Summary
Det tredimensionale strømningskammeret enhed er en roman
Abstract
Ekstravasation af cirkulerende celler fra blodbanen spiller en central rolle i mange fysiologiske og patofysiologiske processer, herunder stamceller homing og tumormetastase. Den tredimensionale flowkammer enhed (herefter 3D-enhed) er en roman in vitro-teknologi, der genskaber fysiologisk forskydningsspænding og tillader hvert trin af cellen ekstravasation kaskade skal kvantificeres. 3D anordning består af et øvre kammer, hvor cellerne af interesse cirkulere under forskydningsspænding, og et nedre rum af statiske brønde, der indeholder kemoattrahenter af interesse. De to rum er adskilt af porøse indsatse overtrukket med et monolag af endothelceller (EF). En valgfri anden indsats med microenvironmental celler af interesse kan placeres umiddelbart under EF-lag. En gas udveksling enhed giver den optimale CO 2 spænding skal vedligeholdes og giver et adgangspunkt til at tilføje eller trække celler eller forbindelser undereksperiment. Testcellerne cirkulere i det øvre rum i den ønskede forskydningsspænding (strømningshastighed) kontrolleres af en peristaltisk pumpe. Ved afslutningen af forsøget, er de cirkulerende og migrerede celler opsamles til yderligere analyser. 3D enhed kan bruges til at undersøge celle rullende på og vedhæftning til EF under forskydningsspænding, transmigration reaktion på chemokin gradienter, modstandsdygtighed over for forskydningsspænding, klyngedannelse og celleoverlevelse. Desuden giver den valgfri anden insert virkningerne af krydstale mellem EF og microenvironmental celler, der skal undersøges. De translationelle anvendelser af 3D anordning omfatter afprøvning af lægemiddelkandidater rettet cellemigrering og forudsige in vivo-adfærd af celler efter intravenøs injektion. Således roman 3D enheden er et alsidigt og billigt værktøj til at studere de molekylære mekanismer, der medierer cellulær ekstravasation.
Introduction
Celle ekstravasation er den proces, hvorved cirkulerende celler forlader blodbanen og er en kritisk komponent i mange fysiologiske reaktioner i kroppen. Processen er også vigtigt for vævsregeneration, som for eksempel når terapeutiske celler mobiliseres fra vævet ind i blodkarrene (eller injiceres intravenøst) vandrer gennem karrene og afslutte cirkulation til steder med skade eller degeneration. Ekstravasation er også en kritisk komponent i patogenesen af mange sygdomme, herunder inflammation, immunafvisning, autoimmunitet, og tumormetastase.
Ekstravasation er en kompleks multi-trins proces, der involverer interaktionen af cirkulerende celler med endotelceller (EF) under betingelser med fysiologisk flow. Fremgangsmåden omfatter (a) celle rullende, (b) fast vedhæftning til den luminale overflade af EF, og (c) transmigration i EF. Vigtigere er de enkelte trin i ekstravasation kaskade reguleret af en delmængde af cell typespecifikke og artsspecifikke molekyler. Men de detaljerede molekylære mekanismer, der regulerer ekstravasation af specifikke celledelmængder ikke godt forstået, hovedsageligt på grund af tekniske vanskeligheder med opridset betingelserne i blodbanen. Romanen 3D enhed, der beskrives her, er designet til at overvinde disse tekniske udfordringer og tillade eksperimenter, der skal udføres, der vil forbedre vores forståelse af biologi celle migration.
De molekyler, der medierer celle migration er vigtige terapeutiske mål. En detaljeret forståelse af de molekylære begivenheder, der styrer migration af specifikke celletyper vil hjælpe med at identificere nye mål for den terapeutiske fremme eller hæmning af ekstravasation. For eksempel ville indgreb, der øger migrationen af terapeutiske stamceller (uanset afledt fra voksne, neonatale eller endda fra fostervæv) mod steder med skade eller degenerering være af stor nytte i vævsregeneration.Der er stigende interesse i in vitro generering af terapeutiske stamceller, herunder celler afledt af pluripotente kilder, og i ex vivo manipulerede voksne stamceller (udvidet genetisk manipuleret, og forbehandlet med forskellige enzymer) 1. Således er der behov for nye teknologier for at evaluere kvaliteten af stamcellerne, før de anvendes til terapeutiske formål. Blandt andre parametre, skal cellerne være i stand til effektivt at afslutte kredsløbet, fordi behandlinger for multifokale lidelser kan kræve intravenøs administration af stamcellerne 2. Faktisk en af de nuværende udfordringer i stamcellebiologi er at overvinde den ekstremt lave effektivitet, hvormed stamceller hjem til steder med vævsskade 3-6, hvilket understreger behovet for at løse dette hul i vores forståelse af stamceller migration. I modsætning hertil, at strategier blok cellemigration ved at målrette specifikke målsøgende molekyler ville være nyttigt til behandling af iinflammatorisk og autoimmune sygdomme samt metastatisk cancer. Således at forstå de molekylære mekanismer, som medierer interaktionerne mellem cirkulerende celler og EF i cellemigrering og ekstravasation er relevant for translationel medicin og lægemiddelforskning samt grundlæggende videnskab.
Der er i øjeblikket en række metoder til rådighed til at studere forskellige aspekter af cellemigrering. Disse fremgangsmåder har mangler, som kan overvindes med den nye 3D-enhed.
Dyremodeller:
Dyremodeller, såsom immunsvækkede mus og genetisk manipulerede mus, har været nyttige redskaber til at studere migration af humane celler in vivo. Men en væsentlig ulempe ved disse modeller er, at humane celler interagerer dårligt med adhæsionsmolekyler stede på muse EF, delvis på grund af artsspecifikke sekvens forskelle i mange celleoverflademolekyler. Således, at anvendelsen af gnavere studerehumane celle migration er usandsynligt, at authentically afspejler begivenhederne i humane organspecifikke kar. Desuden er in vivo modeller ikke egnet til high-throughput screening af lægemiddelkandidater. Den konventionelle in vivo modeller bruger til at studere celle homing ikke diskriminerer mellem de forskellige trin i ekstravasation kaskade, hvilket gør det vanskeligt at identificere og målrette nye målsøgende molekyler. Den intravital mikroskopi fremgangsmåde blev udviklet for at imødekomme dette behov og har været oplysende, men denne teknik er yderst tids-og arbejdskrævende 7,8.
Statiske transmigration assays:
Transwell eller Boyden kammer assays foranstaltning cellevandring tværs af en porøs membran og er almindeligt anvendt i migrationstudier. Assayet har den fordel, at det kan bruges til at studere ikke blot cellemotilitet og celle-ekstracellulære matrix (ECM) interaktioner, men også chemokin-medieret migration af cellerpå tværs af en EF monolag dyrket på de porøse membraner. Desværre fænotype og funktion af EF under statiske forhold adskiller sig væsentligt fra dem under fysiologiske flow 9,10. Således har de kemotaktiske begivenheder, der opstår i Transwell analyser ikke trofast efterligner samspillet mellem migrerende celler og EF under shear stress. Derudover kommer "rullende" trin af målsøgende kaskade, som tilføjer en ekstra dimension af selektivitet til den samlede proces, ikke forekomme i statiske Transwell assays. Medens denne teknologi tillader kvantitativ evaluering af chemokin-medieret cellemigrering via EF monolag, er det begrænset af sin manglende evne til at give den forskydningsspænding, der efterligner blodgennemstrømningen in vivo.
Assays under forskydningsspænding:
Væg forskydningsspænding er kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen EF funktion 9,10. Shear kræfter inducerer hurtig aktivering af signalleringskaskader, transcription faktorer og forskellen i genekspression i EF 11,12. Denne information har ført til udviklingen af den næste generation af adhæsionsassays - parallel laminar flow kamre og kapillærer - at undersøge rullende og vedhæftning af celler til EF under forhold med forskydningsspænding 7,13. Den begrænsende faktor for disse analyser er, at de kan måle kun rullende og vedhæftning, men ikke skelner mellem tilhænger celle, der ville gå på at transmigrate og kraftige celle, der "anholdt" på EF-monolag og ville ikke transmigrate. Desuden kan disse assays ikke måle migrering af celler mod et chemokin-gradient.
Adskillige rapporter har beskrevet evne adhærente celler til at kravle under en EF-monolag dyrket på objektglas under betingelser for flow 14. De begrænsninger i dette kravlende teknik omfatter: den analyserer kun et begrænset antal celler, det er ikke-kvantitativ, den analyserer celle gennemsøgning på matrixen og CELl overflade, men ikke migrering til en kemotaktisk gradient, og det tillader ikke transmigrated celler, der skal isoleres. Selv dette assay har den fordel at anvende forskydningsspænding til EF monolaget, kan det ikke kvantificere migration af celler mod et chemokin-gradient.
Den nye 3D-teknologi beskrevet her overvinder mange af disse mangler ved at kombinere forskydningskraft (øverste rum) med en statisk chemokin gradient (nedre rum) og tillader kvantitativ evaluering af hvert trin i ekstravasation kaskade (figur 1). Enheden kan også bruges til at undersøge, hvordan krydstale mellem EF og mikromiljø påvirker evnen af EU til at understøtte ekstravasation af cirkulerende celler. Følgende protokol beskriver trin-for-trin metode til at bruge 3D strømningskammeret enhed.
Protocol
1.. Forbered øvre og nedre Indsætter for cellevækst af kollagen Coating
- Beregne antallet af skær nødvendige for eksperimentet. Placer hver indsats i en separat steril petriskål (35 x 10 mm), og steriliseres ved bestråling (11 Gy).
- Forbered kollagen opløsning til belægning af membraner: 50 ug / ml, 154 gl pr indsatsen (indsæt overfladeareal 1,54 cm2).
- Placere flere dråber (~ 20 ul per dråbe) af kollagen løsning i en cirkel på overfladen af indsatsen membran (lad ikke pipettespidsen berøre overfladen), og derefter tilsættes forsigtigt resten af portionen til at danne én stor dråbe på membranoverflade. Sørg for, at collagen opløsningen forbliver halvkugleformet, og ikke løbe fra membranens overflade.
- Dæk petriskål med låg og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur på en flad overflade.
- Aspirer kollagen opløsningen og vaskes membranen en gang ved at dække med 160 pi PBS.
- Aspirate PBS og erstatte låget. Hvis du bruger den samme dag, skal du placere petriskålen på et tørt sted ved stuetemperatur. Ellers placere fadet ved 4 ° C og bruge indsatsen inden for 7 dage.
2.. Kultur endotelceller på Upper Indsætter
- Forbered EF suspension i den ønskede dyrkningsmedium. Sørg for, at cellelevedygtigheden er> 98% og bruge med det samme.
Bemærk: menneskets navlevene EC (HUVEC), 4 x 10 5 celler i 160 pi per rum bruges.
- Tag petriskåle med collagen-belagte skær udarbejdet i punkt 1, ikke fjerne indsatser fra skålene. Placere flere små dråber af cellesuspensionen (ca. 20 ul pr dråbe) i en cirkel på overfladen af kollagen-coatede membran (ikke lade pipettespidsen berøre overfladen) og derefter forsigtigt tilsættes resten af cellesuspensionen til dannelse en stor dråbe. Sørg for, at cellen suspensionen forbliver Hemis pherical og ikke løbe fra membranens overflade.
- Udskift låg og anbring forsigtigt retterne i en 5% CO 2 cellekultur inkubator og inkuberes (uden omrystning) ved 37 ° C i 30 min for at tillade cellerne at fastgøre til membranen.
- Forsigtigt tilsættes 5 ml dyrkningsmedium til hver petriskål sikrer, at indsatsen forbliver på bunden af skålen og er helt dækket af mediet. Sæt låg og omhyggeligt sætte retter tilbage i inkubatoren. Kultur cellerne ved 37 ° C natten over.
- Brug den samme metode til at forberede den anden (ekstraudstyr) lavere insert med celler, der repræsenterer det lokale mikromiljø, som vil blive placeret under indsatsen, der indeholder EF-lag.
Bemærk: Hvis de nedre skær er inkluderet i forsøgene, er de øvre og nedre skær først forbundet med hinanden før placere skærene i 3D enhed (figur 4B).
e "> 3. Saml 3D Flow Chamber Device- Skru sammen de øvre og nedre plader, forbinde pladerne gasbørsen enheden med slanger, placeres den samlede indretning i en ren plastpose, og sterilisere posen og indholdet ved bestråling (11 Gy).
- Fjern en bakke-shelf fra cellekultur inkubator, sted i en steril vævskultur hætte, spray med 70% ethanol, tørre, og derefter dække bakken med en stor steril serviet.
- Placer bestrålede plasticpose ind i hætte, skal du fjerne enheden fra posen og sted på den sterile inkubator bakken. Slut enheden til den peristaltiske pumpe med den medfølgende slange. Program pumpen en optimal hastighed på 0,2 ml / min.
Bemærk: For at tilslutte pumpen med stikkontakten, ekstrudere elektriske ledning gennem hullet i bagsiden af inkubatoren. Brug røver stik rundt i ledningen for at sikre, at hullet er lufttæt.
4.. Prime 3D Flow Chamber Device
- Afbryd indløbsrøret fra stikkontakten ved at trække metal nål fra slangen (brug små sterile servietter til at opretholde sterilitet af slangen). Brug metal nål forbundet til slangen som en "indgang" og frakoblet ende af slangen som et "afløb". Placer metal nål indløb ind i 15 ml rør med medierne placere stikkontakten i den tomme 15 ml rør.
- Tænd pumpen, så flowet uret og indstille strømningshastigheden på 0,2 ml / min. Tillad undertrykket at trække mediet fra 15 ml indløbsrøret ind i rørledningen og standse pumpen, når mediet når enden af slangen umiddelbart før den forbindelse til enheden (figur 2, Stop # 1).
- Skru de øvre og nedre plader af enheden. Fjern forsigtigt den øverste plade og sted 1.500 - 1.550 pi medium (enten medium alene eller plus de eksperimentelle kemokiner) i de nedre brønde. Sørg brønd indeholder tilstrækkelig medium til dannelse af en halvkugle, der når ca 1 - 2 mm over den nedre plade.
- Overfør den klargjorte insert fra petriskålen til brøndene i den nederste plade med sterile pincetter, og sørg for at ingen bobler fanget under indlæggene. Aspirer ethvert medium, der vises på overfladen af den nedre plade for at sikre, at pladen forbliver tør. Anbring den øverste plade tilbage på den nederste plade og tilslut pladerne ved hjælp af skruerne.
- Umiddelbart tænde den peristaltiske pumpe og tillade medium at strømme gennem 3D enhed. Ophøje udløbsenden af anordningen og opretholde kammeret i denne position for at forhindre dannelse af bobler i rummet mellem pladerne.
- Lad mediet at fylde kammeret og slangen forbinder kammeret til gasbørsen enhed. Stop pumpen umiddelbart før mediet når gassen exchange enhed (figur 2; Stop # 2). Sted 3 ml medium i gasudveksling enhed, tænde pumpen, og tillade luftbobler at undslippe gennem gasbørsen enhed. Ophøje gasbørsen enhed at tillade mediet at fylde slangen forlader gasudveksling enhed og stoppe pumpen, når mediet når 2 - 3 cm inden udgangen af udløbsslangen (figur 2, Stop # 3).
- Slut indløbet metal nål til stikkontakten ved hjælp af små sterile servietter. Omprogrammere pumpen, så mediet flyder i den modsatte retning (med uret) mod gasbørsen enhed og sikre, at eventuelle luftbobler fjernes, når de når gasbørsen enheden. Kontrollere, at ingen luftbobler forbliver i systemet.
- Omprogrammere pumpen, så mediet strømme mod uret. Tilføj 100 ul test cellesuspension til gasbørsen enhed. Luk låget på gasbørsen enhed, skal du placere bakken med den fungerende system tilbage i kuvøsen, og tillade testcellerne at circulate i 3D apparat ved 37 ° C i det ønskede tidsrum.
Bemærk: Rens elektriske ledning af pumpen med 70% ethanol og placere det inde i inkubatoren.
5.. Afslut Test og indsamle prøver til analyse
- Fjern skuffen med det fungerende system fra inkubatoren og plads i hætten. Stop pumpen, afbryde indløb og udløb, og placer enderne til tomme sterile 15 ml rør.
- Tænd pumpen og indsamle cellesuspensionen fra systemet, sted cellesuspensionen på is, hvis det er hensigtsmæssigt, indtil anvendelse.
- Skil kammeret ved at fjerne skruerne og løft ned fra den øvre plade. Fjern skær fra den nedre plade og overføre dem til petriskåle.
Bemærk: Indsatserne kan farves til at visualisere og tælle celler in situ (krystalviolet 0,05% i dH 2 O) eller trypsinbehandles at indsamle EF for yderligeretestning.
- Fjern mediet og celler fra de nedre brønde i rør og centrifugeres i 5 minutter ved 210 x g.. Fjern supernatanten, vaske og cellerne som ønsket, og behandle celler ifølge de specifikke eksperimentelle mål (diskuteret yderligere nedenfor).
Representative Results
Den murine knoglemarv afledt EF line STR-12 blev dyrket på skær med 5 um porer. Satsen for EF vækst blev overvåget under et mikroskop, og da EF var 100% konfluente, blev inserterne overført til brøndene i det nedre kammer af 3D enhed. Umiddelbart før placere indsatser, blev brøndene i det nedre kammer fyldt med dyrkningsmedium alene (negativ kontrol) eller med medium suppleret med stromal celle-afledte faktor-1 (SDF-1, 5 ng / ml og 50 ng / ml). Derefter blev 3D anordning samles og kammeret blev fyldt med medium som beskrevet i protokollen. Testcellerne skal cirkuleres i den øvre kammer af enheden var frisk høstet murine knoglemarvsceller (3,5 x 10 6 celler pr kammer). En defineret forskydningsspænding på 0,8 dyn / cm 2 blev anvendt ved at indstille den peristaltiske pumpe hastighed på 0,2 ml / min. Hele fungerende system blev derefter anbragt i 5% CO2-inkubator ved 37 ° C og CELLS fik lov til at cirkulere og interagere med EF monolag for 4 timer. Ved slutningen af denne tid, blev de cirkulerende celler opsamlet, kammeret blev skilt ad, og skærene blev fjernet som beskrevet i protokollen. De transmigrated Cellerne blev høstet fra de lavere brønde, vaskes, resuspenderes i frisk medium og overført til methylcelluloseskiver kulturer suppleret med hæmatopoietiske vækstfaktorer for koloni-dannende celle (CFC)-assay (figur 3). Som forventet, fandt vi en signifikant højere antal CFC havde vandrede over EF-monolag til brøndene indeholdende 50 ng / ml SDF-1 end til brønde indeholdende 5 ng / ml SDF-1 eller medium alene.
Som vi beskrev tidligere, ingen af de nuværende in vitro teknikker til rådighed til at studere cellemigrering er i stand til at teste effekten af den lokale mikromiljø på evnen af EF understøtte ekstravasation af migrerende celler. At illustrere, hvordan dette kan opnås med 3D enhed, viundersøgte ekstravasation af cirkulerende hæmatopoietiske celler tværs et lag af EC og et lag af stromale knoglemarvsceller. Til dette blev en anden (lavere) insert indeholdende et lag af stromaceller sidestillet til den øvre insert indeholdende EF monolag i den nederste plade (Figur 4). Forsøget blev derefter udført som beskrevet ovenfor, og de transmigrated celler blev høstet fra brøndene og tælles. Resultaterne viste, at indsættelsen af en ekstra lag af stromaceller under EF monolag signifikant øget migration af hæmatopoietiske celler mod SDF-1 (figur 4). Dette fund er i overensstemmelse med den opfattelse, at den lokale mikromiljø bidrager til rekruttering af cirkulerende celler til væv.
Figur 2. En skematisk repræsentation af 3D-enhedens systemet. Tegningen viser de tre stop kræves for at samle systemet. Dyrkningsmediet suges fra indløbet af det negative tryk, der skabes af den peristaltiske pumpe. Strømmen af slukningsmidlet slukket af Stop # 1 for at give de indsatser, der skal anbringes i indretningen. Efter kammeret er lukket, er pumpen koblerChed igen, og kammeret er straks fyldt med medium for at forhindre udtørring af celler dyrket på skær. Stop # 2 giver medium, der skal placeres i gasbørs enheden. Stop # 3 giver flowet skal stoppes for tilslutning af ind-og udløb. Flowet kan rettes med uret eller mod uret for at fjerne luftbobler gennem gassen centralenheden ved hjælp af en kontakt på pumpen.
Figur 3. 3D Enheden understøtter SDF-1-medieret transmigration hæmatopoietiske progenitorer under betingelser med fysiologisk forskydningsspænding. A: Tre enheder (hver indeholdende 3 brønde i det nedre kammer) blev samlet og parallelt. Medium alene eller medium indeholdende SDF-1 ved 5 eller 50 ng / ml blev tilsat til det nedre kammer brønde. Murine bone marv celler fik lov til at cirkulere i anordningerne til 4 timer. Derefter blev hver enhed demonteres og de celler, der havde transmigrated mod SDF-1 (gul) blev opsamlet fra de lavere brønde, tælles, og dyrket i methylcellulose suppleret med hæmatopoietiske vækstfaktorer (GF). Fjorten dage senere blev kolonierne scoret under mikroskop B:. Antallet af stamceller (kolonidannende celler, CFC) genvundet fra de nedre kamre er vist som middelværdi ± SD af tre brønde pr tilstand. * P <0,05.
Figur 4.. Virkningen af mikromiljøet på interaktioner mellem hæmatopoietiske celler og endotelceller. A: Illustrationen viser placeringen af en anden porøse membran med kulturperler stRomal fibroblaster (SF) under den øverste membran med EF. Andre forkortelser er som beskrevet for figur 1A B:.. Den yderligere membran (lavere indsæt) med dyrkede SF blev indsat under den øvre membran C: Tre enheder (hver indeholdende 3 brønde) blev kørt parallelt. Medium alene eller medium indeholdende SDF-1 ved 50 ng / ml SDF-1 blev tilsat til det nedre kammer brønde. Den negative kontrol kamre udeladt SC, SDF-1, eller begge. Knoglemarvsceller fik lov til at cirkulere i 4 timer ved 37 ° C. Derefter blev hver enhed adskilt og transmigrated Cellerne blev opsamlet fra det nedre kammer brønde og tælles. Antallet af transmigrated genvundne celler er vist som middelværdi ± SD af tre brønde pr tilstand. * P <0,05.
Discussion
Den 3D-enhed kan være en nyttig teknologi til forskning på forskellige områder, herunder stamceller biologi, vaskulær biologi, hæmatologi, onkologi, autoimmunitet og inflammation. Den 3D-enhed vil være særlig nyttig for forskere studerer bloddannende, mesenkymale, neurale og andre stamceller til at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer de enkelte trin i stamceller ekstravasation kaskade. Forskere studerer cellevandring kan også bruge denne enhed til at undersøge de forskellige vandrende mekanismer T-og B-lymfocytter, monocytter, neutrofile, eosinofile, NK-celler og andre vandrende celler. Vaskulær biologi, vil enheden være nyttige til vurdering af virkningen af den lokale mikromiljø på evnen af EF understøtte celle rekruttering og at efterligne blodhjernebarrieren in vitro. For forskere fokus på sygdommen patogenese, kan anordningen anvendes til at studere migrationen af cytotoksiske T-celler i bugspytkirtlen under type I-diabetes, den migration af eosinofiler i lungerne af astmapatienter, migration af neutrofile, monocytter og lymfocytter i inflammationssteder i en række lidelser, rekrutteringen af celler til sårheling sites, samspillet af cytotoksiske T-celler med neovaskulatur, og rekruttering af cytotoksiske T-celler i tumorer.
Romanen 3D-enhed vil også være et nyttigt redskab for translationel videnskab og til præklinisk udvikling af lægemidler og screening. For eksempel kan indretningen anvendes til at optimere fremstillingen af terapeutiske cellesuspensioner til intravenøs indgivelse, for at teste rekruttering af terapeutiske celler til tilskadekomne væv versus normale væv, og at undersøge, hvilken rolle de specifikke organ eller væv endotel og mikromiljø i dette proces. For udvikling af medicin, kan enheden bruges til at teste lægemiddelkandidater rettet tumorceller og blokere hvert trin af ekstravasation kaskade, for at teste migrerende celler som et lægemiddel leverery køretøj til tumorsteder, for at teste lægemidler, der regulerer funktionen af humane organspecifik endotel eller lokale vævsspecifik mikromiljø, og at teste kombinationer af lægemidler, der regulerer forskellige trin i målsøgende kaskade. Endelig, når omdannet til en high-throughput-system, kan indretningen anvendes til screening små molekyler, peptider og antistoffer, målmolekyler medierer celle trafficking.
Tekniske detaljer og tips
Rolling og vedhæftning under flow er de kritiske trin i ekstravasation kaskade og bidrage væsentligt til effektiviteten af cellevandring in vivo. Især har disse trin ikke bidrager til statiske analyser in vitro. Men statiske transmigration assays er nyttige som negative kontroller i forsøg teste effekten af shear stress på celle overlevelse og funktion, herunder evne til EF til at understøtte lav affinitet interaktioner (rullende) og fast vedhæftning.
Valget af medium for eksperimenter i 3D enhed er vigtig. Medier indeholder forskellige vækstfaktorer, som kan have indflydelse på overlevelsen af cirkulerende celler, især under lange inkubationstider. Desuden + koncentrationerne af Ca2 og Mg2 +, hvilket kan påvirke adhæsive interaktioner under betingelser med fysiologisk flow, varierer betydeligt i kommercielle kulturmedier. Andre tekniske detaljer, der bør tages i betragtning ved planlægning eksperimenter med 3D-enheden diskuteres nedenfor.
Udvælgelse af EF monolag
Celleoverfladen undertegnelse af EF påvirkes af forskellige parametre, bl.a. de arter og væv for oprindelse og celledyrkningsbetingelser, der bør tages højde for i den eksperimentelle design. Nogle almindeligt anvendte EF omfatter lunge-afledte mikrovaskulære EC (LDMVEC), knoglemarv afledt EF (BMDEC), hjerne-afledt EF (BDEC) og HUVEC.Egenskaberne for EF også variere med deres oprindelse. For eksempel, mens BMDEC konstitutivt udtrykker selectiner og VCAM-1, som er ansvarlige for rullende og vedhæftning, BDEC, LDMVEC og HUVEC udtrykker ikke disse molekyler under normale forhold. Derfor kan indsatse overtrukket med BDEC, LDMVEC, og HUVEC forbehandles med TNF α (10 ng / ml, 4 timer) eller andre faktorer at efterligne betændelse og inducere ekspression af målsøgende molekyler.
Testning krydstale med den lokale mikromiljø
Der er stigende interesse i at forstå, hvordan den lokale mikromiljø regulerer funktioner EF og deltager i celle ekstravasation. Vores resultater viser, at indsættelse af et monolag af stromaceller under EF monolag øger ekstravasation af cirkulerende celler. Dette fund viser, at krydstale mellem EC og stroma øger evnen af EF at støtte ekstravasation af cirkulerende celler. Desuden vil manver, kan indsættelse af celler fra forskellige mikromiljøer (f.eks mesenkymale stamceller, lunge fibroblaster, tumorceller, astrocytter) bidrage til at efterligne specifikke kargebeter. Navnlig kunne en kombination af hjerne-afledt EF og astrocytter være en nyttig metode til at efterligne blod-hjerne-barrieren. Tilsvarende celler fra patienter, eller normale celler manipuleres in vitro, kunne hjælpe efterligne en bestemt syg mikromiljø.
I vores undersøgelser har vi brugt mindre skær med stromaceller vokset til 50% konfluens. Selv om den optimale tæthed af microenvironmental celler på indsatserne vil afhænge af målene for undersøgelsen, kan dette let manipuleres og styres.
Valg af en forskydningsspænding på
Forskydningsspænding på 0,8 dyn / cm 2 blev anvendt her, fordi det er blevet påvist af Von Andrian et al. at være forskydningsspænding i knoglemarven microvasculature, hvor bloddannende stamceller forlade cirkulation og indtaste væv under normale fysiologiske betingelser 15.. I modsætning hertil er højere niveauer af forskydningsspænding observeret i større fartøjer, hvor celle ekstravasation er begrænset. Derfor kunne en høj forskydningsspænding taksterne blive anvendt som ekstra kontroller for forsøg undersøger ekstravasation af forskellige celletyper.
Overlevelsen af celler under shear stress afhænger af flere faktorer, herunder celletype-og ex vivo-celle behandlinger (Goncharova et al., Upublicerede observationer), og derfor bør vurderes nøje under testen. Celle følsomhed over for forskellige niveauer af forskydningsspænding (shear stress resistens) kunne vurderes ved at programmere den peristaltiske pumpe for at forøge forskydningsspænding sats trinvist fra 0,8 dyn / cm 2 til 6 dyn / cm 2. Under disse tests kan celler opsamles periodisk fra gasudskiftningskammeret at overvåge celledød ved somsiger såsom trypanblåteksklusion, annexin V og PI farvning, og apoptose markør udtryk.
Hvis eksperimenter er designet til at teste den forskydningsspænding modstand ex vivo celler eller celler, der hidrører fra parenkym, anbefales det, at yderligere positive kontroller, såsom blodbårne celler, indgår i forsøgene.
Valg af indsatsen porestørrelse og ECM belægning
Indsætter fås med flere forskellige pore størrelser (3, 5 og 8 um). Valget af porestørrelse vil afhænge af størrelsen og egenskaberne af de cirkulerende testceller, hvilket også er tilfældet for statiske Transwell assays. Skær med en stor porestørrelse (8 um) anbefales at teste ekstravasation af store celler, såsom tumorceller af epitelial oprindelse. Leukocytter eller bloddannende stamceller er mere almindeligt testet med 5 um pore skær, og 3 um pore indsatser er bedst reserveret til afprøvning ekstravasation af sMøller celler. Men testen cellestørrelse alene er ikke den eneste vigtige faktor, og vi anbefaler at teste skær med flere pore størrelser.
I vores indledende undersøgelser, testede vi forskellige ECM for deres evne til at understøtte væksten af EF om skær og at modstå forskydningsspænding for> 4 timer. ECM testede inkluderet Matrigel, poly-D-lysin, fibronectin, laminin, type I collagen, Hydrogel, Meta-keratin I, II, III, IV, og Extracel. De bedste resultater for EF-vækst blev opnået med Extracel, fibronectin og collagen. Men i vore hænder, Extracel ved 0,8 ug / cm 2 reducerede signifikant transmigration testceller over membranen. Derfor har vi nu bruge fibronectin (5 mg / cm 2), eller collagen (5 mg / cm 2) for overfladebehandling af skær. Dog vil det optimale valg af ECM sandsynligvis blive påvirket af både typen af EF og transmigratory egenskaber testcellerne. En indledende eksperiment skal udføres for at teste integrity til EF monolag dyrket på udvalgte ECM. For eksempel, placere præ-belagte skær med EF-monolag i petriskåle fyldt med dyrkningsmedium placere retterne på et rysteapparat for at skabe forskydningsspænding (lav indstilling), og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 12 timer. Integriteten af EF efter udsættelse for forskydningsbelastning kan evalueres med krystalviolet farvning.
Udvælgelse af optimale prøverumstemperaturer koncentrationer
Evne testceller at afslutte kredsløbet afhænger af mange karakteristika specifikke for hver celletype. At generere statistisk signifikante resultater, skal den cirkulerende celledensitet skal optimeres for at sikre, at et tilstrækkeligt antal celler migrerer ind i de positive kontrolbrønde. Derfor anbefaler vi udfører indledende forsøg med en række celledensiteter (fx 10 3 / ml til 10 7 / ml) for at forstå forholdet mellem antallet af celler indlæst i systemet ogantallet af celler, der undergår transmigration.
Desuden kan den optimale cirkulerende koncentration variere for den samme celletype opnået fra forskellige kilder. For eksempel er CD34 +-celler en heterogen cellepopulation indeholdende både hæmatopoietiske stamceller og engagerede linjespecifikt progenitorer. De kan fås fra knoglemarv, mobiliserede perifert blod, og navlestrengsblod. CD34 + celler afledt fra disse tre kilder har forskellige målsøgende og engraftment evner 16-18, så betingelserne for at teste disse celler i 3D Enheden skal optimeres, før en fuld-skala forsøg.
Udvælgelse af optimale celle omsætning tid
Den optimale omsætning tid skal bestemmes empirisk for hver celletype. Den mindste tid, der kræves til cirkulation kunne ekstrapoleres ud fra resultaterne af statiske migration assays, men dette kan være ekstensivtded når cellerne udsættes for forskydningsspænding. Pilotundersøgelser test cirkulationstider mellem 4 og 96 timer anbefales.
Gasbørsen enhed
Hovedformålet med gasbørsen enhed er at opretholde den optimale koncentration af CO 2 i mediet cirkulerer gennem 3D anordning, der svarer til indstillingerne i standard vævskulturplader væksthuse. Gasbørsen Enheden kan også bruges til at tilføje test celler og forbindelser, og for at indsamle sonder og prøver under testen.
Evaluering af test celletal
Cirkulerende celler kan udtages prøver på forskellige tidspunkter under forsøget gennem gassen udveksling enhed. Ved afslutningen af forsøget, kan cellerne tilbage i omsætning, indsamlet fra stikkontakten. Når 3D enheden adskilles ved afslutningen af forsøget, kan transmigrated celler høstes fra de nedre brønde og opsamles feller yderligere analyse. Hvis inputceller er umærkede, kan transmigrated celler farvet med trypanblåt og levende / døde celler opregnede mikroskopisk. Alternativt kunne inputceller mærkes med en af de mange "celle tracker" farvestoffer til rådighed for levende celler, inden du lægger ind på 3D-enhed, i dette tilfælde, transmigrated de høstede celler bør lyseres for kvantificering af fluorescens.
Udvælgelse af den optimale prøvestørrelse
At tillade statistisk analyse skal en stikprøve udvælges der vil give cirka 80% magt for at afsløre den hypotetiske forskel i de gennemsnitlige procentvise ændringer mellem to grupper, når de blev undersøgt ved et signifikansniveau på 0,05 under anvendelse af en to-sidet t-test. Baseret på vores erfaringer med knoglemarvsceller, bruger vi tre brønde pr eksperimentel betingelse for 3D enhedens eksperimenter. Imidlertid vil den optimale prøve størrelse varierer med målet for forsøget og bør bestemmes empirically. Multipel regression statistiske test, tosidede t-tests og analyser af varians kan anvendes til at kontrollere statistisk relevans af resultaterne.
Udvælgelse af chemokiner
Som for alle transmigration assays vil valget af chemoattractant blive dikteret af egenskaberne af de test-celler og målet med undersøgelsen. SDF-1 er et veletableret kemoattraktant for hæmatopoietiske celler. I vores hænder, var en koncentration på 50 ng / ml SDF-1 optimalt at stimulere ekstravasation af knoglemarv-afledte hæmatopoietiske progenitorceller. Vi bruger også C3a og bFGF som kemoattraktanter for mesenchymstamceller 19. Vi anbefaler dog, titrering hver kemokine og cross-titreringsmiddel kombinationer af kemokiner for at identificere den optimale koncentrationsområde før en fuld-skala forsøg. For visse celletyper, kan en kombination af kemotaktiske faktorer være gavnligt. Hvis kemokiner for specifikke test celler er ukendte eller utilgængelige, conkonditioneret medie fra stimulerede lymfocytter, fibroblaster og andre celler kan anvendes som en kilde for kemoattraktanter.
Udvælgelse af de udlæste parametre
Alsidigheden af 3D-enhed vil udvide den type transmigration eksperimenter, der kan udføres, og succesen af forsøgene vil afhænge tankevækkende overvejelser og design af udlæsning parametre. Som regel indsamlede celler fra den øvre (cirkulerende) rum og den nederste (statisk) rum bør testes for levedygtighed på samme tid som celletælling. Nogle celler besidder lav tolerance over for fysiologiske forskydningsspænding observeret i mikrovaskulaturen. I dette tilfælde vil antallet af døde celler øges i den øverste kammer. Antallet af adhærente celler arresteret (eller fanget) på EF lag kan vurderes ved immunocytokemi af markører udtrykt specifikt ved testcellerne. Antistoffer specifikke for CD31 og vWF kan anvendesat opdage EF, og for at tillade forskelsbehandling mellem testcellerne og EF. Desuden bør integritet EF monolag overvåges ved slutningen af hver prøve.
De typer af analyser udført med de indsamlede celler vil afhænge af efterforskerne eksperimentelle mål, men kunne omfatte analysere ændringer i genekspression ved microarrays og qPCR, overflademolekyle udtryk ved FACS-analyse, aktivering af signalveje ved FACS og western blotting, og faktor sekretion ved ELISA. En enorm vifte af funktionelle tests er mulig på de indsamlede celler in vitro, som det fremgår af vores arbejde, som vi dyrket de transmigrated knoglemarvsceller at opregne de hæmatopoietiske progenitorceller (figur 3). De indsamlede prøver kunne også testes i en række in vivo-analyser.
En vigtig parameter, som kan bidrage til at forudsige adfærd af test-celler in vivo er en tendenstighed af nogle celler til at danne aggregater under forskellige satser for shear stress. For eksempel kan terapeutiske celler, der undergår aggregatdannelse i 3D enhed har en større tendens til at danne klumper efter intravenøs administration og forårsage akut vaskulær obstruktion in vivo (Goncharova et al. Publicerede observationer). Aggregatdannelse kunne overvåges mikroskopisk ved prøveudtagning testcellerne under eller efter afslutningen af 3D enhedens eksperimentet.
Disclosures
Cascade LifeSciences Inc. besidder eksklusive rettigheder til patent nr. US 7.927.867 B2 "Device for at vurdere, in vitro cellevandring under flow betingelser og metoder for anvendelse heraf". SKK er en opfinder af 3D strømningskammer enhed teknologi og en videnskabelig medstifter og aktionær i Cascade LifeSciences Inc.
Acknowledgments
Vi takker Chuck Scott og Victor McKnight fra CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) for teknisk assistance og fremstilling af 3D kammer, gasudveksling enhed og skær. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (tilskud R21DK067084 og R43CA141782 til SKK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133) | Lonza | CC - 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER - CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 - 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 - 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 | |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S.
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R.
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
