Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Summary

O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional é a novel

Abstract

O extravasamento de células a partir da circulação sanguínea desempenha um papel central em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo células estaminais homing e metástase do tumor. O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional (doravante o dispositivo 3D) é uma nova tecnologia in vitro que recria a tensão de corte fisiológicas e permite que cada passo da cascata de extravasamento de células a ser quantificado. O dispositivo consiste em 3D de um compartimento superior, em que as células de interesse circular sob tensão de corte, e um compartimento inferior de poços estáticos que contêm os quimioatractores de interesse. Os dois compartimentos são separados por inserções porosos revestidos com uma monocamada de células endoteliais (CE). Uma segunda inserção opcional com células do microambiente de interesse pode ser colocada imediatamente abaixo da camada CE. A unidade de permuta de gás permite que a tensão óptima de CO ₂ para ser mantido e proporciona um ponto de acesso para adicionar ou retirar células ou de compostos durante oexperimento. As células de teste circular no compartimento superior à tensão de cisalhamento desejada (taxa de fluxo) controlado por uma bomba peristáltica. No final da experiência, as células circulantes e migraram são recolhidos para mais análises. O dispositivo 3D pode ser usado para examinar célula rolando e adesão à CE sob tensão de cisalhamento, transmigração em resposta a gradientes de quimiocinas, a resistência à tensão de corte, formação de aglomerados, a sobrevivência celular. Além disso, a segunda inserção opcional permite que os efeitos de interferência entre CE e as células micro-ambientais para ser examinada. As aplicações de translação do dispositivo de 3D ​​incluir testes de candidatos a fármacos de que a migração de células alvo e predizer o comportamento in vivo de células após a injecção intravenosa. Assim, o novo dispositivo de 3D é uma ferramenta versátil e barato para estudar os mecanismos moleculares que medeiam a extravasão celular.

Introduction

Extravasão celular é o processo pelo qual as células circulantes sair na corrente sanguínea e é um componente essencial de muitas respostas fisiológicas no corpo. O processo também é importante para a regeneração de tecidos, como, por exemplo, quando as células terapêuticas mobilizados a partir de tecidos dentro dos vasos sanguíneos (ou injectado por via intravenosa) migram através da vasculatura e sair da circulação para locais de lesão ou degeneração. Extravasão também é um componente crítico na patogénese de muitas doenças, incluindo a inflamação, rejeição imunológica, auto-imunidade, e metástases de tumores.

A extravasão é um processo multi-passo complexo que envolve a interacção de células com células endoteliais (CE) circula em condições de fluxo fisiológico. O processo compreende (a) laminação de células, (b), adesão firme para a superfície luminal do CE, e (c), a transmigração através da CE. Importante, a cada passo da cascata de extravasamento é regulada por um subconjunto de cell específico do tipo e moléculas específicas das espécies. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a execução extravasamento de subconjuntos específicos de células não são bem compreendidos, em grande parte, devido à dificuldade técnica de recapitulando as condições na corrente sanguínea. O novo dispositivo 3D descrito aqui é projetado para superar estes desafios técnicos e permitir experimentos a serem realizados que vão melhorar a nossa compreensão da biologia da migração celular.

As moléculas que medeiam a migração de células são alvos terapêuticos importantes. Um conhecimento pormenorizado dos acontecimentos moleculares que controlam a migração de tipos de células específicas possam ajudar a identificar novos alvos para a promoção terapêutico ou inibição de extravasamento. Por exemplo, as intervenções que aumentam a migração de células estaminais terapêuticos (mesmo derivado de adulto, neonatal ou mesmo a partir de tecidos fetais) para locais de lesão ou degeneração seria de grande utilidade na regeneração do tecido.Há um interesse crescente na geração in vitro de células estaminais terapêuticos, incluindo células derivadas a partir de fontes pluripotentes, e em células manipuladas ex vivo estaminais adultas (expandida, geneticamente manipulado, e pré-tratado com várias enzimas) ^1. Assim, existe uma necessidade de novas tecnologias para avaliar a qualidade das células estaminais, antes de serem utilizadas para fins terapêuticos. Entre outros parâmetros, as células devem ser capazes de eficientemente sair da circulação, pois os tratamentos para distúrbios multifocais podem exigir a administração intravenosa das células estaminais ^2. De fato, um dos desafios atuais em biologia de células-tronco é superar a baixíssima eficiência com que as células-tronco casa para os locais de dano tecidual ^3-6, destacando a necessidade de abordar esta lacuna em nossa compreensão da migração de células-tronco. Em contraste, as estratégias que a migração de células bloco alvejando homing moléculas específicas seria útil para o tratamento de, emdoenças inflamatórias e auto-imunes, assim como o cancro metastático. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares que mediam as interações entre células circulantes e da CE durante a migração celular e extravasamento é relevante para a medicina translacional e descoberta de drogas, bem como a ciência básica.

Existem actualmente uma série de métodos disponíveis para estudar os diferentes aspectos da migração das células. No entanto, estes métodos têm limitações que podem ser superados com o novo dispositivo 3D.

Os modelos animais:

Os modelos animais, tais como ratinhos e ratos imunocomprometidos geneticamente manipulados, têm sido ferramentas úteis para estudar a migração de células humanas in vivo. No entanto, uma desvantagem significativa destes modelos é que as células humanas interagem fracamente com as moléculas de adesão presentes na CE rato, em parte devido a diferenças de sequência específicos para a espécie em muitas moléculas da superfície celular. Assim, o uso de roedores para estudarmigração de células humanas é improvável que autenticamente reflectir os eventos em leitos vasculares específicas de órgãos humanos. Além disso, em modelos in vivo, não são adequados para o rastreio de alto rendimento de candidatos a fármacos. O convencional em modelos in vivo, utilizando para estudar célula homing não discriminar entre os diferentes passos da cascata de extravasamento, tornando-se difícil identificar e alvejar moléculas homing novos. Foi desenvolvido a abordagem microscopia intravital para atender a essa necessidade e tem sido informativo, no entanto, esta técnica é extremamente tempo e mão de obra intensiva ^7,8.

Os ensaios estáticos de transmigração:

Transwell ou câmara de Boyden ensaios de migração de células de medida através de uma membrana porosa e são amplamente utilizados em estudos de migração. O ensaio tem a vantagem de que ele pode ser usado não só para estudar a motilidade celular e da matriz (ECM) interacções célula-extracelular, mas também a migração mediada por quimioquina de célulasatravés de uma monocamada de EC cultivadas sobre as membranas porosas. Infelizmente, o fenótipo e função do CE em condições estáticas diferem significativamente daqueles sob fluxo fisiológico ^9,10. Assim, os eventos quimiotáticos que ocorrem nos ensaios Transwell não imitar fielmente as interações entre células migram e CE sob tensão de cisalhamento. Além disso, o passo de "rolling" da cascata da direcção, o que adiciona uma dimensão adicional de selectividade para o processo global, não ocorre em ensaios estáticos Transwell. Assim, embora esta tecnologia não permite a avaliação quantitativa da migração celular mediada por quimiocina em toda a monocamada de CE, que é limitada pela sua incapacidade de fornecer a tensão de cisalhamento que imita o fluxo de sangue in vivo.

Ensaios sob tensão de cisalhamento:

O stress da parede de corte é conhecida por desempenhar um papel importante na regulação da função CE ^9,10. Forças de cisalhamento induzir a ativação rápida de cascatas de sinalização, transcfatores ription e expressão diferencial de genes em EC ^11,12. Esta informação conduziu ao desenvolvimento de uma nova geração de ensaios de adesão - câmaras de fluxo laminar e capilares paralelas - estudar rolar e a adesão das células à CE, em condições de tensão de corte ^7,13. O fator limitante para esses testes é que eles podem medir apenas de rolamento e aderência, mas não diferenciar entre uma célula aderente que iria passar a transmigrar e uma célula aderente que está "preso" na monocamada CE e não transmigrar. Além disso, estes ensaios não é possível medir a migração de células em relação a um gradiente de quimiocina.

Vários estudos têm descrito a capacidade de células aderentes a rastejar sob uma monocamada CE crescido em lâminas de vidro, em condições de fluxo ^14. As limitações para esta técnica rastejando incluem: analisa apenas um número limitado de células, que é não-quantitativa, analisa célula rastejar sobre a matriz e cell superfície, mas não para a migração de um gradiente quimiotáctica, e que não permite que as células transmigrou a ser isolado. Assim, embora este teste tem a vantagem de aplicar tensão de corte para a monocamada de CE, não pode quantificar a migração das células em relação a um gradiente de quimiocina.

A nova tecnologia de 3D ​​aqui descrito supera muitas destas deficiências por combinação da força de cisalhamento (compartimento superior) com um gradiente de quimiocina estático (compartimento inferior), e permite a avaliação quantitativa de cada passo da cascata de extravasamento (Figura 1). O dispositivo também pode ser utilizado para investigar a forma como a interferência entre CE e o microambiente influencia a capacidade da EC para apoiar o extravasamento de células circulantes. O protocolo seguinte descreve a metodologia passo-a-passo para o uso do dispositivo de câmara de fluxo 3D.

Protocol

1. Prepare as inserções superior e inferior para o crescimento celular por colágeno Coating

1. Calcular o número de inserções necessárias para o experimento. Colocar cada inserto numa caixa de Petri estéril separada (35 x 10 mm) e esterilizar por irradiação (11 Gy).
2. Preparar a solução de colagénio para o revestimento das membranas: 50 ug / ml, 154 ul por pastilha (inserir a área de superfície de 1,54 centímetros ^2).
3. Coloque várias gotas (~ 20 ul por queda) de solução de colagénio num círculo sobre a superfície da membrana do elemento de inserção (não deixe que a ponta da pipeta toque na superfície) e, em seguida, adicionar cuidadosamente o resto da alíquota, para formar uma grande queda na superfície da membrana. Assegure-se que a solução de colagénio e permanece hemisférica não drena a partir da superfície da membrana.
4. Cobrir a placa de Petri com uma tampa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, sobre uma superfície plana.
5. Aspirar a solução de colagénio e lavar a membrana uma vez cobrindo com 160 ul de PBS.
6. Aspirate o PBS e substituir a tampa. Se você estiver usando no mesmo dia, coloque a placa de Petri em um lugar seco à temperatura ambiente. Caso contrário, colocar a cápsula a 4 ° C e utilizar a inserção dentro de 7 dias.

2. Cultura de células endoteliais nas inserções superiores

1. Prepare suspensão CE em meio de cultura desejada. Assegure-se que a viabilidade celular é> 98% e usar imediatamente.

Nota: Para humana CE veia umbilical (HUVEC), 4 x 10 ⁵ células em 160 mL por inserção é utilizada.

2. Tome as placas de Petri com inserções de colágeno revestidas preparadas na seção 1, não remova as inserções dos pratos. Coloque várias pequenas gotas da suspensão de células (aproximadamente 20 ul por gota) em um círculo na superfície da membrana de colagénio revestido (não deixe que a ponta da pipeta toque a superfície) e, em seguida, adicionar cuidadosamente o resto da suspensão de células para formar uma gota grande. Assegure-se que a suspensão de células permanece hemis pherical e não drena a partir da superfície da membrana.
3. Substituir as tampas e cuidadosamente colocar os pratos em 5% de CO ₂ incubadora de cultura de células e incubar (sem agitação) a 37 ° C durante 30 minutos para permitir que as células fixar-se à membrana.
4. Com cuidado, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de cada placa de Petri para assegurar que a pastilha permanece na parte inferior do prato e é completamente coberta pelo meio. Substituir as tampas e colocou os pratos de volta na incubadora. Cultura das células a 37 ° C durante a noite.
5. É a mesma abordagem para preparar a segunda mais baixa de inserção (opcional) com células representativas do microambiente local, o que vai ser colocado abaixo do inserto contendo a camada de CE.

Nota: se as inserções mais baixas estão incluídas nas experiências, as inserções superior e inferior estão ligados um ao outro primeiro, antes de colocar as inserções no dispositivo 3D (Figura 4B).

e "> 3. Monte o dispositivo Câmara de fluxo 3D

1. Parafuso juntas as placas superior e inferior, as placas de ligação para a unidade de troca de gás utilizando tubos, colocar um dispositivo de montagem de um saco de plástico limpos, e esterilizar o conteúdo do saco e por meio de irradiação (11 Gy).
2. Retire a bandeja de prateleira da cultura de células incubadora, lugar em uma capa de cultura de tecido estéril, spray com etanol 70%, limpe e, em seguida, cubra a bandeja com um grande guardanapo estéril.
3. Coloque o saco plástico irradiado dentro do capuz, remover o dispositivo da bolsa e colocar na bandeja incubadora esterilizada. Ligue o dispositivo para a bomba peristáltica com a tubagem fornecida. Programa da bomba para uma melhor velocidade de 0,2 ml / min.

Nota: Para ligar a bomba com a tomada de corrente eléctrica, a extrusão do fio eléctrico através do furo na parte de trás da incubadora. Utilize tampão ladrão em torno do cabo para assegurar que o orifício é vedado.

4. Primeiro Dispositivo Câmara de fluxo 3D

1. Desligue o tubo de entrada da tomada puxando a agulha de metal a partir do tubo (usar pequenos pensos esterilizados para manter a esterilidade da tubagem). Utilize a agulha de metal ligado à tubagem como um "entrada" e a extremidade desligada da tubagem como uma "saída". Coloque a entrada da agulha de metal no tubo de 15 ml com a mídia; colocar a saída para o tubo vazio de 15 ml.
2. Ligue a bomba para que o fluxo é anti-horário e definir a taxa de fluxo de 0,2 ml / min. Permitir que a pressão negativa para extrair o meio a partir do tubo de entrada de 15 ml através da tubagem e parar a bomba quando o meio chega ao fim da tubagem imediatamente antes de ele se liga ao dispositivo (Figura 2, parar # 1).
3. Desapertar as placas superior e inferior do dispositivo. Cuidadosamente retire a placa superior e coloque 1500 - 1550 mL de medium (ou meio sozinho ou mais das quimiocinas experimentais) nas cavidades inferiores. Certifique-se bem o meio contém suficiente para formar um hemisfério, que atinge cerca de 1 - 2 mm acima do prato inferior.
4. Transferir a pastilha preparada a partir da placa de Petri com os poços da placa inferior usando fórceps estéreis, certificando-se de que não há bolhas são presas entre as inserções. Aspirar todo o meio que aparece sobre a superfície da placa inferior para garantir que o prato continua a ser seco. Coloque a placa superior de volta para a placa inferior e re-conectar as placas com os parafusos.
5. Imediatamente ligar a bomba peristáltica e permitir que o meio a fluir através do dispositivo em 3D. Elevar a extremidade de saída do dispositivo e manter a câmara nesta posição, para evitar a formação de bolhas no interior do espaço entre as placas.
6. Permitir que o meio para encher a câmara e o tubo de ligação da câmara para a unidade de troca de gás. Parar a bomba imediatamente antes do meio atinge o gás eunidade xchange (Figura 2; Parar # 2). Colocar 3 ml de meio para a unidade de troca gasosa, ligar a bomba, e permitir que as bolhas de ar para escapar através da unidade de troca gasosa. Elevar a unidade de permuta de gás para permitir que o meio para encher o tubo de saída da unidade de troca de gás e parar a bomba quando o meio de atingir 2 - 3 cm, antes do fim do tubo de saída (Figura 2, parar # 3).
7. Conecte a agulha de metal entrada para a saída usando pequenos guardanapos estéreis. Reprogramar a bomba para o líquido escoa em direção oposta (sentido horário) em direção à unidade de troca gasosa e assegurar as bolhas de ar são removidas assim que chegar à unidade de troca gasosa. Verificar que não há bolhas de ar no sistema.
8. Reprogramar a bomba de modo que o meio de fluxos para a esquerda. Adicionam-se 100 ul da suspensão de células de ensaio para a unidade de permuta de gás. Fechar a tampa da unidade de permuta de gás, colocar o tabuleiro, com o sistema de trabalho de volta na incubadora, e permitir que as células de teste para cire no dispositivo 3D, a 37 ° C durante o tempo desejado.

Nota: Limpar o cabo eléctrico da bomba com etanol a 70% e colocá-lo dentro da incubadora.

5. Terminar o teste e coletar amostras para ensaio

1. Retire a bandeja com o sistema de trabalho da incubadora e coloque no capô. Parar a bomba, desligue a entrada ea saída, e colocar as extremidades em tubos de 15 ml estéreis vazios.
2. Ligar a bomba e recolher a suspensão de células a partir do sistema; lugar a suspensão de células sobre gelo, se necessário, até à sua utilização.
3. Desmonte a câmara, removendo os parafusos e levantando a placa superior. Remover as inserções a partir da placa inferior e transferi-los para placas de Petri.

Nota: As inserções podem ser coradas para visualizar e contar as células in situ (0,05% de violeta de cristal em dH ₂ O) ou tripsinizadas para recolher a CE para posteriorteste.

4. Remover o meio e as células dos poços inferiores em tubos e centrifugar durante 5 minutos a 210 x g. Remover o sobrenadante, lavagem e ressuspender as células, como desejado, e processar as células de acordo com os objectivos específicos experimentais (discutido mais adiante).

Representative Results

O óssea de camundongos linha CE derivadas da medula STR-12 foi cultivada em pastilhas com 5 mM poros. A taxa de crescimento CE foi monitorizado sob um microscópio, e quando a CE foram de 100% confluentes, as inserções foram transferidas para os poços do compartimento inferior do dispositivo 3D. Imediatamente antes de colocar as inserções, os poços do compartimento inferior foram preenchidos com meio de cultura por si só (controlo negativo) ou com meio de cultura suplementado com estromal derivada de células factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml e 50 ng / ml). Depois disso, o dispositivo foi montado em 3D e a câmara foi preenchida com o meio, tal como descrito no protocolo. As células de teste para ser circulado no compartimento superior do aparelho foram colhidas células de medula óssea de murino (3,5 x 10 ⁶ culas por câmara). Uma tensão de cisalhamento definida de 0,8 dines / cm ² foi aplicado ajustando a velocidade da bomba peristáltica, a 0,2 ml / min. O funcionamento do sistema inteiro foi depois colocado no 5% incubadora de CO ₂ a 37 ° C e a cells foram autorizados a circular e interagir com a monocamada CE durante 4 horas. No final deste tempo, as células circulantes foram recolhidas, a câmara foi desmontada e os insertos foram removidos tal como descrito no protocolo. As células foram colhidas transmigrou dos poços inferiores, lavadas, ressuspensas em meio fresco e transferidas para culturas de metilcelulose suplementado com factores de crescimento hematopoiético para células (CFC), ensaio de formação de colónias (Figura 3). Como esperado, observou-se um número significativamente maior de CFC tinha migrado através da monocamada CE aos poços contendo 50 ng / ml de SDF-1 do que a poços contendo 5 ng / ml, SDF-1 ou meio sozinho.

Como descrito anteriormente, nenhuma das actuais técnicas in vitro disponíveis para estudar a migração de células são capazes de testar o efeito do microambiente local sobre a capacidade da EC para apoiar o extravasamento de células migratórias. Para ilustrar a forma como isso pode ser conseguido com o dispositivo 3D, nósextravasamento examinados de células hematopoiéticas de circulação através de uma camada de CE, e uma camada de células estromais de medula óssea. Para isso, um segundo encaixe (inferior) contendo uma camada de células estromais, justaposta à inserção superior contendo a monocamada de CE na placa inferior (Figura 4). A experiência foi então efectuada tal como descrito acima e as células foram colhidas transmigrou dos poços e contadas. Os resultados demonstraram que a inserção de uma camada adicional de células estromais, sob a monocamada CE aumentou significativamente a migração de células hematopoiéticas em relação a SDF-1 (Figura 4). Esta constatação é consistente com a noção de que o microambiente local contribui para o recrutamento de células circulantes para o tecido.

(PM). CE são cultivadas sobre a membrana, o qual forma uma barreira entre os compartimentos superior e inferior. Definidas as tensões de cisalhamento são aplicados ao compartimento superior do dispositivo 3D por meio de perfusão, utilizando uma bomba peristáltica de infusão constante. Células circulantes são ou não interagindo (NIC), interagir com a CE transitoriamente ('roll', RC), ou aderir ao EC (AC). Uma subpopulação de células aderentes transmigra através da camada de CE para o compartimento inferior estática do dispositivo (TM), B:. Um desenho vista superior (painel superior) do dispositivo 3D. A vista em corte horizontal (painel inferior) mostra a posição da membrana superior (vermelha), a membrana inferior (verde), e a parte inferior do poço (azul) C:. O isometric vista ilustra as partes integrantes do dispositivo: quatro parafusos, um bloco de acrílico topo, um selo câmara superior, superior e membranas inferiores, fundo o-ring e um 3-bem bloco inferior acrílico D:. Uma fotografia do fluxo 3D câmara ligada a uma bomba peristáltica e uma unidade de troca de gás. O sistema é montado numa câmara estéril e depois transferida para um incubador de cultura de células.

Figura 2. Uma representação esquemática do sistema do dispositivo 3D. O desenho mostra as três paragens necessárias para a montagem do sistema. O meio de cultura é aspirado a partir da entrada pela pressão negativa criada pela bomba peristáltica. O fluxo de meio é desligado por parar # 1 para permitir que as pastilhas sejam colocados dentro do dispositivo. Depois de a câmara está fechada, a bomba é switched novamente e a câmara é imediatamente cheia com o fluido para evitar a secagem das células cultivadas sobre as inserções. Parar # 2 permite meio a ser colocada na unidade de permuta de gás. Parar # 3 permite que o fluxo de ser parado para a ligação de entrada e saída. O fluxo pode ser dirigida no sentido horário ou anti-horário para remover as bolhas de ar através da unidade de troca de gás por meio de um interruptor na bomba.

Figura 3. O dispositivo 3D suporta transmigração SDF-1 mediada por células progenitoras hematopoiéticas, em condições de tensão de corte fisiológicas. A: Três dispositivos (cada uma contendo três poços no compartimento inferior) foram montados e executados em paralelo. Meio sozinho ou meio contendo SDF-1 a 5 ou 50 ng / ml foi adicionada aos poços do compartimento inferior. Murino boAs células da medula ne foram autorizados a circular nos aparelhos de 4 horas. Posteriormente, cada dispositivo foi desmontado e as células que haviam transmigrou para SDF-1 (amarelo) foram colhidos a partir dos poços inferiores, contadas e cultivadas em metilcelulose suplementado com factores de crescimento hematopoiéticos (GF). Quatorze dias depois, as colónias foram classificadas sob o microscópio B:. O número de progenitores (células formadoras de colónias, CFC) recuperado dos compartimentos inferiores é mostrada como a média ± DP de três poços para cada condição. * P <0,05.

Figura 4. O efeito do microambiente sobre as interacções entre as células hematopoiéticas e células endoteliais. A: A ilustração mostra a posição de uma segunda membrana porosa com São cultafibroblastos romal (SF) debaixo da membrana superior com CE. Outras abreviaturas são tal como descrito para a Figura 1A B:.. A membrana adicional (inferior a inserção) com SF cultivadas foi inserido sob a membrana superior C: Três dispositivos (cada uma contendo três poços) foram corridos em paralelo. Meio sozinho ou meio contendo SDF-1 a 50 ng / ml de SDF-1 foram adicionados aos poços do compartimento inferior. As câmaras de controlo negativo omitido SC, SDF-1 ou ambos. Células da medula óssea foram autorizados a circular durante 4 horas a 37 ° C. Depois disso, cada dispositivo foi desmontado e as células foram recolhidas a partir de transmigrou os poços do compartimento inferior e contadas. O número de células recuperadas transmigrou é mostrada como a média ± DP de três poços para cada condição. * P <0,05.

Discussion

O dispositivo 3D pode ser uma tecnologia útil para a investigação em vários campos, incluindo biologia de células-tronco, biologia vascular, hematologia, oncologia, autoimunidade e inflamação. O dispositivo 3D será particularmente útil para investigadores a estudar as células-tronco hematopoiéticas, mesenquimais, neuronais e outra para investigar os mecanismos moleculares que regulam a cada passo da cascata de extravasamento de células estaminais. Pesquisadores que estudam a migração de células também pode usar este dispositivo para examinar os mecanismos migratórios diferentes de T e linfócitos B, monócitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK, e outras células migratórias. Em biologia vascular, o dispositivo irá ser útil para avaliar o efeito do microambiente local sobre a capacidade da EC para apoiar o recrutamento de células e para imitar a barreira hemato-encefálica in vitro. Para os investigadores incidindo sobre a patogênese da doença, o dispositivo pode ser utilizado para estudar a migração de células T citotóxicas no pâncreas durante a diabetes tipo I, o migração dos eosinófilos nos pulmões de pacientes com asma, a migração de neutrófilos, monócitos e linfócitos em locais de inflamação numa variedade de doenças, o recrutamento de células para locais de ferida cura, a interacção das células T citotóxicas, com a neovascularização, e recrutamento de células T citotóxicos em tumores.

O novo dispositivo 3D também será uma ferramenta útil para a ciência translacional e para o desenvolvimento de drogas pré-clínica e triagem. Por exemplo, o dispositivo pode ser utilizado para optimizar a preparação de suspensões de células terapêuticas para administração intravenosa, para testar o recrutamento de células terapêuticas a tecidos lesados ​​contra tecidos normais, e para examinar o papel de órgão específico ou tecido do endotélio e neste microambiente processo. Para o desenvolvimento de medicamentos, o dispositivo pode ser usado para testar os candidatos de drogas que as células tumorais alvo e bloquear cada passo da cascata de extravasão, para testar as células que migram como uma droga proporcionamy veículo no local do tumor, para testar as drogas que regulam a função do endotélio específico do órgão humano ou o microambiente específico de tecido local, e para testar combinações de drogas que regulam diferentes passos da cascata de homing. Finalmente, quando convertido num sistema de elevado rendimento, o dispositivo pode ser usado para o rastreio de pequenas moléculas, peptídeos e anticorpos que se moléculas alvo que medeiam o tráfico de células.

Detalhes técnicos e dicas

Rolamento e adesão sob fluxo são os passos críticos na cascata de extravasamento e contribuem significativamente para a eficiência da migração de células in vivo. Notavelmente, estes passos não contribuem para ensaios estáticos in vitro. No entanto, os ensaios de transmigração estáticos são úteis como controlos negativos em experimentos testando os efeitos da tensão de cisalhamento em função de sobrevivência e de células, incluindo a capacidade da EC para suportar as interacções de baixa afinidade (rolamento) e de aderência firme.

A escolha do meio para experiências em 3D do dispositivo é importante. Mídia conter diferentes fatores de crescimento que podem influenciar a sobrevivência de células circulantes, especialmente durante longos períodos de incubação. Além disso, as concentrações de Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} o que pode influenciar as interacções adesivas sob condições de fluxo fisiológico, variar consideravelmente em meios de cultura comercial. Outros detalhes técnicos que devem ser levados em conta no planejamento de experimentos com o dispositivo 3D são discutidas abaixo.

Selecção da monocamada CE

A assinatura do CE da superfície celular é influenciado por vários parâmetros, incluindo a espécie e tecido de origem e as condições de cultura de células, que deverão ser tomados em consideração na concepção experimental. Alguns CE normalmente utilizados incluem pulmão derivado microvascular CE (LDMVEC), derivadas de medula óssea CE (BMDEC), derivado do cérebro CE (BDEC) e HUVEC.As propriedades do CE também variam com a sua origem. Por exemplo, BMDEC expressam constitutivamente selectinas e VCAM-1, que são responsáveis ​​por laminagem e a adesão, ao passo que BDEC, LDMVEC, e HUVEC não expressam estas moléculas em condições normais. Portanto, inserções revestidas com BDEC, LDMVEC, e HUVEC podem ser pré-tratadas com TNF α (10 ng / mL, 4 horas) ou de outros factores imitam a inflamação e induzir a expressão de moléculas de homing.

Testando interferência com o microambiente local,

Há um interesse crescente na compreensão de como o microambiente local, regula as funções do CE e participa de extravasamento celular. Os nossos resultados demonstram que a inserção de uma monocamada de células estromais, sob a monocamada CE aumenta significativamente o extravasamento de células circulantes. Essa constatação demonstra que a interferência entre CE e estroma aumenta a capacidade da CE para apoiar extravasamento de células circulantes. Moreover, a inserção de células de diferentes microambientes (por exemplo, células estaminais mesenquimais, f ibroblastos, células de tumor de pulmão, astrócitos) podem contribuir para imitar leitos vasculares específicos. Em particular, uma combinação de derivado do cérebro CE e astrócitos poderia ser uma abordagem útil para imitar a barreira sangue-cérebro. Do mesmo modo, as células obtidas a partir de pacientes ou células normais manipuladas in vitro, pode ajudar a imitar um microambiente doente específico.

Nos nossos estudos, utilizou-se pastilhas mais baixos com as células do estroma cultivadas a 50% de confluência. Embora a densidade óptima de células micro-ambientais para as inserções dependerá dos objectivos do estudo, o que pode ser facilmente manipulada e controlada.

Seleção de uma taxa de tensão de cisalhamento

A tensão de corte de 0,8 dines / cm ² foi usado aqui, porque isso tem sido demonstrado por Von Andrian et ai. ser a tensão de cisalhamento na microvasculatur medula ósseae, em que as células progenitoras hematopoiéticas sair da circulação e entrar nos tecidos sob condições fisiológicas normais ^15. Em contraste, os níveis mais altos de tensão de corte são observados em navios maiores, onde o extravasamento de células é limitado. Por conseguinte, as elevadas taxas de cisalhamento podem ser utilizados como controlos adicionais para experiências examinando o extravasamento de vários tipos de células.

A sobrevivência das células sob tensão de cisalhamento depende de vários fatores, incluindo o tipo de célula e os tratamentos com células ex vivo (Goncharova et al., Observações não publicadas), e deve, portanto, ser cuidadosamente avaliados durante o teste. Sensibilidade celular a diferentes níveis de tensão de cisalhamento (shear stress resistência) pode ser avaliada por meio da programação da bomba peristáltica, para aumentar a taxa de tensão de cisalhamento em incrementos de 0,8 dines / cm ² a 6 dines / cm ^2. Durante estes testes, as células podem ser recolhidos periodicamente a partir da câmara de permuta de gás para controlar a morte celular utilizando comodiz tais como exclusão de azul de tripano, a anexina V e coloração PI, e a expressão do marcador de apoptose.

Se as experiências foram concebidas para testar a resistência à tensão de cisalhamento de células manipuladas ex vivo ou células derivadas de parênquima, recomenda-se que os controlos positivos adicionais, tais como células de sangue suportados, estão incluídos nas experiências.

A selecção do tamanho dos poros da pastilha e revestimento de ECM

Insere estão disponíveis com vários tamanhos de poro (3, 5 e 8 mm). A escolha do tamanho dos poros vai depender do tamanho e propriedades das células circulantes teste, que também é o caso para os ensaios estáticos Transwell. As inserções com um tamanho de poro grande (8 um) são recomendados para testar o extravasamento de grandes células, tais como células tumorais de origem epitelial. Leucócitos ou células-tronco hematopoiéticas são mais comumente testado com cinco inserções de poros mM e 3 mM insere poros são mais reservados para testar extravasamento de scélulas maller. No entanto, o tamanho da célula de ensaio por si só não é o único factor importante e recomendamos testar pastilhas com várias dimensões de poros.

Em nossos estudos iniciais, testamos vários ECM por sua capacidade de suportar o crescimento da CE sobre as inserções e para resistir a tensão de cisalhamento para> 4 hr. O ECM testadas incluíram Matrigel, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, colagénio do tipo I, hidrogel, Meta-queratina I, II, III, IV, e extracelular. Os melhores resultados para o crescimento do CE foram obtidos com extracelular, fibronectina e colagénio. No entanto, nas nossas mãos, extracelular de 0,8 ug / cm ^2, reduziu significativamente a transmigração de células de teste através da membrana. Por isso, agora utilizam fibronectina (5 ug / cm ²⁾ ou colagénio (5 mg / cm ²⁾ para o revestimento de pastilhas. No entanto, a escolha óptima da ECM serão provavelmente influenciados pelo tipo de CE Transmigratory e as propriedades das células de ensaio. A experiência preliminar deve ser realizada para testar a integrity da monocamada de EC cultivadas em ECM seleccionado. Por exemplo, colocar insertos pré-revestidas com monocamadas EC em pratos de Petri cheia de meio de cultura, colocar os pratos num agitador para criar tensões de cisalhamento (ajuste baixo), e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 12 horas. A integridade do EC após a exposição ao stress de cisalhamento pode ser avaliada utilizando coloração com violeta de cristal.

Seleção de concentrações de células de teste ideais

A capacidade das células de teste para a circulação sair depende de muitas características específicas de cada tipo de célula. Para gerar resultados estatisticamente significativos, a densidade de células circulantes tem de ser optimizada para garantir que um número suficiente de células migram para os poços de controlo positivo. Portanto, recomendamos a realização de testes iniciais com uma gama de densidades celulares (por exemplo, 10 ³ / ml a 10 ⁷ / ml) para se entender a relação entre o número de células carregado no sistema eo número de células que sofrem a transmigração.

Além disso, a concentração óptima de circulação podem ser diferentes para o mesmo tipo de célula obtido a partir de fontes diferentes. Por exemplo, as células CD34 ⁺ são uma população celular heterogénea contendo ambas as células estaminais hematopoiéticas e progenitoras comprometidas específicos de linhagem. Elas podem ser obtidas a partir de medula óssea, sangue periférico mobilizado e sangue de cordão umbilical. As células CD34 ⁺ derivadas destas três fontes possuem diferentes capacidades de direcção e enxertando ^16-18, de modo a testar as condições para estas células no dispositivo 3D deve ser optimizado antes de um estudo de escala completa.

Selecção do tempo de circulação celular ideal

O tempo de circulação ideal deve ser determinada empiricamente para cada tipo de célula. O tempo mínimo necessário para a circulação pode ser extrapolada a partir dos resultados dos ensaios de migração estáticos, mas isto pode ser extended quando as células são submetidas a tensão de cisalhamento. Estudos-piloto de testes tempos de circulação entre 4 e 96 horas são recomendados.

A unidade de permuta de gás

A finalidade principal da unidade de permuta de gás é manter a concentração óptima de CO ₂ no meio que circula através do dispositivo 3D, semelhante às configurações em incubadoras de cultura de tecidos padrão. A unidade de troca de gás pode também ser utilizada para a adição de células de teste e os compostos e para a recolha de amostras de sondas e durante o ensaio.

Avaliação do número de células de teste

Células circulantes podem ser amostrados em momentos diferentes durante a experiência por meio da unidade de troca de gás. No final do experimento, as células restantes na circulação poderia ser coletadas a partir da tomada. Quando o dispositivo é desmontado 3D, no final da experiência, as células transmigrou pode ser colhida a partir dos poços inferiores e recolhido fou análise posterior. Se as células de entrada são sem rótulo, as células transmigrou pode ser manchado com azul de tripano e células vivas / mortas enumerados microscopicamente. Alternativamente, as células de entrada poderia ser rotulado com um dos muitos "célula" rastreadores corantes disponíveis para imagens de células vivas antes do carregamento para o dispositivo 3D, neste caso, o transmigrou colhidas células devem ser lisadas para a quantificação de fluorescência.

A selecção do tamanho da amostra óptima

Para permitir uma análise estatística, um tamanho de amostra deve ser seleccionado que irá proporcionar aproximadamente 80% de potência para detectar uma diferença hipotética nas alterações percentuais médias entre os dois grupos, quando testados a um nível de significância de 0,05 usando um teste t de duas faces. Com base na experiência com as células de medula óssea, utilizam-se três poços por condição experimental para os experimentos de dispositivo 3D. No entanto, o tamanho da amostra óptima variará de acordo com o objectivo da experiência e deve ser determinada empirically. Vários testes estatísticos de regressão, testes t de duas faces, e as análises de variação pode ser utilizada para verificar a relevância estatística dos resultados.

Selecção das quimiocinas

Tal como para todos os ensaios de transmigração, a escolha do quimioatractor será ditada pelas propriedades das células de teste e com o objectivo do estudo. SDF-1 é um quimioatractor bem estabelecido para as células hematopoiéticas. Nas nossas mãos, uma concentração de 50 ng / ml de SDF-1 era óptima para estimular o extravasamento de osso células progenitoras hematopoiéticas derivadas de medula. Nós também usamos C3a e bFGF como chemoattractants para células-tronco mesenquimais ^19. No entanto, recomendamos titulação de cada um de quimiocinas e cross-titulação combinações de quimiocinas para identificar a faixa de concentração ideal antes de um estudo em grande escala. Para certos tipos de células, uma combinação de factores quimiotáticos pode ser benéfica. Se quimiocinas para células de teste específicos são desconhecidos ou não disponíveis, conditioned meios de linfócitos estimulados, os fibroblastos e outras células podem ser usadas como fonte de agentes quimioatractivos.

Selecção dos parâmetros de leitura

A versatilidade do dispositivo 3D irá expandir o tipo de experiências de transmigração que podem ser executadas, eo sucesso das experiências dependerá consideração pensativa e design dos parâmetros de leitura. Como regra, as células recolhidas a partir do compartimento superior (circulante) e o compartimento inferior (estático) devem ser testadas para a viabilidade ao mesmo tempo que a contagem das células. Algumas células possuem baixa tolerância à tensão de corte fisiológicas observadas na microvasculatura. Neste caso, o número de células mortas será aumentada no compartimento superior. O número de células aderentes presos (ou preso) na camada de CE, pode ser avaliado pela imunocitoquímica de marcadores expressos especificamente nas células de ensaio. Os anticorpos específicos para CD31 e vWF pode ser utilizadaCE para detectar e para permitir a discriminação entre as células de teste e EC. Além disso, a integridade da monocamada de CE deve ser controlada no final de cada teste.

Os tipos de análises realizadas com as células coletadas dependerá objetivos experimentais dos investigadores, mas podem incluir análise de mudanças na expressão gênica por microarrays e qPCR, a expressão de moléculas de superfície por meio de análise FACS, a ativação de vias de sinalização por FACS e Western blotting, e fator de secreção por ELISA. Uma enorme variedade de testes funcionais são possíveis nas células recolhidas in vitro, tal como evidenciado pelo nosso próprio trabalho, no qual as células de cultura de medula óssea transmigrou para enumerar as células progenitoras hematopoiéticas (Figura 3). As amostras também podem ser testados em uma variedade de ensaios in vivo.

Um parâmetro importante que pode ajudar a prever o comportamento das células de teste in vivo é a tendênciacia de algumas células para formar agregados sob diferentes taxas de cisalhamento. Por exemplo, células terapêuticas que se submetem a formação de agregados no dispositivo 3D pode ter uma maior tendência para formar grumos após a administração intravenosa e causar obstrução vascular aguda in vivo (Goncharova et ai., Observações não publicadas). A formação de agregados pode ser monitorizada por amostragem microscopicamente as células de teste durante ou após a conclusão do experimento dispositivo 3D.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Chamber	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gas exchange unit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inserts	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collagen Bovine,Type I	BD Biosciences	354231
Hydrochloric Acid 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
Trypsin	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectin, human , nature	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ScienCell	1000
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells	ScienCell	1001
Trypan Blue	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Iodide Staining Solutuion	BD Pharmingen	# 556463
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	StemCell	CB007F
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Mouse Methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antibody	abcam	C# ab11713
Petry dish (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml tubes	VWR Fisher	21008 - 918
Tissue culture flasks 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissecting forceps, curved	VWR	82027-384
1,000 μl Pipette tips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipette tips	VWR	37001-530
Equipment
Peristaltic pump	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3