Summary
ذبابة الفاكهة تشتهر التلاعب وراثية قوية، ولكن ليس لمدى ملاءمتها من التحليل المتعمق البيوكيميائية. هنا نقدم الداخلي القائم على TAP لتحديد الشركاء التفاعل من أي بروتين من الفائدة من الدماغ الطاير. يمكن لهذا الإجراء أن تؤدي إلى طرق جديدة للبحث.
Abstract
جعلت شاشات الجينية التي أجريت باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن (ذبابة الفاكهة) العديد من الاكتشافات بارزة في تقدم العلوم البيولوجية. ومع ذلك، تم استكشاف استخدام شاشات البيوكيميائية التي تهدف إلى توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من التحليل الجيني في الآونة الأخيرة فقط. نحن هنا تصف طريقة لتنقية معقدة البروتين الذي الزميلة مع أي بروتين من الفائدة من رؤساء ذبابة الكبار. هذا الأسلوب يستفيد من نظام ذبابة الفاكهة GAL4/UAS للتعبير عن البروتين الطعم تنصهر مع علامة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) في الخلايا العصبية ذبابة في الجسم الحي، ومن ثم تطبق جولتين من تنقية باستخدام إجراء TAP مماثلة لتلك التي أنشئت أصلا في الخميرة 1 لتنقية معقدة البروتين التفاعل. في نهاية هذا الإجراء، يتم الحصول على خليط من البروتين المجمعات متعددة الذي يمكن تحديده من خلال مطياف الكتلة الهويات الجزيئية. سوف المصادقة على البروتينات مرشح الاستفادة من صesource وسهولة أداء الخسارة من وظيفة الدراسات في الذباب. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على الأنسجة ذبابة أخرى. ونحن نعتقد أن الجمع بين التلاعب الجيني وهذا النهج البروتين في النظام النموذجي ذبابة يحمل إمكانات هائلة لمعالجة المشاكل الأساسية في مجال بيولوجيا الأعصاب وخارجها.
Introduction
تحديد المسارات الجزيئية أو الشبكات التي تتوسط عملية بيولوجية معينة هي واحدة من الأهداف النهائية للبحوث الطبية الحيوية. يطير علماء الوراثة قد تعتمد اعتمادا كبيرا على الوراثة إلى الأمام، وخاصة معدل شاشات الجينية (سواء محسن وشاشات القامع)، لتحديد العوامل التي تعمل معا، بالتوازي مع، أو المنبع أو المصب من الجينات في المصالح. ومع ذلك، وشاشات الوراثة إلى الأمام في كثير من الأحيان تفشل مرات لتحديد الجينات الأساسية التي، عندما تحور، يسبب الفتك في مراحل النمو المبكرة، أو الجينات مع التكرار وظيفية والتعويض الذي يسبب فقدان وظيفة العيوب الخفية التي هي سكنت الشباك فقط. طريقة واحدة للتغلب على هذه الصعوبة هو للكشف عن مباشرة تفاعلات البروتين البروتين. لأكثر من عقد من الزمن، قائمة متزايدة من أساليب الكيمياء الحيوية، بما في ذلك الخميرة اثنين الهجين، وعرض فج والكيميائية عبر ربط، المشارك IP، جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)، الخ. وقد استخدمت للتحقيق في البروتينتفاعلات البروتين. كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من نقاط القوة والضعف في ما يخص الحساسية والنوعية. فيما بينها، ويسمح أسلوب TAP للكشف عن التفاعل المادي في ظل ظروف شبه الفسيولوجية، ويحافظ على خصوصية والاتساق 2 ويشمل القدرة على تمتد إلى الإنتاجية العالية يحلل 3،4.
طريقة TAP وضعت أصلا من قبل الزملاء في الخميرة Rigautand 1. في هذه الطريقة، يتم التعبير عن بروتين في المصالح مع علامة TAP. علامة TAP تؤوي اثنين من المستقلين ملزم تقارب المجالات: بروتين A المجال الذي يربط مفتش ومجال كالمودولين ملزم. يتم فصل اثنين من المجالات من قبل TEV (التبغ إحفر الفيروسات) موقع الانقسام. مثل هذا الجمع يسمح للجولتين مستقلة عن التنقيات تقارب بما فيه الكفاية للحد من الارتباطات غير محددة وإثراء الارتباطات محددة 1. لهذا المثال، الأسلوب TAP هو metho قوية جداد لتحديد التفاعلات في الجسم الحي من بروتين معين، على الرغم من overexpressing البروتين الخارجية قد جعلها أكثر عرضة للربط مع البروتينات التي تفعل عادة يست معقدة مع نظيرتها المحلية. منذ تطورها، وقد تم تطبيق الأسلوب TAP في العديد من الأنظمة الأخرى، بما في ذلك المستندة إلى خلية ثقافة النظم 5،6 وغيرها من النظم في الجسم الحي نموذج 6-9. نحن هنا وصف التكيف للأسلوب TAP في ذبابة الفاكهة. علينا أولا توليد pUAST-NTAP وpUAST-CTAP ناقلات لتسهيل الاستنساخ والانصهار للعلامة TAP إما إلى N-أو C-محطة من الجينات في المصالح. ثم يتم أعرب الموسومة TAP UAS التحوير في الجهاز العصبي تحت سيطرة السائق GAL4 العصبية 10. المقبل، وسيتم جمع عدد كبير من رؤساء ذبابة الكبار، التي لديها نسبة عالية من الخلايا العصبية وسهلة لفصل من أجزاء أخرى من الجسم بعد تجميد بناء على حجم الخلافات. رؤساء الكبار هي المتجانس وتطهيرها بcentrifugations متتابعة ذ، وطاف يخضع لإجراء TAP هو موضح أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا
- توليد pUAST-الموسومة TAP بنيات الحمض النووي.
- تقرر أي جانب (N-أو C-محطة) من البروتين الطعم يجب أن تنصهر العلامة TAP ل، على أساس هيكل / وظيفة البروتين. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
- Subclone المنطقة الترميز كدنا] من الجين من الفائدة في مواقع الاستنساخ متعددة (MCS) من pUAST-NTAP أو pUAST-CTAP ناقلات لتوليد N-أو C-محطة الموسومة الجينات المحورة UAS-TAP، على التوالي. انظر الشكل 1 لخرائط مفصلة وقابلة للاستخدام مواقع التقييد وإطارات القراءة.
- توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا.
- تولد الذباب المعدلة وراثيا باستخدام البروتوكولات القياسية التالية ف بوساطة عنصر الإدراج 11. تتوفر تجاريا عدد من الخدمات الحقن.
- عبور العصبية السائق GAL4 (أي BG380-GAL4) إلى كل سطر المعدلة وراثيا الفردية وتحديد مستويات بروتين تعبيركل سطر من قبل لطخة غربية (مع البيروكسيداز مكافحة البيروكسيداز الضد) و / أو المناعية (مع مكافحة TAP الضد). بشكل عام، ينصح خط المعدلة وراثيا مع مستوى التعبير البروتين الذي هو على مقربة من البروتين الذاتية لإجراءات TAP. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
- PerformGAL4/UAS-based تجارب الانقاذ لتأكيد وظيفة الجينات المحورة الموسومة TAP إذا كانت الخسارة من وظيفة المسوخ من الجينات ذات الاهتمام المتاحة. اختيار التحوير التي يمكن أن تنقذ كثيرا من الظواهر متحولة للتجارب TAP التالي.
2. تحضير العينات لإجراء TAP
- توليد مخزون ذبابة الذي يحمل كلا من السائق GAL4 العصبية (مثل BG380-GAL4) واختار التحوير الموسومة TAP من أجل تخفيف توسع عينات الطاير. جمع السلالات F1 السائق GAL4 وعبر UAS التحوير في حالات نادرة عندما يتسبب مزيج أعلاه البقاء والنمو غير مؤات. </ لى>
- جمع العينات الصغيرة وتحسين حالة تحلل لsolubilizing البروتين الموسومة TAP.
- جعل سلسلة من مخازن تحلل باستخدام مزيج من المنظفات غير أيوني NP-40 (0.1-1٪)، NaDOC (0.1-1٪) وتريتون X-100 (،05-،5٪). انظر الجدول رقم 1 والمناقشة لمزيد من المعلومات.
- على رأس وسادة CO2، استخدام # 5 ملقط لتشريح 20 رؤساء الكبار من التحوير TAP معربا عن الذباب وجمعها في أنبوب 1.5 مل لاختبار كل حالة تحلل العازلة.
- إضافة 100 UL العازلة اختبار تحلل إلى أنبوب والتجانس رؤساء بواسطة التمسيد صعودا وهبوطا مع مدقة البلاستيك، ثم يضاف اختبار عازلة آخر 100 UL.
- تدور المحللة في الرأس 21،500 x ج لمدة 10 دقيقة (4 ° C)، وفصل طاف بيليه وبعد الطرد المركزي. إضافة 25 شباط 2X العازلة تحميل SDS لبيليه و10 ماي 4X العازلة تحميل SDS إلى 30 ماي من طاف على التوالي.
- غلي العينتين لمدة 5 دقائق وتحليلها جنبامن جانب باستخدام SDS-PAGE واللاحقة البقعة الغربية مع الأجسام المضادة PAP. تحديد الذوبان من نسبة مستويات TAP-البروتين في طاف مقابل بيليه.
- تحضير العينة في نطاق واسع
- توسيع وجمع الذباب الكبار.
- توسيع المخزون neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene في زجاجات والوجه الزجاجات وتستخدم كل 3 أيام حتى التراكمي 250 زجاجات لجمع.
- الذباب الكبار جمع 1-3 أيام القديمة إلى 50 مل أنابيب مخروطية، ووضع أنبوب في النيتروجين السائل على الفور لتجميد عميق الذباب. تخزين الذباب في الفريزر -80 درجة مئوية. لاحظ أن حجم الذباب يجب أن لا تتجاوز 2/3 من أنبوب 50 مل.
- جمع رؤساء ذبابة (تنفيذ هذه الخطوة على رأس الثلج الجاف المجفف).
- اخراج المناخل prechilled وهاون ومدقة من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها على الثلج الجاف، من الناحية المثالية داخل دلو الثلج الكبيرة. كومة اثنين من الولايات المتحدة الأمريكية مناخل الاختبار القياسية مع رقم 25 على الأعلى الإلكترونية ورقم 40 في الجزء السفلي.
- أخذ الذباب المجمدة خارج وإفلاتها في النيتروجين السائل والحفاظ على الذباب في هناك لمدة 10 دقيقة. دوامة أو تهزه بقوة أنابيب لكسر رؤساء والساقين، وأجنحة من الجثث.
- صب الخليط في منخل أعلى، ثم يهز المناخل بقوة حين عقد كل من المناخل معا. بعد غربلة، فإن الهيئات البقاء على المنخل العلوي، ويطير سيتم الاحتفاظ الرؤوس على غربال القاع، وسوف الساقين، وأجنحة، وغيرها من الحطام يسقط على الثلج الجاف. فصل اثنين من المناخل وبعناية نقل رؤساء يطير إلى هاون الباردة.
- التجانس رؤساء ذبابة
- على قمة الثلج الجاف، طحن رؤساء مع هاون ومدقة لجزيئات مسحوق، ثم نقل إلى مسحوق الزجاج 15 مل Dounce الأنسجة المطحنة التي كانت prechilled على الجليد.
- قياس أوزان طاحونة قبل وبعد سكب العينة رئيس في ذلك، ومن ثم حساب مدى عصيدة رئيسلو يزن. وهناك ما مجموعه 6-15 غرام من رؤساء ذبابة تكون كافية لكل تجربة TAP تعديل وفقا لذلك إلى مستويات التعبير من البروتين. إضافة 15 مل من العازلة التجانس الجليد الباردة (تحلل العازلة الأمثل في الخطوة 2.2) إلى مسحوق ثم السكتة الدماغية مع مدقة تخليص كبير حتى أنه من السهل للمدقة للذهاب إلى أعلى وأسفل. الحفاظ على طاحونة الزجاج على الجليد في جميع الأوقات.
- إعداد طاف لTAP
- نقل جناسة لأنبوب الطرد المركزي عالية السرعة وتدور لمدة 20 دقيقة في ~ 50،000 x ج (4 درجات مئوية). نقل طاف إلى عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي الجديدة وتكرار الطرد المركزي مرة أخرى.
- نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وإجراء 40 دقيقة ~ 250،000 x ج تدور لمزيد من مسح طاف. طاف مستعدة للإجراءات تنقية تقارب جنبا إلى جنب بعد تنبيذ فائق.
- توسيع وجمع الذباب الكبار.
3. TAP تنقية وقد استمدت الأقسام التالية من المختبر TAP سيرافين protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- أداء مفتش حبة تنقية تقارب
- إعداد مفتش sepharose و حبة في حين يتم طرد العينات. غسل 400 ميكرولتر 3X حبة مفتش في أنبوب فالكون 15 مل مع 10 مل الباردة مفتش غسل العازلة. لكل غسل، صخرة الأنبوب برفق لمدة 2 دقيقة، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة أخرى. في نهاية غسل ثالث، وإزالة العازلة وترك فقط حبات في الأنبوب.
- نقل بعناية طاف تطهيرها (~ 15 مل) في أنبوب 15 مل تحتوي على حبات مفتش. احتضان حبات ومزيج المحللة الدماغ في 4 º C على nutator لمدة 2 ساعة.
- إعداد عمود الصغيرة نظيفة وفارغة مع حوالي 15 مل الحجم الإجمالي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة مفتش بصب المزيج بشكل مطرد في العمود؛ ليس محاولة لاعتراض أيفقاعات الهواء داخل العمود. السماح حبات لتسوية في العمود والمخزن المؤقت لاستنزاف ببطء عن طريق تدفق الجاذبية.
- غسل العمود تماما مع 10 مل من البرد العازلة غسل مفتش بعد كل من المحللة الدماغ قد تدفقت من خلال العمود مفتش تسويتها. تكرار غسل 2X. ملاحظة: لا تدع حبة الجافة في الهواء.
- أداء TEV انشقاق
- بعد غسل الثالث، وغسل العمود مرة أخرى مع 10 مل TEV العازلة الانقسام. هذه الخطوة تعد حبة مفتش أن sequestrates مجمع الطعم لTEV انشقاق.
- الحق قبل آخر قطرة من العازلة TEV على وشك الخروج بالتنقيط، ووضع غطاء على الجزء السفلي من العمود لمنع التدفق، إضافة 1.3 مل TEV العازلة التي تحتوي على 130 وحدة من إنزيم TEV إلى العمود، ثم سقف آمن أعلى العمود. تأكد من اغلاق العمود جيدا في كلا الجانبين.
- تدوير العمود في 18 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للانزيم TEV ليلتصق الببتيد في موقع TEV والافراج عن بروتين معقد مبادرة الخوذ البيضاءلو ترك وراء بروتين الببتيد نطاق منضمة إلى الخرز ومفتش sepharose و.
- أداء كالمودولين حبة تنقية تقارب
- إعداد حبات كالمودولين حين يتم تحضين حبات مفتش مع انزيم TEV. تغسل حبات 200 ميكرولتر كالمودولين في 15 مل فالكون 3X أنبوب، في كل مرة مع 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. لكل غسل، صخرة بلطف الأنبوب لمدة 2 دقيقة على nutator، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة. في نهاية غسل ثالث، واخراج كل المخزن المؤقت وترك فقط حبات في الأنبوب.
- في نهاية الحضانة TEV (الخطوة 3.2.3)، والعودة العمود مفتش مرة أخرى إلى الغرفة الباردة وضعه بشكل مستقيم. اسمحوا حبات تسوية لمدة 10 دقيقة.
- إزالة الغطاء العلوي ثم السفلي الغطاء، ثم جمع 1.3 مل TEV المنتج الانقسام في أنبوب فالكون 15 مل. السماح للاستنزاف عازلة تماما. إضافة مبلغ إضافي قدره 200 TEV العازلة ميكرولتر إلى العمود على طرد حجم القتلى من العمود، وجمع ومنخفض خارج في نفس الأنبوب.
- إضافة 4.5 مل من كالمودولين العازلة و 4.5 ميكرولتر 1 M و CaCl 2 ملزما للانشقاق المنتج 1.5 مل TEV جمعت أعلاه. وو CaCl 2 يعمل على عاير على EDTA في المخزن المؤقت TEV. نقل 6 مل الخليط إلى أنبوب يحتوي على حبات كالمودولين وتدوير الأنبوب في 4 º C على nutator لمدة 1 ساعة.
- إنشاء عمود الصغيرة نظيفة وفارغة أخرى مع حوالي 10 مل الحجم الكلي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة كالمودولين إلى العمود والسماح لها استنزاف بفعل الجاذبية.
- عندما تدفقت كل حل من خلال العمود كالمودولين استقر، وغسل العمود مرتين، ولكل منها 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. ملاحظة: تجنب إزعاج الخرز كالمودولين ومحاولة للحفاظ على السطح من الخرز شقة ممكن أثناء الغسيل.
- أزل مجمع الطعم من العمود كالمودولين.
الحق بعد الغسيل، أزل العمود كالمودولين مع خمسة كسور 200 ميكرولتر Calmodu الباردةلين شطف العازلة. لكل جزء، إضافة بلطف 200 ميكرولتر من شطف العازلة إلى العمود وجمع شطافة مع علامة 1.5 مل أنبوب إيبندورف. كرر هذه 4X. - تحليل بروتين معقد بواسطة SDS-PAGE
- اتخاذ قسامة صغيرة من كل من الكسور خمسة (حوالي 30 ميكرولتر) وإضافة SDS العازلة تحميل. تغلي العينات لمدة 5 دقائق وتحميل العينات جنبا إلى جنب مع الواسمات الجزيئية البروتين في الانحدار (4-15٪) هلام SDS-PAGE.
- بعد عينات وحلها بالكامل في هلام، ووقف الكهربائي وصمة عار الجل مع أي حساسية الغروية إجراءات تلطيخ Coomassie مقرها G-250-مثل 'الفضة الأزرق' تلطيخ 13. الفضة تلطيخ هو اختياري ولكن ليس الأفضل لأنها ليست متوافقة تماما مع لاحقة تحليل الطيف الكتلي. تخزين ما تبقى من شطافة في الفريزر -80 ° C لمزيد من التحليل مثل مطياف الكتلة للكشف عن هويات الجزيئي للبروتين معقد المنقى. حد ذاتهاالمناقشة الإلكترونية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا لشرح الجهود التي نبذلها في تحديد البروتينات موقع HighWire-التفاعل في الدماغ الطاير. موقع HighWire (HIW) والفقاريات واللافقاريات المتماثلات لها هي ligases اليوبيكويتين الضخمة التي تنظم تطوير وإصلاح الجهاز العصبي 14. أنها تشترك في عدد من المجالات الوظيفية حفظا للغاية. ومع ذلك، أفعالهم الجزيئية ليست واضحة تماما. العمل المنجز في دودة، ويطير وأدى الماوس إلى نموذج العمل الحالي الذي يعمل بمثابة يغاز HIW E3 وكما بروتين السقالات لتسهيل تشكيل مجمع ubiquitination متعددة الوحيدات، الذي ينظم نوع محدد ظائف الخلايا العصبية والخلايا وقت من خلال مزيج من التفاعل مع العوامل المساعدة المختلفة، واستهداف ركائز اليوبيكويتين مختلفة. لتحديد مجمع ubiquitination HIW المصاحب، ونحن ولدت لأول مرة N-محطة الموسومة التحوير UAS-TAP-HIW أن تعمل بكامل طاقتها في إنقاذ النمط الظاهري متحولة HIW 15. حوالي 10 غرام من الكبار فلوريدا تم جمع رؤساء ذ التي تعبر عن TAP TAP-فقط أو HIW البروتينات المعدلة وراثيا وتعرض لإجراءات الجانب TAP إلى جنب كما هو موضح أعلاه. وقد تم تحليل eluates النهائي من كلا التنقيات بواسطة SDS-PAGE ثم الفضة تلطيخ. حدد قياس الطيف الكتلي قائمة من البروتينات في عينة TAP-HIW فقط، بما في ذلك ذبابة الفاكهة FSN (DFsn، وهو البروتين F-مربع) وRae1 (الشكل 2). وكشفت التحليلات الجينية والبيوكيميائية اللاحقة التي HIW وDFsn العمل معا كما SCF-E3 معقدة مثل يغاز اليوبيكويتين لتنظيم هيكل متشابك وظيفة 16، والزميلة Rae1 مع HIW في الجسم الحي ويقيد فرط متشابك 17. هذه الوظيفة من Rae1 على الأقل من خلال قدرتها على تعزيز الاستقرار HIW البروتين عن طريق حماية HIW من تدهور ذاتية البلعمة، والذي يكشف عن آلية الرواية التي تسيطر بشكل انتقائي HIW البروتين وفرة خلال تطوير متشابك 17 تحقق جزئيا.
gether.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. المتجهات لتوليد-TAP الموسومة الذباب المعدلة وراثيا. (A) وخريطة للpUAST-NTAP بناء. (ب) خريطة للpUAST-CTAP بناء. يتم وضع علامة على المواقع استنساخ متعددة (MCS) في كل من يبني مع شريحة، حيث يتم عرض المواقع تقييد واحد قطع مع اللون الأحمر. (C) تسلسل الأولية تبين مواقع الاستنساخ متعددة من ناقلات TAP مع إطار القراءة للعلامة TAP. لتسهيل subcloning، يتم إنشاء اثنين من أكثر البنى NTAP من الأصل pUAST-NTAP: pUAST-NTAP +1 وpUAST-NTAP +2. معا NTAP ثلاثة يبني يغطي جميع الأطر القراءة الثلاثة الممكنة لاستيعاب استخدام MCS. هي التي شيدت جميع ناقلات باستخدام NTAP أو شظايا CTAP ولدت أصلا فيلاب سيرافين 1. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
. الرقم 2 تنقية موقع HighWire-التفاعل البروتينات من الدماغ عن طريق ذبابة تنقية TAP رؤساء الكبار من الذباب معربا عن TAP. (BG380-GAL4؛ UAS-TAP) أو TAP-HIW (BG380-GAL4؛ UAS-TAP-HIW) في الجهاز العصبي يتم جمعها، المتجانس، وتعرض لتنقية TAP، على التوالي. تم تحليل eluates النهائي ذات بعد واحد هلام SDS-PAGE تليها الفضة تلطيخ. رأس السهم يشير إلى الطعم البروتين HIW والنجمة يشير إلى وجود البروتين TAP اقتطاع بسبب الانقسام TEV. في العينة TAP-HIW، ويتم تحديد قائمة من البروتينات التي كتبها الشاملالطيف، بما في ذلك شهادة الثانوية العامة-70، β-تويولين، Rae1 وDFsn (المشار إليها السهام). يتم تعديل هذا الرقم من الشكل 1A تيان آخرون 17 اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| العازلة | تركيب | تعليقات |
| تحلل العازلة | 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 | ملاحظة: 1) إضافة DTT والبروتيني ومثبطات proteasome وفقط قبل الاستخدام. |
| 125 ملي مول كلوريد الصوديوم | 2) عرض هنا هو تحلل العازلة مع 0.5٪ NP40. انظر مناقشة للتعديلات على المنظفات غير أيوني. | |
| 5٪ الجلسرين | ||
| 0.5٪ NP40 | ||
| 1.5 ملي MgCl 2 | ||
| 25 ملي ناف | ||
| 0.2 ملي DTT | ||
| (وفيما يلي البروتيني وproteasome ومثبطات) | ||
| 1 ملم نا 3 VO 4 | ||
| 0.05 ملي MG-115 | ||
| 1 ملم PMSF | ||
| البروتيني مزيج المانع (سيغما P8340) | ||
| مثبط البروتياز كوكتيل (روش 04693159001) | ||
| مفتش غسل العازلة | 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) | |
| 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) | ||
| 0.1٪ NP40 (1.0 مل من الأسهم 10٪) | <الدفتيريا>||
| H 2 0 إلى 100 مل النهائي | ||
| عازلة انشقاق TEV | 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) | ملاحظة: إضافة DTT فقط قبل الاستخدام. |
| 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) | ||
| 0.1٪ NP40 (1.0 مل من الأسهم 10٪) | ||
| 0.5 ملي EDTA (100 ميكرولتر من 0.5 M الأسهم) | ||
| 1 ملم DTT (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| H 2 O إلى 100 مل النهائي | ||
| العازلة ملزمة كالمودولين | 10 ملي β-المركابتويثانول (69.7 ميكرولتر من الأسهم) | |
| 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) | ||
| 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) | ||
| 1 ملي المغنيسيوم خلات (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| 1 ملي إيميدازول (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| 2 مم CaCl 2 (200 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| 0.1٪ NP40 (1 مل من الأسهم 10٪) | ||
| H 2 O إلى 100 مل النهائي | ||
| العازلة كالمودولين شطف | 10 ملي β-المركابتويثانول (69.7 ميكرولتر من الأسهم) | |
| 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) | ||
| 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) | ||
| 1 ملي المغنيسيوم خلات (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| 1 ملي إيميدازول (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) | ||
| 10 ملي EGTA (2 مل من 0.5 M الأسهم) | 0.1٪ NP40 (1 مل من الأسهم 10٪) | |
| H 2 O إلى 100 مل النهائي |
الجدول 1. تكوين مخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم طريقة تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) بروتوكول تنقية المزدوجة التي تسمح للعزلة وإثراء المجمعات البروتين من خلال خطوتين مستقلة تنقية تقارب. ولا يقتصر تصميم علامة TAP إلى ما يرد في هذا البروتوكول، والمجالات الأخرى ملزمة البروتين والزخارف تنطبق أيضا إذا تم تعديل شروط العازلة وفقا لذلك. وخير مثال على TAP به الآخر هو علامة GS-TAP، وهو مزيج من بروتين G وعزر ملزم streptavidin، الذي صممه مجموعة جوليو Superti-Furga الرامية إلى تنقية معقدة البروتين في خطوط خلايا الثدييات مثقف 18. تم تعديل GS-TAP في وقت لاحق لدراسة التفاعل البروتين البروتين في خلايا ذبابة الفاكهة S2 والأجنة 19. إن الرب منشور صدر مؤخرا عن بيلي وآخرون. أظهرت كيف تم تنفيذ الإجراء GS-TAP مع زراعة الخلايا المحللة 20. نحن هنا قدم استخدام TAP-العلامة في الأنسجة العصبية ذبابة الفاكهة (الإعلانرؤساء ULT) لنطاق واسع فحص البروتين. هذا البروتوكول يمكن تكييفها يحتمل أن الأنسجة الأخرى التي تسمح جمع العينات على نطاق واسع، مثل الأجنة. ويمكن أيضا أن تستخدم الهيئات الكبار جمعها على المنخل العلوي (خطوة 2.3.2.3) لTAP، والتي يمكن أن يكون مهمة صعبة للغاية. يجب أن يتم تعديل وتكييف تحلل العازلة لمنع البروتياز ضخمة موجودة في الجهاز الهضمي في معظم واختصارها الإجراء تنقية الأول بشكل كبير من أجل تقليل زمن التعرض للبروتينات إلى البروتياز. على الرغم من أن العلامات TAP مختلفة تتطلب المناولة المختلفة والظروف عازلة للالتنقيات تقارب، المبادئ العامة لTAP هي نفسها. أدناه نناقش المسائل التي من شأنها أن تؤثر على جودة نتائج TAP.
نجاح النهج TAP يعتمد على توليد التحوير الحق. أولا، يجب على علامة TAP نفسها لا تغيير التشكل العام للبروتين الطعم، وهو أمر حاسم في الاحتفاظ بقدرتهاللتفاعل مع شركائها ملزمة الفسيولوجية. وبالتالي، من الأهمية بمكان أن تقرر أين صهر العلامة TAP لهذا الجين من الفائدة. يمكن اتخاذ قرار بناء على الدراسات السابقة من البروتين، وخصوصا المعلومات حول هيكلها أو الجينات المحورة الموسومة epitode الوظيفية. في حالة مثل هذه المعلومات غير متوفرة، ووضع علامات البروتين في الطعم أو N-C-محطة بالتوازي ينصح. ثم تجارب الانقاذ وظيفية لا يمكن أن يؤديها لتحديد أي التحوير ينبغي استخدامها. ثانيا، ينبغي أن مستويات التعبير من البروتين المعدلة وراثيا أن تكون قريبة من البروتين الذاتية. هذا مهم خاصة أن نظام GAL4/UAS تدفع عادة للتعبير عن التحوير في توقيت مختلف وعلى مستوى أعلى بكثير بالمقارنة مع البروتينات الذاتية، والتي قد إما زيادة ايجابيات كاذبة أو يسبب عواقب غير متوقعة تغير الملف الشخصى التفاعل البروتين الشبكات في الخلايا. على سبيل المثال، قد overexpressing البروتينات سقالات مركز دراسات الوحدة العربيةه الآثار السلبية المهيمنة وoverexpressing البروتينات التي تمتلك الأنشطة الأنزيمية، مثل تحركات، في كثير من الأحيان يسبب زيادة من وظيفة الآثار، وكلاهما قد بدوره يؤثر على قدرة الشركاء ملزمة الذاتية الخاصة بهم للتفاعل معها. وبالتالي، فإن نظام GAL4/UAS يجب تجنبها عند توقيت ومستوى التعبير عن الجينات في المصالح أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التفاعلات الذاتية التي تقدم فقط في ظل ظروف طبيعية. بدلا من ذلك، ينبغي أن تسيطر التعبير عن التحوير الموسومة TAP تحت المروج الخاصة. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق استبدال تسلسل UAS مع تسلسل المروج الذاتية، أو عن طريق التفجير تسلسل TAP في الإطار مع تسلسل exonal في جزء الحمض النووي الجيني الذي يحتوي على مواضع كاملة من الجينات في المصالح 21. في بعض الحالات، فإن التجربة التونسية يمكن أن يؤديها في فقدان وظيفة خلفية متحولة من الجينات في المصالح للحد من المنافسة من البروتين الذاتية للالمؤتمر الوطني العراقيorporating في المجمعات multiprotein. لهذا المثال، خلفية فارغة البروتين، إن وجدت، ويوفر حالة مثالية للقضاء تماما على البروتين الذاتية. وسوف تستخدم الخلفية متحولة الوراثية دائما زيادة فرصة لتحقيق نتائج ذات جودة أعلى.
ذوبان البروتين الطعم هو عامل حاسم آخر للنجاح. وتستخدم المنظفات غير أيوني عادة في تحلل العازلة لإذابة غشاء البلازما والإبقاء على بروتين معقد، قابل للذوبان وسليمة، في الحالة التي هي قريبة من البيئة الفسيولوجية. ولكن اعتمادا على ما إذا كان أو لم يكن البروتينات ذات الاهتمام هي بروتينات أو المرتبطة متكاملة الغشاء، يمكن تكوين وتركيز المنظفات غير أيوني تكون حاسمة لsolubilizing البروتين الطعم. 0.1-0.3٪ NP40 غالبا ما تكون كافية لذوبان البروتينات عصاري خلوي. للبروتينات الغشاء، وهو مزيج من NP40 (0.1-1٪)، NaDOC (0.1-1٪)، وتريتون X-100 (،05-،5٪) مطلوب في بعض الأحيان إلى solubiليز وإثراء ما يكفي من البروتينات للتجربة التونسية. ومع ذلك، منذ العازلة تحلل صارمة تميل إلى تعطيل أضعف البروتين البروتين التفاعلات، يحتاج إلى توازن التي سيتم التوصل إليها في البروتينات التي الطعم بما فيه الكفاية القابلة للذوبان الموجودة في العينة، وفي الوقت نفسه يتم الحفاظ على غالبية تفاعلات البروتين البروتين. والمبدأ العام هو أن نحاول دائما إلى استخدام أقل عدد من أنواع المنظفات بأقل تركيز.
لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها، فإنه يوصى بشدة لحفظ قسامة صغيرة من العينة من كل خطوة من التنقيات اثنين. اللاحقة SDS-PAGE والبروتين تلطيخ / تحليل الغربية على مأخوذة تسمح مستويات البروتين الطعم وتخصيب متتابعة من الأنواع البروتين معينة ليتم رصدها. على سبيل المثال، إذا تم الكشف عن انخفاض مفاجئ من البروتين الطعم في قسامة من تدفق المغادرة بعد انشقاق TEV (الخطوة 3.3.3)، فمن المرجح أن البروتين الطعم ضاعت خلال مفتش حبة الغسيل (الخطوة 3.1.4) . A POSSالسبب إيبل قد يكون تركيبة المنظفات عدم كفاية غسل العازلة مفتش. هناك انخفاض حاد على تكوين وتركيز المنظفات في غسل العازلة مفتش (0.1٪ NP-40 فقط) بالمقارنة مع تحلل العازلة. قد يكون الطعم البروتين الحساسة لهذه التغيرات وتنأى عن شاردة مفتش على الخرز. ضبط غسل مفتش نحو تحلل العازلة قد تساعد في حل المشكلة. بدلا من ذلك، على الرغم من أن أقل احتمالا، وانشقاق TEV (الخطوة 3.2) قد لا يكون عملت بما فيه الكفاية للافراج عن مجمع يحتوي على الطعم من الخرز مفتش. الخطوات تستحق التفتيش الثانية هي موازنة من الخرز مفتش مع العازلة TEV (الخطوة 3.2.1) ونشاط انزيم، سوء قد أمات الانزيم.
نأخذ في الاعتبار أنه حتى مع تنقية من خطوتين، وسوف تكون هناك ايجابيات كاذبة والبروتينات التي يتم هدم الحاضر nonspecifically في مجمع تنقية TAP النهائي. طريقة واحدة لتحديد تلك التفاعلات غير محددة، فيالأقل جزئيا، هو لتشمل TAP التحكم باستخدام التحوير TAP فقط بالتوازي مع الموسومة TAP-التحوير في تجارب تنقية TAP. يجب إزالة البروتينات التي تم تحديدها في الإجراء-TAP فقط من القائمة التي تم تحديدها في تنقية TAP-التحوير.
وهناك TAP ناجحة تنقية خليط من البروتينات التي يحتمل أن تكون مرتبطة بروتين من الفائدة في الجسم الحي. فإن الخطوة التالية هي تحديد الجزيئية لهذه البروتينات، ويستخدم الطيف الكتلي عادة لهذا الغرض. اعتمادا على نتائج من SDS-PAGE واحتياجات التجربة، ويمكن تحديد الهويات الجزيئية في مجمع البروتين النقي في اثنين من الطرق التالية: 1) يمكن قطع كل فرقة البروتين الفردية للخروج من الجل وتعرض لأدنى مستوى LC-MS/MS التعقيد، أو 2) الكسر أزل التي تحتوي على محتوى البروتين الذروة (عادة شطف الثانية) يمكن أن يتعرض مباشرة الى متوسطة التعقيد LC-MS/MS. هذا ع النار بندقيةسوف نهج roteomic يحتمل تحديد جميع البروتينات في المجمع، اعتمادا على مجموعة ديناميكية من MS المعدات 22.
وباختصار، فإننا نقدم وسيلة لتحديد تفاعلات البروتين البروتين في الأنسجة العصبية من طراز كائن الوراثية - ذبابة الفاكهة. هناك عدد من المزايا من تطبيق طريقة لTAP الطاير: 1) ذباب الفاكهة لها دورة حياة قصيرة، ولذلك فمن سريعة وسهلة نسبيا لتوليد الذباب المعدلة وراثيا والحصول على الأنسجة في كمية كبيرة، وكلاهما تعتبر حيوية بالنسبة لTAP النهج؛ 2) ومشروحة الجينوم ذبابة كاملة ويحتوي على 70٪ من الجينات المسببة للأمراض البشرية، و3) الأهم من ذلك، فمن السهل للتحقق من صحة وظيفيا وتميز المرشح التفاعل البروتينات في الذباب. هناك موارد الشاملة المتاحة في المجتمع البحثي ذبابة لتوصيف جين معين، مثل القائم على جمع رني المعدلة وراثيا مفيدة لدراسة الأنسجة محددة الخسارة من وظيفة أغلبية الجيناتق، الأليلات الطافرة ونقص لمعظم مواضع الجينات، وكذلك استنساخ [كدنا] والجينات المحورة مفيدة لتحقيق مكاسب من وظيفة الدراسات. نحن نعتقد أن الطريقة ذبابة TAP سيكون إضافة قيمة إلى صندوق الأدوات المستخدمة في مختبرات الطاير. في منظور المستقبل، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع ذبابة النماذج السلوكية والنماذج الأمراض التي تصيب البشر، لفحص التغير في البروتين البروتين شبكة التفاعل استجابة لظروف ومؤثرات معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر EUROSARF لإرسال لنا الخميرة TAP البلازميدات التعبير. ونحن ممتنون أيضا للحصول على مساعدة من التحرير ريان Labadens. وأيد هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (R01NS070962) لCW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R.
