme gjennom 3D-enheten. Heve utløpsenden av innretningen og vedlikeholde kammeret i denne stilling for å hindre dannelse av bobler i rommet mellom platene.
6. Tillate mediet å fylle kammeret og røret som forbinder kammeret til gassen sentral-enhet. Stopp pumpen umiddelbart før mediet når gassen exchange enheten (Figur 2, Stopp nr. 2). Place 3 ml medium i gassutveksling enheten, slå på pumpen, og lar luftbobler å flykte gjennom gassutveksling enhet. Heve gassutveksling enhet for å tillate mediet å fylle sonden kommer ut av gass-sentral-enhet og stanse pumpen når mediet har nådd 2-3 cm før slutten av uttaket slangen (figur 2, Stop # 3).
7. Koble innløpet metall nål til utløpet ved hjelp av små sterile servietter. Omprogrammere pumpen slik at medium strømmer i motsatt retning (med urviseren) mot gassutveksling enhet og sikre eventuelle luftbobler fjernes når de når gassen sentral-enhet. Sjekk at ingen luftbobler forblir i systemet.
8. Omprogrammere pumpen slik mediet strømmer mot klokken. Tilsett 100 ul av testcellen suspensjon av gassutvekslingen enhet. Lukk lokket på gassutveksling enhet, plasser skuffen med fungerende system tilbake i kuvøse, og la testcellene å mikrosirkue i 3D-enhet ved 37 ° C for ønsket tid.

Merk: Rengjør den elektriske ledningen til pumpen med 70% etanol og plassere den på innsiden av inkubatoren.

5. Avslutte testen og samle inn prøver for analyse

1. Ta ut skuffen med fungerende system fra inkubatoren og plass i panseret. Stopp pumpen, koble fra innløp og utløp, og legg endene inn i tomme sterile 15 ml rør.
2. Slå på pumpen og samle cellesuspensjonen fra systemet; sted cellesuspensjonen på is, eventuelt inntil bruk.
3. Demontere kammeret ved å fjerne skruene og løfte den øvre platen. Fjern innleggene fra nedre plate og overføre dem til petriskåler.

Merk: Innsatsene kan være farget for å visualisere og telle celler i situ (krystallfiolett 0.05% i dH ₂ O) eller trypsinisert å samle EC for videretesting.

4. Fjern medium og celler fra lavere brønner i rør og sentrifuger i 5 min ved 210 x g. Supernatanten fjernes, vaskes og resuspender cellene etter ønske, og behandle cellene i henhold til de spesifikke eksperimentelle mål (nærmere omtalt nedenfor).

Representative Results

Murine benmarg, avledet EF linjen STR-12 ble dyrket på innlegg med 5 mikrometer porer. Raten av EC vekst ble overvåket under mikroskop, og når den EC var 100% konfluente, ble skivene overført til brønnene i det nedre rom av 3D-enheten. Umiddelbart før plassere innsatser ble brønnene til det nedre rom fylt med kulturen bare medium (negativ kontroll) eller med medium supplert med stromale celler utvunnet factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml og 50 ng / ml). Deretter ble den 3D-enheten montert og kammeret ble fylt med medium som beskrevet i protokollen. Testcellene må sirkuleres i det øvre rom av anordningen ble nyhøstet murine benmargceller (3,5 x 10 celler pr kammer ^6). En definert skjærspenning på 0,8 dyn / cm ² ble anvendt ved å sette den peristaltiske pumpe hastighet på 0,2 ml / min. Hele systemet arbeider ble deretter plassert i 5% _CO2 inkubator ved 37 ° C, og ceLLS fikk lov til å sirkulere og samhandle med EF monolag for 4 timer. Ved slutten av denne periode ble de sirkulerende cellene oppsamlet, kammeret ble tatt fra hverandre, og innsatsene ble fjernet som beskrevet i protokollen. De transmigrated celler ble høstet fra de nedre brønnene, vaskede, resuspendert i friskt medium, og overført til metylcellulose kulturer supplert med hematopoietiske vekstfaktorer for kolonidannende celler (CFC)-analyse (Figur 3). Som ventet, har vi funnet en signifikant høyere antall CFC hadde migrert over EC monolaget til brønnene som inneholdt 50 ng / ml SDF-1 enn for brønner inneholdende 5 ng / ml SDF-1 eller medium alene.

Som vi tidligere beskrevet, er ingen av de nåværende in vitro-teknikker som er tilgjengelige for å studere cellemigrering er i stand til å teste effekten av den lokale mikromiljø på evnen av EC å støtte ekstravasasjon av migrerende celler. For å illustrere hvordan dette kan oppnås med den 3D-enhet, viundersøkes ekstravasasjon av sirkulerende hematopoetiske celler over et lag av EC og et lag av benmarg stromale celler. For dette ble en andre (lavere) innsats inneholdende et lag av stromale celler anordnet ved den øvre innsats inneholdende EF-monolaget på nedre plate (figur 4). Forsøket ble deretter utført som beskrevet ovenfor, og de transmigrated celler ble høstet fra brønnene og telles. Resultatene viste at innsetting av et ytterligere lag av stromale celler under EC monolaget betydelig økt migrering av hematopoetiske celler mot SDF-1 (figur 4). Denne observasjonen er i overensstemmelse med ideen om at den lokale mikromiljøet bidrar til rekruttering av sirkulerende cellene til vevet.

(PM). EC er dyrket på membranen, som deretter danner en barriere mellom det øvre og nedre kammer. Definerte skjærspenninger brukes til øvre kammer av 3D-enheten ved perfusing medier med en konstant infusjon slangepumpe. Sirkulerende celler er enten ikke-samspill (NIC), samhandle med EF forbigående ('roll'; RC), eller holder seg til EC (AC). En subpopulasjon av adherente celler transmigrates tvers av EC laget til det nedre kammer statiske av enheten (TM) B:. Sett ovenfra tegning (øvre panel) av 3D-enheten. Den horisontalt snitt (nedre panel) viser plasseringen av den øvre membran (rød), den nedre membran (grønn), og i bunnen av brønnen (blå) C:. The isometric utsikt illustrerer en integrert del av enheten: fire skruer, en akryl topp blokk, en øvre kammer segl, øvre og nedre membraner, bunn o-ring, og en 3-brønnen akryl nederste blokk D:. et fotografi av 3D flyt kammer forbundet med en peristaltisk pumpe, og en gassutveksling enhet. Systemet er montert i en steril hette og deretter overført til en cellekultur inkubator.

Figur 2. En skjematisk representasjon av den 3D Bevegelsesbegrenser. Tegningen viser de tre trinn som kreves for å montere systemet. Kulturmediet blir trukket inn fra innløpet ved hjelp av det negative trykket skapt av den peristaltiske pumpe. Strømmen av medium er stengt av ved stopp # 1 for å tillate innsatsene til å bli plassert inn i enheten. Etter at kammeret er lukket, er pumpen omkoblingsbarched på nytt, og kammeret blir umiddelbart fylles med medium for å hindre uttørking av cellene dyrket på innsatsene. Stopp nr. 2 tillater medium å bli plassert i gassen sentral-enhet. Stopp 3 tillater strømmen å bli stoppet ved kobling mellom innløpet og utløpet. Flyten kan rettes i en med eller mot klokken retning for å fjerne luftbobler gjennom gassutveksling enhet ved hjelp av en bryter på pumpen.

Figur 3. 3D-enheten støtter SDF-1-mediert sjelevandring av blodkreft stamceller under forhold med fysiologiske skjærspenning. A: Tre enheter (hver inneholder tre brønner i nedre kammer) ble montert og kjøres parallelt. Medium alene eller medium inneholdende SDF-1 ved 5 eller 50 ng / ml ble tilsatt til det nedre rom brønner. Murint bone marg celler fikk lov til å sirkulere i enhetene for 4 hr. Deretter ble hver enhet demontert og cellene som hadde transmigrated mot SDF-1 (gul) ble oppsamlet fra de lavere brønner, telles, og dyrket i metylcellulose supplert med hematopoietiske vekstfaktorer (GF). Fjorten dager senere, ble koloniene scoret under mikroskopet B:. Antall stamfedre (koloni-forming celler, CFC) utvinnes fra de nedre avdelinger er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner per tilstand. * P <0,05.

Figur 4. Virkningen av mikromiljøet på interaksjoner mellom hematopoetiske celler og endotelceller. A: Illustrasjonen viser plasseringen av et sekund porøs membran med kultivert stromal fibroblaster (SF) under den øvre membran med EF. Andre forkortelser er som beskrevet for figur 1A B:.. Den ytterligere membran (nedre innsats) med dyrkede SF ble satt inn under den øvre membran C: Tre apparater (hver inneholder 3 brønner) ble kjørt i parallell. Medium alene eller medium inneholdende SDF-1 ved 50 ng / ml SDF-1 ble tilsatt til det nedre rom brønner. De negative kontroll kamre utelatt SC, SDF 1 eller begge deler. Benmargceller ble tillatt å sirkulere i 4 timer ved 37 ° C. Deretter ble hver enhet demontert og de transmigrated celler ble oppsamlet fra det nedre rom og brønnene telles. Antallet transmigrated celler utvinnes er vist som middelverdien ± SD for tre brønner pr tilstand. * P <0,05.

Discussion

3D-enheten kan være en nyttig teknologi for forskning i ulike områder, inkludert stilk cellebiologi, vaskulær biologi, hematologi, onkologi, autoimmunitet, og betennelser. 3D-enheten vil være spesielt nyttig for forskere å studere blodkreft, mesenchymal, nevrale, og andre stamceller til å undersøke de molekylære mekanismene som regulerer hvert trinn i stamcelleforskningen bloduttredelse kaskade. Forskere som studerer celle migrasjon kan også bruke denne enheten til å undersøke de ulike trekkende mekanismer av T-og B-lymfocytter, monocytter, nøytrofile, eosinofile, NK-celler, og andre trekkende celler. I vaskulær biologi, vil enheten være nyttig for å vurdere effekten av den lokale mikromiljø på evnen til å støtte EC celle rekruttering og for å etterligne den blod-hjernebarrieren in vitro. For forskere som fokuserer på sykdom patogenese, kan enheten brukes til å studere migrasjon av cytotoksiske T-celler i bukspyttkjertelen under type I diabetes, i miantennelse av eosinofiler inn i lungene av astmapasienter, migrering av neutrofiler, monocytter og lymfocytter inn i områder av inflammasjon i et utall sykdommer, rekruttering av celler til å sårhelende områder, samspillet av cytotoksiske T-celler med neovaskulatur, og rekruttering av cytotoksiske T-celler i svulster.

Romanen 3D-enhet vil også være en nyttig verktøy for translasjonell forskning og for preklinisk narkotika utvikling og screening. For eksempel kan apparatet brukes til å optimalisere fremstillingen av terapeutiske celle-suspensjoner for intravenøs administrering, til å teste rekrutteringen av terapeutiske celler til skadde vev versus normale vev, og for å undersøke rollen til spesifikke organ eller vev endotelet og mikromiljøet i denne prosess. For narkotika utvikling, kan enheten brukes til å teste narkotika kandidater som er rettet mot kreftceller og blokkere hvert trinn i bloduttredelse kaskade, for å teste trekkende celler som et stoff leverey kjøretøy til tumorseter, til å teste legemidler som regulerer funksjonen av humant organspesifikk endotel eller den lokale vevsspesifikk mikromiljøet, og å teste kombinasjoner av stoffer som regulerer ulike trinn av homing kaskaden. Til slutt, når omgjort til et high-throughput system, kan enheten brukes til screening små molekyler, peptider, og antistoffer som er rettet mot molekyler som medierer celle trafficking.

Tekniske detaljer og tips

Rolling og heft i henhold flyt er de kritiske trinnene i bloduttredelse kaskade og bidra vesentlig til effektivisering av celle migrasjon in vivo. Spesielt ikke disse trinnene ikke bidra til statiske analyser in vitro. Imidlertid statiske transmigrasjon analyser er nyttige som negative kontroller i eksperimenter teste effekten av skjærspenning på celle overlevelse og funksjon, inkludert muligheten til å støtte EC lav affinitet interaksjoner (rullende) og fast adhesjon.

Valget av medium for eksperimenter i 3D-enheten er viktig. Media inneholder ulike vekstfaktorer som kan påvirke overlevelsen av sirkulerende celler, spesielt under lange inkubasjonstidene. I tillegg er de konsentrasjonene av Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +,} kan der påvirke adhesive interaksjoner under forhold med fysiologisk strømning, varierer betydelig i kommersielle dyrkningsmedier. Andre tekniske detaljer som bør tas i betraktning når man planlegger eksperimenter med 3D-enheten er omtalt nedenfor.

Utvalg av EF monolaget

Celleoverflaten underskrift av EC påvirkes av ulike parametre, blant annet arten og vev av opprinnelsen og cellekultur forhold som bør tas hensyn til i eksperimentell design. Noen brukte EC omfatter lunge-avledet microvascular EC (LDMVEC), benmarg-avledet EC (BMDEC), hjerne-avledet EC (BDEC), og HUVEC.Egenskapene til EC også variere med deres opprinnelse. For eksempel BMDEC constitutively express selectins og VCAM-1, som er ansvarlig for rullende og heft, mens BDEC, LDMVEC, og HUVEC ikke uttrykke disse molekylene under normale forhold. Derfor kan innstikk belagt med BDEC, LDMVEC, og HUVEC være forbehandlet med TNF α (10 ng / ml, 4 timer) eller andre faktorer for å etterligner betennelse og indusere ekspresjon av målsøkende molekyler.

Testing crosstalk med den lokale microenvironment

Det er økende interesse for å forstå hvordan den lokale microenvironment regulerer funksjonene i EU og deltar i celle bloduttredelse. Våre resultater viser at innsetting av et monosjikt av stromale celler under EC monolaget signifikant øker ekstravasasjon av sirkulerende celler. Dette funnet viser at crosstalk mellom EU og stroma forbedrer evnen til EU for å støtte bloduttredelse av sirkulerende celler. Moreover, kan innsetting av celler fra forskjellige microenvironments (f.eks stamceller, lunge fibroblaster, tumorceller, astrocytes) bidrar til å etterligne spesifikke vaskulære senger. Spesielt kan en kombinasjon av hjerne-avledet EC og astrocytter være en nyttig tilnærming for å etterape den blod-hjerne-barrieren. Tilsvarende celler hentet fra pasienter, eller normale celler manipulert in vitro, kan hjelpe etterligne en bestemt syk microenvironment.

I våre studier har vi brukt lavere innsatser med stromaceller vokst til 50% samløpet. Selv om den optimale tetthet av microenvironmental celler på innsatsene vil avhenge av målene i studien, kan dette være lett manipuleres og styres.

Velge en skjærspenning rente

Den skjærspenning på 0,8 dyn / cm ² ble benyttet her, fordi dette har blitt demonstrert av Von Andrian et al. å være den skjærspenning i benmargen microvasculature, hvor blodkreft stamceller avslutte sirkulasjon og skriv vev under normale fysiologiske forhold ^15. I kontrast er høyere nivåer av skjærspenning observert i større fartøyer, hvor celle-ekstravasasjon er begrenset. Derfor kan høy skjær stressnivå priser brukes som flere kontroller for eksperimenter som undersøkte bloduttredelse av ulike celletyper.

Overlevelse av cellene under skjærspenning avhenger av flere forhold, blant annet celletypen og ex vivo celle behandlinger (Goncharova mfl.., Upubliserte observasjoner), og bør derfor vurderes nøye i løpet av testen. Cell følsomhet for forskjellige nivåer av skjærspenning (skjærspenning motstand) kan bli evaluert ved å programmere den peristaltiske pumpe for å øke den skjærspenning hastighet trinnvis fra 0,8 dyn / cm ^2-6 dyn / cm ^2. I løpet av disse testene, kan cellene samles periodisk fra gassutveksling kammeret for å overvåke celledød ved å bruke somsier for eksempel trypan blå eksklusjon, Annexin V og PI farging, og apoptose markør uttrykk.

Ved forsøk er utformet for å teste den skjærspenning motstand av ex vivo konstruerte celler eller celler avledet fra parenchyma, anbefales det at ytterligere positive kontroller, som for eksempel blod båret celler, er inkludert i forsøkene.

Utvalg av innsatsen porestørrelse og ECM belegg

Innstikk er tilgjengelig med flere porestørrelser (3, 5 og 8 mikrometer). Valget av pore-størrelse vil avhenge av størrelsen og egenskapene av de sirkulerende testceller, er som også er tilfelle for statiske Transwell-analyser. Innsatser med stor porestørrelse (8 um) anbefales å teste ekstravasasjon av store celler slik som tumorceller av epitelisk opprinnelse. Leukocytter eller blodkreft stamceller er mer vanlig testet med 5 mikrometer pore inserts, og tre mikrometer pore inserts er best reservert for testing bloduttredelse av sMaller celler. Imidlertid er testcellen størrelsen alene ikke er den eneste viktige faktor og bør teste flere innsatser med porestørrelser.

I våre innledende studier, testet vi ulike ECM for deres evne til å støtte vekst av EC på skivene og for å motstå skjærspenning i> 4 timer. Den ECM som ble testet omfattet Matrigel, poly-D-lysin, fibronektin, laminin, kollagen type I, Hydrogel, Meta-keratin I, II, III, IV, og Extracel. De beste resultatene for EC veksten ble oppnådd med Extracel, fibronectin, og kollagen. Men i våre hender, Extracel på 0,8 mikrogram / ​​cm ² betydelig redusert sjelevandring av testcellene over membranen. Derfor har vi nå bruke fibronectin (5 mikrogram / ​​cm ²⁾ eller kollagen (5 mikrogram / ​​cm ²⁾ for belegg av innstikk. Imidlertid vil det optimale valg av ECM sannsynligvis bli påvirket av både type EC og de transmigratory egenskapene til testcellene. En innledende forsøk bør gjennomføres for å teste integritetty av EF monolaget vokst på utvalgte ECM. For eksempel plassere forbelagte innsatser med EF monolayers i petriskåler fylt med kultur medium, plasserer rettene på en shaker for å lage skjærspenning (lav innstilling), og ruge ved 37 ° C og 5% CO ₂ i 12 timer. Integriteten av EF etter eksponering for skjærspenning kan evalueres ved hjelp av krystallfiolett farging.

Valg av optimale test cellekonsentrasjonen

Muligheten av testceller for å avslutte sirkulasjonen er avhengig av mange karakteristika som er spesifikke for hver celletype. For å generere statistisk signifikante resultater, må den sirkulerende celletettheten bli optimalisert for å sikre at et tilstrekkelig antall celler som migrerer inn i de positive kontrollbrønner. Derfor anbefales det å utføre innledende tester med en rekke celle-tettheter (f.eks 10 ³ / ml til 10 ⁷ / ml) for å forstå forholdet mellom antall celler lastet inn i systemet, ogantall celler som gjennomgår sjelevandring.

I tillegg kan den optimale sirkulerende konsentrasjon variere for samme celletype erholdt fra forskjellige kilder. For eksempel, CD34 ⁺ celler er en heterogen celle befolkning som inneholder både blodkreft stamceller og engasjerte slektslinje-spesifikke stamceller. De kan fås fra benmarg, mobiliserte perifert blod og navlestrengsblod. De CD34 ⁺ celler avledet fra disse tre kildene har forskjellige målsøkende og pode evner ^16-18, slik at forholdene for testing av disse cellene i 3D-enheten skal være optimalisert før en fullskala studie.

Valg av optimal celle sirkulasjonstid

Den optimale sirkulasjonstid skal bestemmes empirisk for hver celletype. Den minste tid som kreves for sirkulasjon kan bli ekstrapolert fra resultatene av statiske migrasjons-analyser, men dette kan bli omfattende risikoanalyserded når cellene utsettes for skjærspenning. Pilotstudier testing sirkulasjon ganger mellom 4 og 96 timer er anbefalt.

Den gassutveksling enhet

Hovedformålet med den gass sentral-enhet er å opprettholde den optimale konsentrasjonen av _CO2 i mediet sirkulerer gjennom 3D-enhet, like innstillingene i standard vevkul-inkubatorer. Gassen sentral-enhet kan også benyttes for å legge testceller og forbindelser og for oppsamling av prober og prøvene under testen.

Evaluering av test celle tall

Sirkulerende blodceller kan prøves på forskjellige tidspunkter i løpet av eksperimentet gjennom gassen sentral-enhet. Ved slutten av eksperimentet, ble de celler som var tilbake i sirkulasjon oppsamles fra utløpet. Når den 3D-enheten demonteres ved slutten av forsøket, kan de transmigrated cellene høstes fra de lavere brønner og samlet feller videre analyse. Hvis input celler er umerket, kan de transmigrated cellene farget med trypan blå og levende / døde celler nummerert mikroskopisk. Alternativt kan input celler merkes med en av de mange "celle tracker" dyes tilgjengelig for levende celle bildebehandling før du legger inn i 3D enhet, i dette tilfellet, den høstet transmigrated celler bør bli lysert for kvantifisering av fluorescens.

Valg av optimale størrelsen på utvalget

For å tillate statistisk analyse, må en prøvestørrelse velges som vil gi omtrent 80% styrke til å påvise den hypotetiske forskjell i de gjennomsnittlige prosentvise endringer mellom to grupper, når de testes ved et signifikansnivå på 0,05 ved hjelp av en tosidig t-test. Basert på vår erfaring med benmargceller, bruker vi tre brønner per eksperimentell betingelse for 3D-enheten eksperimenter. Imidlertid vil den optimale prøven størrelse varierer med Målet med eksperimentet og bør bestemmes empirically. Multippel regresjon statistiske tester, tosidige t-tester, og analyser av variansen kan brukes til å verifisere statistisk relevans av resultatene.

Valg av chemokines

Som for alle transmigrasjon assays, vil valget av chemoattractant være diktert av egenskapene til testcellene og målet av studien. SDF-1 er et veletablert kjemoattraktant for hematopoetiske celler. I våre hender, var en konsentrasjon på 50 ng / ml SDF-1 optimalt å stimulere bloduttredelse av benmarg-avledet blodkreft stamceller. Vi bruker også C3a og bFGF som chemoattractants for stamceller ^19. Vi anbefaler imidlertid titrering hver chemokine og kryss-titrering kombinasjoner av chemokines for å finne optimale konsentrasjonsområde før en fullskala studie. For visse celletyper, kan en kombinasjon av kjemotaktiske faktorer være fordelaktig. Hvis chemokines for spesifikke test cellene er ukjent eller utilgjengelig, conditioned medier fra stimulerte lymfocytter, fibroblaster og andre celler kan brukes som en kilde for chemoattractants.

Valget av avlesning parametere

Allsidigheten av 3D-enheten vil utvide den type sjelevandring eksperimenter som kan utføres, og suksessen av forsøkene vil avhenge gjennomtenkt vurdering og utforming av avlesning parametere. Som regel celler oppsamlet fra de øvre (sirkulerende) kammer og det nedre (statisk) kupé bør testes for levedyktighet samtidig som celle-telling. Noen celler besitter lav toleranse med fysiologisk skjærspenning observert i mikrosirkulasjon. I dette tilfelle vil antallet av døde celler økes i det øvre kammer. Antallet heftende celler arrestert (eller fanget) på EC lag kan bli evaluert av immunocytochemistry av markører uttrykt spesielt av testcellene. Antistoffer spesifikke for CD31 og vWF kan benytteså oppdage EC og å tillate forskjellsbehandling mellom testcellene og EU. I tillegg bør integriteten av EC monolaget overvåkes ved slutten av hver test.

Hvilke typer analyser med de innsamlede cellene vil avhenge av etterforskere 'eksperimentelle mål, men kan omfatte analyse av endringer i genuttrykk av mikromatriser og qPCR, overflate molekyl uttrykk ved FACS analyse, aktivering av signalveier ved FACS og western blotting, og faktor sekresjon av ELISA. Et enormt utvalg av funksjonelle tester er tilgjengelig på de innsamlede celler in vitro, noe som gjenspeiles av vårt eget arbeid der vi dyrket de transmigrated benmargceller å nummerere blodkreft stamceller (figur 3). Prøvene kan også testes i en rekke in vivo.

En viktig parameter som kan hjelpe til å forutsi oppførselen til testcellene in vivo er det en tendenssering av noen celler til å danne aggregater under forskjellige priser av skjærspenning. For eksempel kan terapeutiske celler som gjennomgår aggregatdannelse i 3D-enhet har en større tendens til å danne klumper etter intravenøs administrasjon og forårsake akutt vaskulærobstruksjon in vivo (Goncharova et al., Upubliserte observasjoner). Aggregatdannelse kunne følges mikroskopisk ved prøvetaking testcellene under eller etter gjennomføring av 3D-enhet eksperiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Chamber	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gas exchange unit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inserts	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collagen Bovine,Type I	BD Biosciences	354231
Hydrochloric Acid 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
Trypsin	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectin, human , nature	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ScienCell	1000
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells	ScienCell	1001
Trypan Blue	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Iodide Staining Solutuion	BD Pharmingen	# 556463
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	StemCell	CB007F
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Mouse Methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antibody	abcam	C# ab11713
Petry dish (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml tubes	VWR Fisher	21008 - 918
Tissue culture flasks 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissecting forceps, curved	VWR	82027-384
1,000 μl Pipette tips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipette tips	VWR	37001-530
Equipment
Peristaltic pump	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3