Identificando interacção proteína-proteína em<em> Drosophila</em> Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Summary

Drosophila é famoso por sua poderosa manipulação genética, mas não para a sua adequação de análises bioquímicas em profundidade. Aqui apresentamos um procedimento baseado em TAP para identificar interagindo parceiros de qualquer proteína de interesse a partir do cérebro da mosca. Este procedimento pode potencialmente levar a novos caminhos de pesquisa.

Abstract

Telas genéticas realizadas utilizando Drosophila melanogaster (mosca da fruta) fizeram numerosas descobertas marco no avanço das ciências biológicas. No entanto, o uso de telas bioquímicas destinadas a estender o conhecimento adquirido a partir da análise genética foi explorada apenas recentemente. Aqui nós descrevemos um método para purificar o complexo de proteínas que se associa com qualquer proteína de interesse a partir de cabeças de moscas adultas. Este método tira vantagem do sistema de Drosophila GAL4/UAS para expressar uma proteína isco fundido com um tag de afinidade em tandem de Purificação (TAP) em neurónios mosca in vivo, e, em seguida, executa duas rondas de purificação utilizando um procedimento de TAP semelhante à originalmente estabelecido em levedura ¹ para purificar o complexo de proteína que interage. No final deste procedimento, uma mistura de vários complexos de proteína é obtido cujas identidades molecular pode ser determinada por espectrometria de massa. Validação das proteínas candidatos serão beneficiados com a resource e facilidade de realizar estudos de perda de função em moscas. Abordagens semelhantes podem ser aplicados a outros tecidos de moscas. Acreditamos que a combinação de manipulações genéticas e esta abordagem proteômica no sistema modelo mosca tem um tremendo potencial para a resolução dos problemas fundamentais no campo da neurobiologia e além.

Introduction

Definindo as vias moleculares ou redes que mediam um processo biológico em particular é um dos objetivos finais da pesquisa biomédica. Fly geneticistas têm dependido fortemente de genética para a frente, especialmente modificador telas genéticos (tanto Enhancer e telas supressores), para identificar os fatores que trabalham em conjunto, em paralelo com, ou a montante ou a jusante de um gene de interesse. No entanto, as telas de genética para a frente muitas vezes não conseguem identificar genes essenciais que, quando mutado, causar letalidade em estágios iniciais de desenvolvimento, ou genes com redundância funcional e compensação cuja perda de função só causar defeitos subtis que são difíceis de marcar. Uma maneira de superar essa dificuldade é para triagem de interações proteína-proteína diretos. Por mais de uma década, uma lista crescente de métodos bioquímicos, incluindo levedura de dois híbridos, display de fagos, cross-linking química, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), etc. têm sido utilizados para investigar proteína-proteína interações. Cada uma dessas abordagens tem seu próprio conjunto de pontos fortes e fracos em relação à sensibilidade e especificidade. Entre eles, o método permite que a TAP para detecção da interacção física sob condições quase fisiológicas, preserva a especificidade e consistência ² e inclui a capacidade de estender a análise de alto rendimento ^{de 3,4.}

O método TAP foi originalmente desenvolvido na levedura por colegas Rigautand ^1. Neste método, uma proteína de interesse é expressa com uma etiqueta TAP. A etiqueta TAP abriga dois domínios de ligação de afinidade independentes: uma proteína de um domínio que se liga a IgG e um domínio de ligação à calmodulina. Os dois domínios estão separados por um local de clivagem de TEV (Tobacco Etch Vírus). Essa combinação permite a duas rodadas independentes de purificações de afinidade para reduzir suficientemente ligações inespecíficas e enriquecer vinculações específicas ^1. Para este exemplo, o método TAP é um poderoso metodod para identificar interacções in vivo de uma determinada proteína, embora o sobre-expressam a proteína exógena pode torná-lo mais propenso a associar-se com proteínas que normalmente não fazem complexo com o seu homólogo endógeno. Uma vez que o seu desenvolvimento, o método da TAP foi aplicado em muitos outros sistemas, incluindo–base de cultura de células e outros sistemas de ^5,6 in vivo, os sistemas modelo ^{de 6-9.} Aqui nós descrevemos a adaptação do método TAP em Drosophila. O primeiro gerar pUAST-NTAP e pUAST-CTAP vectores para facilitar a clonagem e a fusão da etiqueta TAP ou o N-ou C-terminal do gene de interesse. A-marcado com TAP UAS transgene é, então, expresso no sistema nervoso sob o controlo de um controlador ¹⁰ de GAL4 neuronal. Em seguida, um grande número de cabeças de moscas adultas serão recolhidos, que tem elevado teor de células neuronais e são fáceis de separar a partir de outras partes do corpo, após a congelação com base em diferenças de tamanho. As cabeças adultas são homogeneizados e limpou bcentrifugações sequenciais y, e o sobrenadante é sujeito a um procedimento de TAP descrito abaixo.

Protocol

1. Gerar UAS-marcado pela TAP Moscas transgênicas Gerar pUAST marcadas pela TAP construções de DNA. Decidir qual o lado (N-ou C-terminal) da proteína isco a etiqueta TAP deverá ser fundido a, com base na estrutura / função da proteína. Veja a discussão para mais detalhes. Subclonar a região de cDNA codificadora do gene de interesse para os múltiplos locais de clonagem (MCS) dos vectores de pUAST-NTAP ou pUAST-CTAP para gerar N-ou C-terminal marcadas transgenes UAS-TAP, respectiva…

Representative Results

Aqui demonstramos o nosso esforço na identificação de proteínas Highwire-que interagem no cérebro da mosca. Highwire (Hiw) e seus homólogos de vertebrados e invertebrados são enormes ligases de ubiquitina que regulam o desenvolvimento e reparação do sistema nervoso 14. Eles compartilham um número de domínios funcionais altamente conservadas. No entanto, suas ações moleculares não são totalmente claras. Trabalho feito em verme, mosca e do rato levou à do modelo de trabalho actual que funciona c…

Discussion

Método de purificação por afinidade em tandem (TAP) oferece um protocolo de purificação dupla que permite o isolamento e enriquecimento de complexos de proteínas por meio de duas etapas independentes de purificação de afinidade. O design da marca TAP não se restringe ao que é apresentado neste protocolo, outros domínios de ligação de proteínas e motivos também são aplicáveis ​​se as condições do tampão são ajustados em conformidade. Um bom exemplo de outras tags TAP é a marca GS-TAP, uma combin…

Materials

U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340