A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

Summary

Il dispositivo camera di flusso tridimensionale è un romanzo

Abstract

Stravaso di cellule dal sangue circolante gioca un ruolo centrale in molti processi fisiologici e fisiopatologici, incluse cellule staminali homing metastasi e tumore. Il dispositivo camera di flusso tridimensionale (di seguito il dispositivo 3D) è un romanzo in vitro tecnologia che ricrea shear stress fisiologico e permette ad ogni passo del stravaso cascata cella da quantificare. Il dispositivo 3D costituito da un vano superiore, in cui le cellule di interesse circolano sotto sollecitazione di taglio, ed uno scomparto inferiore di pozzi statici che contengono le chemoattractants di interesse. I due compartimenti sono separati da inserti porosi rivestiti con un monostrato di cellule endoteliali (EC). Un secondo inserto opzionale con celle microambientali di interesse può essere posizionato immediatamente sotto lo strato CE. Una unità di scambio di gas consente l'ottimale tensionamento ₂ CO a essere mantenuta e fornisce un punto di accesso per aggiungere o ritirare cellule o composti durante laesperimento. Le celle di test circolare nel vano superiore alla tensione di taglio desiderata (portata) controllato da una pompa peristaltica. Alla fine dell'esperimento, le cellule circolanti e migrate sono raccolti per ulteriori analisi. Il dispositivo 3D può essere usato per esaminare cella rotola su e adesione al CE sotto sollecitazione di taglio, trasmigrazione in risposta a gradienti chemochine, resistenza alle sollecitazioni di taglio, la formazione di cluster e la sopravvivenza delle cellule. Inoltre, il secondo inserto opzionale consente effetti di diafonia tra EC e cellule microambientali da esaminare. Le applicazioni traslazionali del dispositivo 3D comprendono la sperimentazione di farmaci candidati che la migrazione delle cellule bersaglio e prevedere il comportamento in vivo delle cellule dopo l'iniezione endovenosa. Così, il dispositivo 3D romanzo è uno strumento versatile e poco costoso per studiare i meccanismi molecolari che mediano stravaso cellulare.

Introduction

Cella stravaso è il processo mediante il quale le cellule circolanti escono sangue ed è un componente critico di molte risposte fisiologiche nel corpo. Il processo è anche importante per la rigenerazione tissutale, come per esempio, quando le cellule terapeutiche mobilizzate dai tessuti nei vasi sanguigni (o iniettati endovena) migrano attraverso il sistema vascolare ed escono dalla circolazione di siti di lesione o degenerazione. Lo stravaso è inoltre una componente fondamentale della patogenesi di molte malattie, tra cui l'infiammazione, il rigetto immunitario, autoimmunità, e le metastasi del tumore.

Stravaso è un processo multi-step complesso che coinvolge l'interazione delle cellule con cellule endoteliali (EC) circolante in condizioni di flusso fisiologico. Il procedimento comprende (a) laminazione cella, (b) ferma adesione alla superficie luminale CE, e (c) attraverso la trasmigrazione CE. Importante, ogni passo della cascata stravaso è regolata da un sottoinsieme di cell tipo-specifici e molecole di specie-specifici. Tuttavia, i meccanismi molecolari dettagliate che regolano stravaso di sottoinsiemi cellulari specifici non sono ben compresi, in gran parte a causa della difficoltà tecnica di ricapitolare le condizioni nel sangue. Il dispositivo 3D romanzo qui descritto è stato progettato per superare queste sfide tecniche e permettere esperimenti da eseguire che miglioreranno la nostra comprensione della biologia della migrazione cellulare.

Le molecole che mediano la migrazione delle cellule sono importanti bersagli terapeutici. Una comprensione dettagliata degli eventi molecolari che controllano la migrazione di specifici tipi cellulari, aiuterà ad identificare nuovi bersagli terapeutici per la promozione o l'inibizione di stravaso. Per esempio, interventi che migliorano la migrazione delle cellule staminali terapeutiche (sia derivato da adulti, neonatale o anche da tessuti fetali) verso siti di lesione o degenerazione sarebbe di grande utilità nella rigenerazione tissutale.Vi è un crescente interesse per la generazione in vitro di cellule staminali terapeutiche, comprese le cellule derivate da fonti pluripotenti, e in vivo manipolate cellule staminali adulte (ex ampliato, geneticamente manipolati, e pretrattati con vari enzimi) ^1. Quindi, vi è la necessità di nuove tecnologie per valutare la qualità delle cellule staminali prima di essere utilizzate per scopi terapeutici. Tra gli altri parametri, le cellule devono essere in grado di uscire in modo efficiente la circolazione, perché i trattamenti per i disturbi multifocali possono richiedere la somministrazione endovenosa di cellule staminali ^2. In effetti, una delle attuali sfide nel campo della biologia delle cellule staminali è quello di superare la bassissima efficienza con cui le cellule staminali a casa per i siti di danno tissutale ^3-6, mettendo in evidenza la necessità di affrontare questa lacuna nella nostra comprensione della migrazione delle cellule staminali. In contrasto, le strategie che bloccano la migrazione cellulare di mira molecole specifiche homing sarebbe utile per il trattamento di inmalattie infiammatorie e autoimmuni così come il cancro metastatico. Così, la comprensione dei meccanismi molecolari che mediano le interazioni tra cellule circolanti e la CE durante la migrazione cellulare e stravaso è rilevante per la medicina traslazionale e la scoperta di farmaci, nonché alla scienza di base.

Attualmente ci sono un certo numero di metodi disponibili per studiare i diversi aspetti della migrazione cellulare. Tuttavia, questi metodi presentano lacune che possono essere superati con il nuovo dispositivo 3D.

Modelli animali:

I modelli animali, come topi immunocompromessi e topi manipolati geneticamente, sono stati strumenti utili per studiare la migrazione delle cellule umane in vivo. Tuttavia, uno svantaggio significativo di questi modelli è che le cellule umane interagiscono scarsamente con molecole di adesione presenti sul mouse CE, in parte a causa della specie-specifiche differenze di sequenza in molte molecole di superficie cellulare. Così, l'uso di roditori per studiaremigrazione delle cellule umane è improbabile per riflettere autenticamente gli eventi in organo-specifiche letti vascolari umane. Inoltre, in modelli in vivo non sono adatti per screening ad alto rendimento di farmaci candidati. Il tradizionale modelli in vivo che utilizzano per lo studio delle cellule homing non contengano discriminazioni tra le diverse fasi della cascata stravaso, il che rende difficile identificare e selezionare nuove molecole di homing. L'approccio microscopia intravitale stato sviluppato per affrontare questa necessità e è stato informativo, tuttavia, questa tecnica è estremamente lungo e laborioso ^7,8.

Statici saggi di trasmigrazione:

Transwell o camera di Boyden saggi misura migrazione cellulare attraverso una membrana porosa e sono ampiamente usati in studi di migrazione. Il saggio ha il vantaggio che può essere usato per studiare non solo la motilità cellulare e matrice (ECM) interazioni cellula-extracellulari, ma anche la migrazione chemochina-mediata delle celluleattraverso un monostrato CE coltivati ​​sulle membrane porose. Sfortunatamente, il fenotipo e la funzione delle CE in condizioni statiche differiscono notevolmente da quelle sotto flusso fisiologico ^9,10. Così, gli eventi chemiotattici che si verificano in saggi Transwell non imitano fedelmente le interazioni tra le cellule che migrano e CE sotto sforzo di taglio. Inoltre, il passo "rolling" della cascata homing, che aggiunge un'ulteriore dimensione di selettività al processo generale, non si verifica in saggi Transwell statiche. Così, mentre questa tecnologia non consentire la valutazione quantitativa della migrazione cellulare chemochina-mediata attraverso il monostrato CE, essa è limitata dalla sua incapacità di fornire la tensione di taglio che imita il flusso di sangue in vivo.

Saggi sotto sforzo di taglio:

Muro di shear stress è noto a svolgere un ruolo importante nella regolazione della funzione EC ^9,10. Forze di taglio inducono rapida attivazione di cascate di segnalazione, transcfattori rizione, e l'espressione genica differenziale in CE ^11,12. Questa informazione ha portato allo sviluppo della prossima generazione di saggi di adesione - parallele camere di flusso laminare e capillari - studiare rotolamento e adesione delle cellule ai CE in condizioni di sforzo di taglio ^7,13. Il fattore limitante per queste analisi è che si può misurare solo al rotolamento e aderenza, ma non fanno distinzione tra una cellula aderente che avrebbe continuato a trasmigrare e una cella aderente che viene "arrestato" sul monostrato CE e non sarebbe trasmigrare. Inoltre, questi test non possono misurare la migrazione delle cellule verso un gradiente di chemochine.

Diversi studi hanno descritto la capacità di cellule aderenti a strisciare sotto un monostrato CE coltivate su vetrini in condizioni di flusso ^14. Le limitazioni a questa tecnica di scansione comprendono: analizza solo un numero limitato di cellule, è non-quantitativa; analizza cella strisciando sulla matrice e celsuperficie l ma non la migrazione verso un gradiente chemiotattico, e non permette alle cellule trasmigrato da isolare. Così, anche se questo dosaggio ha il vantaggio di applicare sollecitazioni di taglio per il monostrato CE, non può quantificare migrazione delle cellule verso un gradiente di chemochine.

La nuova tecnologia 3D descritto qui supera molte di queste lacune combinando forza di taglio (vano superiore) con un gradiente chemochina statico (compartimento inferiore) e permette la valutazione quantitativa di ciascun passo della cascata stravaso (Figura 1). Il dispositivo può anche essere utilizzato per studiare come diafonia tra CE e il microambiente influenza la capacità di CE di sostenere stravaso di cellule circolanti. Il seguente protocollo descrive la metodologia passo-passo per l'utilizzo del dispositivo camera di flusso 3D.

Protocol

1. Preparare gli inserti inferiori e superiori per la crescita delle cellule di collagene Coating

1. Calcolare il numero di inserti necessari per l'esperimento. Collocare ogni inserto in una piastra di Petri sterile separato (35 x 10 mm) e sterilizzare per irraggiamento (11 Gy).
2. Preparare la soluzione di collagene per il rivestimento delle membrane: 50 mcg / ml, 154 microlitri per inserto (inserire superficie 1,54 centimetri ^2).
3. Posizionare diverse gocce (~ 20 microlitri per goccia) di soluzione di collagene in un cerchio sulla superficie della membrana inserto (non lasciare la punta della pipetta tocchi la superficie) e quindi aggiungere attentamente il resto della parte aliquota da formare una grande goccia sul superficie della membrana. Accertarsi che la soluzione di collagene rimane emisferica e non scarica dalla superficie della membrana.
4. Coprire il piatto Petri con un coperchio e incubare per 1 ora a temperatura ambiente su una superficie piana.
5. Aspirare la soluzione di collagene e lavare la membrana volta coprendo con 160 microlitri di PBS.
6. Aspirate il PBS e sostituire il coperchio. Se si utilizza lo stesso giorno, porre la capsula di Petri in un luogo asciutto a temperatura ambiente. In caso contrario, mettere il piatto a 4 ° C ed utilizzare l'inserto entro 7 giorni.

2. Cultura cellule endoteliali sulle Inserti superiori

1. Preparare sospensioni CE nel terreno di coltura desiderata. Assicurarsi che la vitalità cellulare è> 98% e utilizzare immediatamente.

Nota: Per ombelicale umano vena CE (HUVEC), 4 è usato x 10 ⁵ cellule in 160 microlitri per inserto.

2. Prendere le capsule di Petri con inserti collagene rivestite preparati nella sezione 1; non rimuovere gli inserti dei piatti. Posizionare diverse piccole gocce di sospensione cellulare (circa 20 microlitri per goccia) in un cerchio sulla superficie della membrana di collagene rivestite (non lasciare la punta della pipetta toccare la superficie) e quindi aggiungere attentamente il resto della sospensione cellulare per formare una grande goccia. Assicurarsi che la sospensione cellulare rimane Hemis pherical e non gocciola dalla superficie della membrana.
3. Sostituire i coperchi e posizionare accuratamente le capsule in una coltura cellulare CO ₂ incubatore e incubare 5% (senza agitazione) a 37 ° C per 30 minuti per permettere alle cellule di allegare alla membrana.
4. Delicatamente aggiungere 5 ml di terreno di coltura per ciascuna piastra di Petri assicurando che l'inserto rimane sul fondo del piatto ed è completamente coperto dal mezzo. Sostituire le palpebre e con attenzione mettere i piatti in incubatrice. Coltura le cellule a 37 ° C durante la notte.
5. Utilizzare lo stesso approccio per preparare il secondo (opzionale) inserto inferiore con celle che rappresentano il microambiente locale, che sarà posto sotto l'inserto contenente il livello CE.

Nota: se gli inserti inferiori sono inclusi negli esperimenti, gli inserti superiori ed inferiori vengono collegati tra di loro prima di posizionare gli inserti nel dispositivo 3D (Figura 4B).

e "> 3. Montare il dispositivo di flusso Camera 3D

1. Avvitare le piastre superiore e inferiore, collegare le piastre all'unità scambio di gas utilizzando tubi, collocare il dispositivo assemblato in un sacchetto di plastica pulito, e sterilizzare il sacchetto e contenuti da irradiazione (11 Gy).
2. Rimuovere un vassoio-shelf dalla cultura incubatore cellulare, posto in una cappa sterile cultura del tessuto, spruzzare con il 70% di etanolo, asciugare, e poi coprire il vassoio con un grande tovagliolo sterile.
3. Posizionare il sacchetto di plastica irradiato nel cofano, rimuovere il dispositivo dal sacchetto e posto sul piatto dell'incubatore sterile. Collegare il dispositivo alla pompa peristaltica con il tubo fornito. Programma la pompa per una velocità ottimale di 0,2 ml / min.

Nota: Per collegare la pompa con presa elettrica, estrudere il cavo elettrico attraverso il foro nella parte posteriore della incubatore. Utilizzare spina rapinatore intorno al cavo per assicurare che il buco è a tenuta d'aria.

4. Primo il flusso dispositivo Chamber 3D

1. Scollegare il tubo di ingresso dalla presa tirando l'ago metallico dal tubo (usare piccoli tovaglioli sterili per mantenere la sterilità del tubo). Utilizzare l'ago metallico collegato a tubazione come un "ingresso" e la fine sconnesso di tubazione come un "outlet". Posizionare lo spillo di metallo nel tubo da 15 ml con i media; posizionare la presa nel vuoto 15 ml di tubo.
2. Accendere la pompa in modo che il flusso è in senso antiorario e impostare la velocità di flusso a 0,2 ml / min. Permettere la pressione negativa per disegnare il mezzo dal tubo di ingresso 15 ml nel tubo e arrestare la pompa quando il prodotto raggiunge l'estremità del tubo immediatamente prima che si collega al dispositivo (Figura 2, Stop # 1).
3. Svitare le piastre superiore e inferiore del dispositivo. Rimuovere con cautela la piastra superiore e luogo 1,500 - 1,550 l di medium (da solo o, più le chemochine sperimentali o medie) nei pozzetti inferiori. Assicurarsi il bene contiene il mezzo sufficiente a formare un emisfero che raggiunge circa 1 - 2 mm sopra la piastra inferiore.
4. Trasferire l'inserto preparato dalla piastra di Petri per i pozzetti della piastra inferiore con pinza sterile, facendo attenzione che non siano presenti bolle sotto gli inserti. Aspirare qualsiasi mezzo che appare sulla superficie della piastra inferiore per garantire che la piastra rimane asciutta. Posizionare la piastra superiore della schiena sulla piastra inferiore e ri-collegare le piastre con le viti.
5. Girare immediatamente la pompa peristaltica e consentire medie di fluire attraverso il dispositivo 3D. Elevare l'estremità di uscita del dispositivo e mantenere la camera in questa posizione per impedire la formazione di bolle all'interno dello spazio tra le piastre.
6. Lasciar riempire la camera e il tubo che collega la camera all'unità scambio di gas. Arrestare la pompa immediatamente prima che il prodotto raggiunge il gas eunità Xchange (figura 2; stop # 2). Luogo 3 ml di terreno nell'unità di scambio di gas, accendere la pompa, e lasciare che le bolle d'aria per sfuggire attraverso l'unità di scambio di gas. Elevare l'unità di scambio di gas per permettere il mezzo per riempire la tubazione in uscita dal gruppo di scambio di gas e fermare la pompa quando il prodotto raggiunge 2 - 3 cm prima della fine del tubo di uscita (figura 2, Stop # 3).
7. Collegare l'ago metallico di ingresso alla presa utilizzando piccoli tovaglioli sterili. Riprogrammare la pompa in modo passaggio del fluido nella direzione opposta (in senso orario) verso l'unità di scambio di gas e assicurano eventuali bolle d'aria vengono rimosse una volta raggiunta l'unità di scambio di gas. Controllare che non rimangano bolle d'aria nel sistema.
8. Riprogrammare la pompa in modo che il fluido scorre in senso antiorario. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare test all'unità scambio di gas. Chiudere il coperchio dell'unità di scambio di gas, posizionare il vassoio con la parte posteriore del sistema di lavoro in incubatrice, e permettono alle cellule di prova per cire nel dispositivo 3D a 37 ° C per il tempo desiderato.

Nota: Pulire il cavo elettrico della pompa con il 70% di etanolo e posizionarlo all'interno dell'incubatore.

5. Terminare il test e raccogliere campioni per il dosaggio

1. Rimuovere il vassoio con il sistema di lavoro dal termostato e posto nella cappa. Fermare la pompa, scollegare l'ingresso e di uscita, e posizionare le estremità in sterili da 15 ml tubi vuoti.
2. Accendere la pompa e raccogliere la sospensione cellulare dall'impianto; luogo la sospensione cellulare in ghiaccio, se del caso, fino all'utilizzo.
3. Smontare la camera togliendo le viti e sollevare la piastra superiore. Rimuovere gli inserti dalla piastra inferiore e trasferirli piastre di Petri.

Nota: Gli inserti possono essere colorati per visualizzare e contare le cellule in situ (cristal violetto 0,05% in dH ₂ O) o tripsinizzate per raccogliere la CE per ulterioretest.

4. Rimuovere il terreno e le cellule dai pozzetti inferiori nelle provette e centrifugare per 5 min a 210 x g. Rimuovere il surnatante, lavare e risospendere le cellule, se lo desideri, ed elaborare le cellule secondo gli obiettivi sperimentali specifici (discusso più avanti).

Representative Results

Il midollo osseo murino-derivato linea CE STR-12 è stato coltivato su inserti con 5 micron pori. Il tasso di crescita CE stata monitorata sotto un microscopio e quando la CE fosse del 100% confluenti, gli inserti sono stati trasferiti nei pozzetti nel vano inferiore del dispositivo 3D. Immediatamente prima di posizionare gli inserti, i pozzetti del compartimento inferiore sono stati riempiti con terreno di coltura da sola (controllo negativo) o con mezzo supplementato con derivato dalle cellule stromali factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml e 50 ng / ml). Successivamente, il dispositivo 3D è stato assemblato e la camera è stata riempita con terreno come descritto nel protocollo. Cellule da testare ad essere diffusi nel compartimento superiore del dispositivo sono state appena raccolte cellule di midollo osseo murino (3.5 x 10 ⁶ cellule per camera). Una sollecitazione di taglio definito di 0,8 dine / cm ² è stato applicato impostando la velocità della pompa peristaltica a 0.2 ml / min. L'intero sistema di lavoro è stato quindi posto in 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C e la ceLLS sono stati autorizzati a circolare e interagire con il monostrato CE per 4 ore. Alla fine di questo periodo, sono state raccolte le cellule circolanti, la camera è stata smontata, e gli inserti sono stati rimossi come descritto nel protocollo. Le cellule sono state raccolte trasmigrato dai pozzetti inferiori, lavate, risospese in terreno fresco, e trasferiti culture metilcellulosa addizionato con fattori di crescita ematopoietici per cella (CFC) saggio di formazione di colonie (Figura 3). Come previsto, abbiamo trovato un numero significativamente maggiore di CFC aveva migrato attraverso il monostrato CE ai pozzetti contenenti 50 ng / ml SDF-1 rispetto a pozzetti contenenti 5 ng / ml SDF-1 o medium da solo.

Come abbiamo descritto in precedenza, nessuno degli attuali tecniche in vitro disponibili per studiare la migrazione delle cellule sono in grado di testare l'effetto del microambiente locale sulla capacità di CE di sostenere stravaso di cellule migranti. Per illustrare come questo può essere realizzato con il dispositivo 3D, abbiamostravaso esaminato circolanti di cellule ematopoietiche attraverso uno strato di CE e uno strato di cellule stromali del midollo osseo. Per questo, un secondo inserto (inferiore) contenente uno strato di cellule stromali stata giustapposta l'inserto superiore contenente il monostrato CE nella piastra inferiore (figura 4). L'esperimento è stato quindi eseguito come descritto sopra e le cellule sono state raccolte trasmigrato dai pozzetti e contati. I risultati hanno dimostrato che l'inserimento di un ulteriore strato di cellule stromali sotto il monostrato CE aumentato significativamente la migrazione di cellule ematopoietiche verso SDF-1 (figura 4). Questo risultato è coerente con la nozione che il microambiente locale contribuisce al reclutamento di cellule circolanti al tessuto.

(PM). CE sono coltivate sulla membrana, che poi forma una barriera tra i compartimenti superiori e inferiori. Tensioni tangenziali definiti vengono applicati al vano superiore del dispositivo 3D dai media perfusione utilizzando una pompa peristaltica infusione costante. Cellule circolanti sono o non interagenti (NIC), interagire con la CE transitoriamente ('roll', RC), oppure aderire alla CE (AC). Una sottopopolazione di cellule aderenti trasmigra attraverso lo strato CE al vano inferiore statica del dispositivo (TM) B:. Una vista di disegno superiore (pannello superiore) del dispositivo 3D. La vista in sezione orizzontale (pannello inferiore) dimostra la posizione della membrana superiore (rosso), la membrana inferiore (verde), e il fondo del pozzo (blu) C:. L'isometrivista c illustra le parti integranti del dispositivo: quattro viti, un blocco acrilico superiore, un sigillo di camera superiore, parte superiore e inferiore delle membrane, in basso o-ring, e un 3-ben blocco inferiore in acrilico D:. Una fotografia del flusso 3D camera collegata ad una pompa peristaltica e una unità di scambio di gas. Il sistema è assemblato in una cappa sterile e poi trasferito in un incubatore per colture cellulari.

Figura 2. Una rappresentazione schematica del sistema dispositivo 3D. Il disegno mostra i tre fermate necessarie per assemblare il sistema. Il mezzo di coltura viene aspirato dalla bocca di aspirazione dalla pressione negativa creata dalla pompa peristaltica. Il flusso del fluido è fermato dal Stop # 1 per consentire gli inserti da posizionare nel dispositivo. Dopo che la camera viene chiusa, la pompa è prosched di nuovo e la camera viene immediatamente riempito con il mezzo per prevenire l'essiccazione delle cellule cresciute sugli inserti. Stop # 2 permette di medie ad essere messi in unità di scambio di gas. Interrompere # 3 consente il flusso di essere fermato per il collegamento di entrata e uscita. Il flusso può essere diretto in senso orario o antiorario per rimuovere le bolle d'aria attraverso l'unità di scambio di gas usando un interruttore sulla pompa.

Figura 3. Il dispositivo supporta 3D trasmigrazione SDF-1-mediata di progenitori emopoietici in condizioni di shear stress fisiologico. A: Tre dispositivi (contenenti ciascuno 3 pozzi nel vano inferiore) sono stati assemblati e in parallelo. Solo media o medio contenente SDF-1 a 5 o 50 ng / ml è stato aggiunto ai pozzetti vano inferiore. Murino bocellule del midollo ne sono stati autorizzati a circolare in dispositivi per 4 ore. Successivamente, ogni dispositivo è stato smontato e le cellule che avevano trasmigrato verso SDF-1 (giallo) sono stati raccolti dai pozzetti inferiori, computata e coltivato in metilcellulosa supplementato con fattori di crescita ematopoietici (GF). Quattordici giorni dopo, le colonie sono state segnate al microscopio B:. Il numero di cellule progenitrici (cellule formanti colonie, CFC) recuperate da compartimento inferiore è mostrato come media ± SD di tre pozzi per ogni condizione. * P <0.05.

Figura 4. L'effetto del microambiente sulle interazioni tra cellule ematopoietiche e cellule endoteliali. R: La figura mostra la posizione di una seconda membrana porosa con st coltafibroblasti Romal (SF) sotto la membrana superiore con CE. Altre abbreviazioni sono come descritto per la Figura 1A B:.. La membrana aggiuntiva (inserto inferiore) con SF coltura è stato inserito sotto la membrana superiore C: Tre dispositivi (ciascuno contenente 3 pozzi) sono stati eseguiti in parallelo. Solo media o medio contenente SDF-1 a 50 ng / ml di SDF-1 è stato aggiunto ai pozzetti vano inferiore. Le camere di controllo negativi omessi SC, SDF-1, o entrambi. Cellule del midollo osseo sono stati autorizzati a circolare per 4 ore a 37 ° C. Successivamente, ogni dispositivo è stato smontato e le cellule sono state raccolte trasmigrato dai pozzetti vano inferiore e contato. Il numero di cellule recuperate trasmigrato è mostrato come media ± SD di tre pozzi per ogni condizione. * P <0.05.

Discussion

Il dispositivo 3D può essere una tecnologia utile per la ricerca in vari campi tra cui la biologia delle cellule staminali, biologia vascolare, ematologia, oncologia, autoimmunità e infiammazione. Il dispositivo 3D sarà particolarmente utile per i ricercatori, lo studio, le cellule staminali neurali e mesenchimali emopoietiche altro per studiare i meccanismi molecolari che regolano ogni fase della cellule staminali stravaso cascata. I ricercatori che studiano la migrazione delle cellule possono anche utilizzare questo dispositivo per esaminare i diversi meccanismi migratori dei T e B linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, cellule NK, e altre cellule migratorie. In biologia vascolare, il dispositivo sarà utile per valutare l'effetto del microambiente locale sulla capacità di CE di sostenere il reclutamento di cellule e per imitare la barriera ematoencefalica in vitro. Per i ricercatori concentrandosi su patogenesi della malattia, il dispositivo può essere usato per studiare la migrazione delle cellule T citotossiche nel pancreas durante diabete di tipo I, la migrazione di eosinofili nei polmoni di pazienti asmatici, la migrazione dei neutrofili, monociti e linfociti nei siti di infiammazione in una serie di disturbi, il reclutamento di cellule a ferire i siti di guarigione, l'interazione delle cellule T citotossiche con la neovascolarizzazione, e il reclutamento di cellule T citotossiche nei tumori.

Il dispositivo 3D romanzo sarà anche un utile strumento per la scienza traslazionale e per lo sviluppo di farmaci preclinico e di screening. Ad esempio, il dispositivo può essere utilizzato per ottimizzare la preparazione di sospensioni di cellule terapeutiche somministrate per via endovenosa, per testare il reclutamento di cellule terapeutiche per tessuti danneggiati contro tessuti normali, e per esaminare il ruolo dell'organo specifico o endotelio microambiente tissutale e in questo processo. Per lo sviluppo di farmaci, il dispositivo potrebbe essere utilizzato per testare farmaci candidati che le cellule tumorali bersaglio e bloccare ogni passo della cascata stravaso, per testare cellule migranti come farmaco consegnarey veicolo a siti tumorali, per testare farmaci che regolano la funzione dell'endotelio organo-specifiche umano o il microambiente tessuto-specifici locale, e per testare combinazioni di farmaci che regolano diverse fasi della cascata homing. Infine, quando convertito in un sistema ad alta produttività, il dispositivo può essere utilizzato per lo screening di piccole molecole, peptidi e anticorpi che molecole bersaglio mediatrici traffico cellulare.

Dettagli tecnici e suggerimenti

Rotolamento e aderenza in condizioni di flusso sono i passaggi critici nella cascata stravaso e contribuiscono in modo significativo alla efficienza della migrazione delle cellule in vivo. Particolare, questi passaggi non contribuiscono a test statici in vitro. Tuttavia, i saggi di trasmigrazione statici sono utili come controlli negativi in ​​esperimenti di verificare gli effetti delle sollecitazioni di taglio sulla sopravvivenza delle cellule e la funzione, tra cui la possibilità di CE per supportare interazioni bassa affinità (rolling) e ferma adesione.

La scelta del mezzo di esperimenti nel dispositivo 3D è importante. Supporti contengono diversi fattori di crescita che possono influenzare la sopravvivenza delle cellule circolanti, in particolare durante i tempi di incubazione lunghi. Inoltre, le concentrazioni di Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} che possono influenzare le interazioni adesive in condizioni di flusso fisiologico, variare notevolmente in terreni di coltura commerciali. Altri dettagli tecnici che dovrebbero essere presi in considerazione al momento di pianificare esperimenti con il dispositivo 3D sono discussi di seguito.

Selezione del monostrato CE

La firma superficie cellulare di CE è influenzato da diversi parametri, tra cui le specie e tessuti di origine e le condizioni di coltura cellulare, che dovrebbero essere presi in considerazione nel disegno sperimentale. Alcuni comunemente utilizzati CE includono polmone-derivato microvascolare CE (LDMVEC), derivate dal midollo osseo CE (BMDEC), derivato dal cervello CE (BDEC) e HUVEC.Le proprietà del CE variano anche per la loro origine. Ad esempio, BMDEC costitutivamente espresso selectine e VCAM-1, che sono responsabili di rotolamento e aderenza, mentre BDEC, LDMVEC e HUVEC non esprimono queste molecole in condizioni normali. Pertanto, inserti rivestiti con BDEC, LDMVEC, e HUVEC possono essere pretrattate con TNF α (10 ng / ml, 4 ore) e altri fattori per imitare infiammazione e indurre l'espressione di molecole homing.

Test crosstalk con il microambiente locale

Vi è un crescente interesse per comprendere come il microambiente locale, regola le funzioni del CE e partecipa a stravaso delle cellule. I nostri risultati dimostrano che l'inserimento di un monostrato di cellule stromali sotto il monostrato CE aumenta significativamente stravaso di cellule circolanti. Questo risultato dimostra che la diafonia tra CE e stroma migliora la capacità della CE a sostegno stravaso di cellule circolanti. Moreover, l'inserimento di cellule provenienti da diversi microambienti (ad esempio cellule mesenchimali staminali, fibroblasti polmonari, cellule tumorali, astrociti) potrebbe contribuire a imitare specifiche letti vascolari. In particolare, una combinazione di cervello-derivato CE e astrociti potrebbe essere un utile approccio per imitare la barriera emato-encefalica. Allo stesso modo, le cellule ottenute da pazienti, o cellule normali manipolate in vitro, potrebbero contribuire a simulare uno specifico microambiente malato.

Nei nostri studi, abbiamo usato inserti inferiori con cellule stromali cresciute al 50% di confluenza. Sebbene la densità ottimale delle cellule microambientali sulle inserti dipenderà dagli obiettivi dello studio, questo può essere facilmente manipolato e controllato.

Selezione di un tasso di sforzo di taglio

La sollecitazione di taglio di 0,8 dine / cm ² è stato usato qui perché questo è stato dimostrato da Von Andrian et al. essere lo sforzo di taglio nel midollo osseo microvasculature, dove le cellule progenitrici ematopoietiche escono dalla circolazione e tessuti entrano in normali condizioni fisiologiche ^15. In contrasto, livelli elevati di sforzo di taglio si osservano in vasi più grandi, dove stravaso cella è limitato. Pertanto, elevati tassi di sollecitazione di taglio potrebbero essere usati come controlli aggiuntivi per esperimenti esaminano stravaso di vari tipi di cellule.

La sopravvivenza delle cellule sotto sollecitazione di taglio dipende da diversi fattori, tra cui il tipo di cellula e trattamenti con le cellule ex vivo (Goncharova et al., Dati non pubblicati), e dovrebbe quindi essere attentamente valutato nel corso della prova. Sensibilità cellulare ai diversi livelli di sforzo di taglio (shear resistenza allo stress) potrebbe essere valutata programmando la pompa peristaltica per aumentare il tasso di sollecitazione di taglio incrementalmente da 0,8 dyn / cm ² al 6 dyn / cm ^2. Durante questi test, le cellule possono essere raccolte periodicamente dalla camera scambio di gas per monitorare morte cellulare utilizzando comedice come blu tripano esclusione, annessina V e PI colorazione, e di espressione marcatore apoptosi.

Se gli esperimenti sono progettati per testare la resistenza sforzo di taglio di cellule ingegnerizzate ex vivo o cellule derivate da parenchima, si raccomanda che ulteriori controlli positivi, come le cellule ematica, sono inclusi negli esperimenti.

Selezione della dimensione dei pori e rivestimento dell'inserto ECM

Gli inserti sono disponibili con diverse dimensioni dei pori (3, 5, e 8 micron). La scelta della dimensione dei pori dipenderà dalla dimensione e le proprietà delle celle di prova circolanti, che è anche il caso per saggi Transwell statiche. Inserti con una grande dimensione dei pori (8 micron) sono raccomandati per testare stravaso di cellule di grandi dimensioni come le cellule tumorali di origine epiteliale. Leucociti o cellule staminali ematopoietiche sono più comunemente testati con 5 inserti poro micron, e 3 inserti pori micron sono più riservati per testare stravaso di scellule maller. Tuttavia, le dimensioni della cella di test da solo non è l'unico fattore importante e si consiglia di testare inserti con diverse dimensioni dei pori.

Nei nostri studi iniziali, abbiamo testato vari ECM per la loro capacità di sostenere la crescita della CE sugli inserti e di resistere a sollecitazioni di taglio per> 4 ore. L'ECM provato include Matrigel, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, collagene di tipo I, Idrogel, Meta-cheratina I, II, III, IV, e Extracel. I migliori risultati di crescita CE sono stati ottenuti con Extracel, fibronectina e collagene. Tuttavia, nelle nostre mani, Extracel a 0,8 g / cm ² ha ridotto significativamente la trasmigrazione delle celle di prova attraverso la membrana. Pertanto ora usiamo fibronectina (5 pg / cm ²⁾ o collagene (5 pg / cm ²⁾ per il rivestimento di inserti. Tuttavia, la scelta ottimale di ECM sarà probabilmente influenzata sia dal tipo di CE e le proprietà trasmigratori delle cellule da testare. Un esperimento preliminare deve essere eseguita per testare il integritty del monostrato CE coltivate su ECM selezionato. Ad esempio, posizionare inserti pre-rivestite con monostrati CE in piastre di Petri riempite con terreno di coltura, Porre le capsule su un agitatore per creare sollecitazioni di taglio (minima), e incubare a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 12 ore. L'integrità della CE dopo esposizione alla sollecitazione di taglio può essere valutata utilizzando cristallo colorazione viola.

Selezione delle concentrazioni cellulari ottimali di prova

La capacità delle cellule di prova per uscire dalla circolazione dipende da molte caratteristiche specifiche per ogni tipo cellulare. Per generare risultati statisticamente significativi, la densità cellulare circolanti deve essere ottimizzata per garantire che un numero sufficiente di cellule migrano nei pozzetti di controllo positivi. Pertanto, si consiglia di eseguire test iniziali con una gamma di densità cellulari (es. 10 ³ / ml a 10 ⁷ / ml) per comprendere il rapporto tra il numero di cellule caricato nel sistema eil numero di cellule che subiscono trasmigrazione.

Inoltre, la concentrazione ottimale circolante può differire per il medesimo tipo cellulare ottenuta da fonti diverse. Ad esempio, cellule CD34 ⁺ sono una popolazione cellulare eterogenea contenente sia le cellule staminali ematopoietiche e impegnati progenitori lineage-specifici. Essi possono essere ottenute da midollo osseo, sangue periferico mobilizzato, e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CD34 ⁺ derivate da queste tre fonti possiedono abilità diverse homing e l'attecchimento ^16-18, per cui le condizioni di prova di queste cellule nel dispositivo 3D deve essere ottimizzata prima di uno studio su vasta scala.

Selezione del tempo di circolazione ottimale delle cellule

Il tempo ottimale circolazione dovrebbe essere determinata empiricamente per ogni tipo cellulare. Il tempo minimo richiesto per la circolazione potrebbe essere estrapolata dai risultati di test di migrazione statici, ma questo può essere Extenata quando le cellule sono sottoposte a sollecitazioni di taglio. Sono raccomandati studi pilota di test volte circolazione tra 4 e 96 ore.

L'unità di scambio di gas

Lo scopo principale della unità di scambio di gas è di mantenere la concentrazione ottimale di CO ₂ nel mezzo di circolazione attraverso il dispositivo 3D, simili alle impostazioni in incubatori coltura di tessuti standard. L'unità di scambio di gas può anche essere usato per aggiungere cellule da testare e composti e per la raccolta sonde e campioni durante la prova.

Valutazione del numero di cellule di prova

Cellule circolanti possono essere campionati in momenti diversi durante l'esperimento attraverso l'unità di scambio di gas. Al termine dell'esperimento, le celle rimanenti nella circolazione potrebbero essere raccolti dalla presa. Quando il dispositivo 3D è smontato al termine dell'esperimento, le cellule possono essere raccolte trasmigrato dai pozzetti inferiori e raccolti fo ulteriori analisi. Se le celle di input sono adenoidi, le cellule trasmigrato possono essere colorati con trypan blu e cellule vive / morte enumerati microscopicamente. In alternativa, le celle di input possono essere etichettati con uno dei tanti "inseguitore cellulare" coloranti disponibili per l'imaging cellulare dal vivo prima di caricare nel dispositivo 3D, in questo caso, il raccolto trasmigrato cellule devono essere lisate per la quantificazione della fluorescenza.

Selezione della dimensione ottimale del campione

Per consentire l'analisi statistica, una dimensione del campione deve essere selezionato in grado di fornire circa il 80% di potenza per rilevare la differenza ipotetico nei cambiamenti percentuali medi tra due gruppi durante il test a un livello di significatività di 0,05 con un t-test a due code. Sulla base della nostra esperienza con cellule del midollo osseo, usiamo tre pozzi per ogni condizione sperimentale per gli esperimenti di dispositivi 3D. Tuttavia, la dimensione del campione ottimale varierà con l'obiettivo dell'esperimento e dovrebbe essere determinato empirically. Più test di regressione statistica, su due lati t-test, e analisi della varianza possono essere utilizzati per verificare rilevanza statistica dei risultati.

Selezione di chemochine

Come per tutti i saggi di trasmigrazione, la scelta del fattore chemiotattico sarà dettata dalle proprietà delle cellule da testare e l'obiettivo dello studio. SDF-1 è un fattore chemiotattico ben consolidata per le cellule ematopoietiche. Nelle nostre mani, una concentrazione di 50 ng / ml SDF-1 era ottimale per stimolare stravaso dell'osso cellule progenitrici ematopoietiche derivate dal midollo. Usiamo anche C3a e bFGF come fattori chemiotattici per le cellule staminali mesenchimali ^19. Tuttavia, si consiglia di titolazione ognuno combinazioni chemochine e cross-titolazione di chemochine per individuare l'intervallo di concentrazione ottimale prima di uno studio su vasta scala. Per certi tipi di cellule, una combinazione di fattori chemiotattici può essere utile. Se chemochine per celle di test specifici sono sconosciuti o non disponibili, consupporti ditioned da linfociti stimolati, fibroblasti e altre cellule possono essere utilizzati come fonte di fattori chemiotattici.

Selezione dei parametri di lettura

La versatilità del dispositivo 3D si espanderà il tipo di esperimenti di trasmigrazione che possono essere eseguite, e il successo degli esperimenti dipenderà da un'attenta considerazione e progettazione dei parametri di lettura. Come regola generale, le cellule raccolte dal vano superiore (ad anello) e il vano inferiore (statica) devono essere testati per la vitalità allo stesso tempo come conteggio delle cellule. Alcune cellule possiedono scarsa tolleranza alla sollecitazione di taglio fisiologica osservato nella microcircolo. In questo caso, il numero di cellule morte sarà aumentato nel compartimento superiore. Il numero di cellule aderenti arrestati (o intrappolata) sullo strato CE può essere valutata mediante immunocitochimica di marcatori espressi specificamente dalle cellule da testare. Anticorpi specifici per CD31 e vWF può essere utilizzatoper rilevare CE e consentire la discriminazione tra le celle di prova e della CE. Inoltre, l'integrità del monostrato CE deve essere monitorato al termine di ciascuna prova.

Le tipologie di analisi effettuate con le cellule raccolte dipenderà obiettivi sperimentali degli investigatori, ma potrebbero includere cambiamenti analizzando nell'espressione genica da microarrays e qPCR, superficie espressione molecola mediante analisi FACS, l'attivazione di vie di segnalazione da FACS e Western blotting, e il fattore di secrezione da ELISA. Una serie enorme di test funzionali sono possibili sulle cellule raccolte in vitro, come dimostra il nostro lavoro in cui abbiamo colto le cellule del midollo osseo trasmigrato enumerare le cellule progenitrici ematopoietiche (Figura 3). I campioni raccolti potrebbero anche essere testati in una varietà di saggi in vivo.

Un parametro importante che può aiutare a prevedere il comportamento delle celle di test in vivo è il tendererenza di alcune cellule a formare aggregati sotto diversi tassi di shear stress. Per esempio, le cellule terapeutiche che subiscono aggregate formazione nel dispositivo 3D potrebbero avere una maggiore tendenza a formare grumi dopo somministrazione endovenosa e causare ostruzione acuto vascolare in vivo (Goncharova et al., Osservazioni non pubblicate). Formazione degli aggregati potrebbe essere monitorato microscopicamente campionando cellule da testare durante o dopo il completamento dell'esperimento dispositivo 3D.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Chamber	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gas exchange unit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inserts	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collagen Bovine,Type I	BD Biosciences	354231
Hydrochloric Acid 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
Trypsin	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectin, human , nature	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ScienCell	1000
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells	ScienCell	1001
Trypan Blue	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Iodide Staining Solutuion	BD Pharmingen	# 556463
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	StemCell	CB007F
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Mouse Methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antibody	abcam	C# ab11713
Petry dish (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml tubes	VWR Fisher	21008 - 918
Tissue culture flasks 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissecting forceps, curved	VWR	82027-384
1,000 μl Pipette tips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipette tips	VWR	37001-530
Equipment
Peristaltic pump	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3