Summary
Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.
Abstract
Genetische screens uitgevoerd met behulp van Drosophila melanogaster (fruitvlieg) hebben talloze mijlpaal ontdekkingen gedaan in de opmars van de biologische wetenschappen. Echter, het gebruik van biochemische schermen gericht op uitbreiding van de kennis die uit de genetische analyse werd pas onlangs ontdekt. Hier een methode beschrijven we aan het eiwitcomplex te zuiveren dat associeert met een eiwit van interesse van volwassen vlieg hoofden. Deze methode maakt gebruik van het Drosophila GAL4/UAS systeem lokaas eiwit gefuseerd met een Tandem Affinity Purification (TAP) tag in vlieg neuronen in vivo expressie en vervolgens worden twee ronden van zuivering met gebruik van een TAP werkwijze gelijk aan die oorspronkelijk vastgesteld gist 1 om de interacties eiwitcomplex zuiveren. Aan het einde van deze procedure wordt een mengsel van verschillende eiwitcomplexen verkregen waarvan de moleculaire identiteit kan worden bepaald door massaspectrometrie. Validatie van de kandidaat-eiwitten zullen profiteren van de resource en het gemak van het uitvoeren van verlies-van-functie studies in vliegen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast op andere vliegen weefsels. Wij geloven dat de combinatie van genetische manipulaties en dit proteomics aanpak in de vlieg modelsysteem bezit een enorm potentieel voor de aanpak van fundamentele problemen op het gebied van de neurobiologie en daarbuiten.
Introduction
Het definiëren van de moleculaire pathways of netwerken die een bepaald biologisch proces bemiddelen is een van de uiteindelijke doelen van het biomedisch onderzoek. Vlieg genetici hebben zwaar afhankelijk van forward genetics, vooral modifier genetische screens (zowel enhancer en suppressor-schermen), factoren die samenwerken, parallel met, of stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen van belang te identificeren. Echter, forward genetics schermen vaak niet om essentiële genen te identificeren die, wanneer gemuteerd, veroorzaken dodelijkheid in vroege ontwikkelingsstadia, of genen met functionele redundantie en compensatie waarvan het verlies van de functie alleen leiden tot subtiele defecten die moeilijk om te scoren zijn. Een manier om deze moeilijkheid te overwinnen is het screenen op directe eiwit-eiwit interacties. Voor meer dan een decennium, een groeiende lijst van biochemische methoden, waaronder gist two-hybrid, faag display, chemische cross-linking, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), enz. zijn gebruikt om eiwitten te onderzoeken-Eiwit interacties. Elk van deze benaderingen heeft zijn eigen set van sterke en zwakke punten met betrekking tot de gevoeligheid en specificiteit. Onder hen, kan de TAP detectiemethode voor fysieke interactie onder nagenoeg fysiologische omstandigheden, behouden specificiteit en samenhang 2 en omvat de mogelijkheid om uit te breiden tot hoog-analyses 3,4.
TAP methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in gist door Rigautand collega 1. Bij deze werkwijze wordt een eiwit van interesse tot expressie met een TAP-tag. De TAP-label herbergt twee onafhankelijke affiniteit bindende domeinen: een eiwit Een domein dat bindt aan IgG en een-calmoduline bindend domein. De twee domeinen worden gescheiden door een TEV (Tobacco Etch Virus) splitsingsplaats. Een dergelijke combinatie zorgt voor twee onafhankelijke rondes van affiniteit zuiveringen voldoende niet-specifieke bindingen te verminderen en te verrijken specifieke bindingen 1. Voor dit geval, de TAP methode is een zeer krachtige methodiekd identificeren in vivo interactie van een bepaalde proteïne, hoewel overexpressie het exogene proteïne kan meer vatbaar voor koppelen met eiwitten die normaal niet complex met zijn endogene tegenhanger maken. Sinds de ontwikkeling, heeft de TAP methode is toegepast in vele andere systemen, waaronder cel-cultuur-gebaseerde systemen 5,6 en andere in vivo modellen voor de 6-9. Hier beschrijven we de aanpassing van de TAP methode in Drosophila. We hebben eerst genereren pUAST-NTAP en pUAST-CTAP vectoren klonering en fusie van de TAP-tag aan de N-of C-uiteinde van het gen van belang te vergemakkelijken. De UAS-TAP gelabeld transgen wordt vervolgens uitgedrukt in het zenuwstelsel onder controle van een neuronale GAL4 driver 10. Vervolgens zal een groot aantal volwassen vlieg koppen worden verzameld, die hoog gehalte aan neurale cellen en zijn gemakkelijk te scheiden van andere lichaamsdelen na bevriezing basis van grootte verschillen. De volwassen hoofden zijn gehomogeniseerd en opgeruimd by sequentiële centrifugeren, en het supernatant is onderworpen aan een hieronder beschreven TAP procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genereer UAS-TAP gelabeld Transgene Flies
- Genereer pUAST-TAP-gelabeld DNA-constructen.
- Bepaal welke zijde (N-of C-terminus) van het aas eiwit de TAP tag moet worden gefuseerd, op basis van de proteïne structuur / functie. Zie de bespreking voor meer details.
- Subkloneren van het cDNA coderende gebied van het gen van belang in de meervoudige kloneringsplaatsen (MCS) van de pUAST-NTAP of pUAST-CTAP vectoren N-of C-eindstandige-gemerkte UAS-transgenen TAP respectievelijk genereren. Zie Figuur 1 voor gedetailleerde kaarten en bruikbare restrictie sites en reading frames.
- Genereer UAS-TAP gelabeld transgene vliegen.
- Genereer transgene vliegen volgende standaardprotocollen met P-element bemiddelde inbrengen 11. Een aantal injectie services zijn commercieel verkrijgbaar.
- Steek neuronale GAL4 driver (dwz BG380-GAL4) om elke afzonderlijke transgene lijn en bepalen de eiwitexpressieniveausIedere regel door Western blot (met peroxidase Anti-peroxidase-antilichaam) en / of immunokleuring (met anti-TAP-antilichaam). In het algemeen wordt een transgene lijn met een niveau van eiwitexpressie die dicht bij het endogene eiwit aanbevolen voor TAP procedures. Zie de bespreking voor meer details.
- PerformGAL4/UAS-based rescue experimenten om de functionaliteit van de TAP-gelabeld transgenen bevestigen als verlies-van-functie mutanten van de genen van belang zijn beschikbaar. Kies een transgen dat nagenoeg mutantfenotypes voor volgende TAP experimenten redden.
2. Bereid Monsters voor TAP Procedure
- Genereer een vlieg voorraad die zowel een neuronale GAL4 driver (bijv. BG380-Gal4) en de gekozen-TAP gelabeld transgen om uitbreiding van vliegen monsters gemak draagt. Verzamel de F1 nakomelingen van de GAL4 bestuurder en de UAS-transgen kruis in zeldzame gevallen waarin de bovenstaande combinatie veroorzaakt overleving en groei nadeel. </ Li>
- Verzamel kleine schaal monsters en optimaliseren lysis voorwaarde voor het oplosbaar maken van de TAP-gelabeld eiwit.
- Wordt reeks lysis buffers een combinatie van niet-ionogene detergentia NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) en Triton X-100 (0,05-0,5%). Zie Tabel 1 en discussie voor meer gegevens.
- Op de top van een CO2-pad, gebruik # 5 tang te ontleden 20 volwassen hoofden van de TAP transgen uitdrukken vliegen en verzamelen ze in een 1,5 ml buis aan elkaar lysebuffer conditie te testen.
- Voeg 100 ul lysisbuffer testen aan de buis en homogeniseer de hoofden van strijken op en neer met een plastic stamper, voeg nog eens 100 ul buffer testen.
- Draai de kop lysaat bij 21.500 xg gedurende 10 min (4 ° C), en scheiden het supernatant en pellet na centrifugeren. Voeg 25 ul 2x SDS beladingsbuffer respectievelijk de pellet en 10 ul 4x SDS laadbuffer tot 30 ul van supernatant.
- Kook beide monsters gedurende 5 min en analyseren naast-Side met SDS-PAGE en daaropvolgende Western Blot met PAP antilichaam. Bepaal de oplosbaarheid van de verhouding van TAP-eiwitniveaus in supernatant vs de pellet.
- Bereid monster in grootschalige
- Openen en verzamel volwassen vliegen.
- Vouw de neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene voorraad in flessen en flip de flessen om de 3 dagen tot accumulerend 250 flessen worden gebruikt voor het verzamelen.
- Verzamel 1-3 dagen oude volwassen vliegt in 50 ml conische buizen, zet de tube in vloeibare stikstof onmiddellijk diepvries de vliegen. Bewaar het vliegen in een -80 ° C vriezer. Merk op dat het volume van de vliegen niet hoger zijn dan 2/3 van de 50 ml buis.
- Verzamel fly hoofden (het uitvoeren van deze stap op de top van gepoederde droogijs).
- Haal de voorgekoeld zeven en de vijzel en stamper van de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs, idealiter in een grote ijsemmer. Stapel twee VS standaard test zeven met een nr. 25 op the top en nr. 40 onderaan.
- Neem de bevroren vliegt uit en drop ze in vloeibare stikstof en houden de vliegen daar voor ongeveer 10 minuten. Vortex of schud de buizen krachtig om de koppen, poten en vleugels breken met de lichamen.
- Giet het mengsel op de bovenste zeef en schud de zeven krachtig terwijl elk van de zeven bij elkaar. Na zeven, zullen de lichamen blijven op de bovenste zeef, vliegen hoofden zal op de onderste zeef worden behouden, en poten, vleugels en ander vuil zal om het droogijs vallen. Scheid de twee zeven en zorgvuldig over te dragen de vlieg hoofden aan de koude mortel.
- Meng de vlieg hoofden
- Op de top van droog ijs, slijp de hoofden met de mortier en de stamper om poederachtige deeltjes, breng de poeder om een 15 ml glazen Dounce Tissue Grinder dat was voorgekoeld op ijs.
- Meet de gewichten van de molen voor en na de kop monster erin werd gegoten, en bereken dan hoeveel het hoofd sample weegt. Een totaal van 6-15 gram vlieg koppen volstaat voor elke TAP experiment dienovereenkomstig aanpassend aan de expressieniveaus van het eiwit. Voeg 15 ml ijskoude homogenisatiebuffer (lysisbuffer geoptimaliseerd in stap 2.2) om het poeder en wrijf vervolgens met de grote ruimte stamper totdat het is gemakkelijk voor de stamper te gaan op en neer. Houd het glas molen op het ijs te allen tijde.
- Bereid de supernatant voor TAP
- Breng de homogenaat een snelle centrifugebuis en centrifugeren gedurende 20 min bij 50.000 xg ~ (4 ° C). Breng de bovenstaande om een nieuwe high-speed centrifuge buis en herhaal het centrifugeren nog een keer.
- Breng de bovenstaande om een ultracentrifuge buis en het uitvoeren van een 40 min ~ 250.000 xg spin om het supernatant verder te wissen. De supernatant is klaar voor de tandem affiniteitszuivering procedures na ultracentrifugatie.
- Openen en verzamel volwassen vliegen.
3. TAP Zuivering De volgende secties werden afgeleid van de Seraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- Voer IgG kraal affiniteitzuivering
- Bereid IgG sepharose kralen terwijl de monsters worden gecentrifugeerd. Was 400 ul IgG kraal 3x in een 15 ml Falcon buis met 10 ml koud IgG wassen buffer. Voor elke wasbeurt, rock de buis zachtjes gedurende 2 minuten, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, verwijdert de buffer en slechts de korrels in de buis.
- Breng zorgvuldig de heldere supernatant (~ 15 ml) in de 15 ml buis met de IgG kralen. Incubeer de kralen en hersenen lysaat mix bij 4 º C op een nutator gedurende 2 uur.
- Opzetten van een schone en lege micro kolom met ongeveer 15 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de IgG kraal mengsel door gestaag te gieten het mengsel in de kolom, probeer niet te vangen elkeluchtbellen in de kolom. Laat de kralen om zich te vestigen in de kolom en de buffer langzaam leeglopen door zwaartekracht.
- Was de kolom grondig met 10 ml koud IgG wasbuffer na alle van de hersenen lysaat heeft stroomde door de vaste IgG kolom. Herhaal het wassen 2x. Opmerking: laat nooit de kraal aan de lucht in.
- Voer TEV decollete
- Na de derde wassen, spoel de kolom weer met 10 ml TEV decollete buffer. Deze stap bereidt de IgG kraal die het aas complex voor TEV decollete sequestrates.
- Vlak voordat de laatste druppel TEV buffer over te druppelen uit, zet een cap op de bodem van de kolom om de stroom te blokkeren, voeg 1,3 ml TEV buffer die 130 eenheden TEV enzym aan de kolom en vervolgens veilig dop boven de kolom. Controleer de kolom goed afgedicht aan beide uiteinden.
- Draai de kolom bij 18 º C gedurende 2 uur om de TEV enzym aan het peptide te splitsen op de TEV-site en laat het eiwitcomplex while achterlating van het proteïne A-domein peptide gebonden aan de IgG sepharose korrels.
- Voer Calmoduline kraal affiniteitzuivering
- Bereid de Calmodulin korrels terwijl de IgG korrels geïncubeerd met TEV enzym. Was 200 ul Calmodulin parels in een 15 ml Falcon buis 3x met telkens 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Voor elke wasbeurt, schud de buis gedurende 2 minuten op een nutator, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, neem alles uit de buffer en laat alleen de kralen in de buis.
- Aan het einde van de TEV incubatie (stap 3.2.3), de terugkeer van de kolom IgG terug naar de koude kamer en zet deze recht omhoog. Laat de kralen na gedurende 10 minuten.
- Verwijder de dop en dan de onderste dop en verzamelen de 1,3 ml TEV decollete product in een 15 ml Falcon buis. Laat de buffer uitlekken volledig. Voeg een extra 200 ul TEV buffer om de kolom naar het dode volume van de kolom duwen, het verzamelen van de flow-out in dezelfde buis.
- Voeg 4,5 ml van Calmodulin binding buffer en 4,5 ul 1 M CaCl2 aan de 1,5 ml TEV splitsingsproduct boven verzameld. De CaCl2 dient om de EDTA titreren van de TEV buffer. Breng de 6 ml mengsel aan de buis met de Calmodulin kralen en draai de buis bij 4 ° C op een nutator 1 uur.
- Opgezet andere schone en lege micro kolom met ongeveer 10 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de Calmoduline kraal mengsel aan de kolom en laat het uitlekken door de zwaartekracht.
- Wanneer alle oplossing stroomde door vaste Calmodulin kolom, spoel de kolom tweemaal met elk 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Opmerking: vermijd het verstoren van de Calmoduline kralen en proberen om het oppervlak van de bolletjes zo plat mogelijk tijdens het wassen te houden.
- Elueer het aas complex van Calmoduline kolom.
Direct na het wassen, elueren de kolom Calmoduline met vijf fracties van 200 pi koude Calmodulin elutiebuffer. Voor elke fractie zachtjes voeg 200 ul elutiebuffer aan de kolom en verzamel het eluaat gemarkeerd met een 1,5 ml Eppendorf buis. Herhaal dit 4x. - Analyseer het eiwitcomplex door SDS-PAGE
- Neem een kleine hoeveelheid van elk van de vijf fracties (ongeveer 30 ui) en voeg SDS laadbuffer. Kook de monsters gedurende 5 minuten en plaats de monsters side-by-side met eiwitten moleculaire merkers in een gradiënt (4-15%) SDS-PAGE gel.
- Nadat de monsters volledig zijn opgelost in de gel, stop de elektroforese en vlekken op de gel met geen G-250-gebaseerde gevoelige colloïdale Coomassie kleuringen zoals 'blue zilver' kleuring 13. Zilverkleuring is optioneel, maar niet de voorkeur omdat het niet volledig compatibel met de volgende massaspectrometrie. Bewaar de rest van het eluaat in een -80 ° C vriezer voor verdere analyse zoals massaspectrometrie voor het blootleggen van de moleculaire identiteit van het gezuiverde eiwit complex. See discussie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier laten we onze inspanningen in het identificeren Highwire-interagerende eiwitten in de vlieg hersenen. Highwire (Hiw) en de gewervelde en ongewervelde homologen zijn enorm ubiquitine ligasen die de ontwikkeling en reparatie van het zenuwstelsel 14 reguleren. Ze delen een aantal zeer geconserveerde functionele domeinen. Echter, hun moleculaire acties niet geheel duidelijk. Werk in worm, vliegen en muizen leidde tot de huidige werkmodel dat Hiw functioneert als een E3 ligase en als een steiger eiwit om de vorming van een multi-subunit ubiquitination complex, dat tijd-en celtype-specifieke neuronale functies regelt via vergemakkelijken de combinatie van interactie met verschillende co-factoren en gericht is op verschillende ubiquitine substraten. Om de HIW-geassocieerde ubiquitination complex identificeren, hebben we eerst genereerde een N-terminaal gelabeld UAS-TAP-Hiw transgen dat is volledig functioneel bij het redden van het HIW mutantfenotype 15. Ongeveer 10 g van de volwassen fly koppen die alleen TAP of TAP-Hiw transgene eiwitten tot expressie werden verzameld en onderworpen aan TAP procedures naast elkaar zoals hierboven beschreven. Definitieve eluaten uit beide zuiveringen werden geanalyseerd door SDS-PAGE en zilverkleuring. Massaspectrometrie identificeerde een lijst van eiwitten alleen in de TAP-Hiw steekproef, inclusief Drosophila FSN (DFSN, een F-box-eiwit) en Rae1 (figuur 2). Latere genetische en biochemische analyses bleek dat Hiw en DFSN werken samen als SCF-achtige E3 ubiquitine ligase complex om synaptische structuur en functie 16 reguleren, en Rae1 associeert met Hiw in vivo en weerhoudt synaptische overgroei 17. Deze functie Rae1 ten minste gedeeltelijk bereikt door het vermogen om Hiw eiwit stabiliteit via bescherming Hiw de autophagic afbraak, die een nieuw mechanisme dat selectief regelt Hiw eiwitgehalte in synaptische ontwikkeling 17 onthult.
Figuur 1. Vectoren voor het genereren van TAP-getagde transgene vliegen. (A) De kaart van de pUAST-NTAP construeren. (B) De kaart van de pUAST-CTAP construeren. De meervoudige kloneringsplaatsen (MCS) in beide constructen zijn gemarkeerd met een drager, waarbij enkel gesneden restrictieplaatsen worden met rode kleur. (C) primaire sequentie waarin de meervoudige kloneringsplaatsen van de TAP vectoren met de reading frame van de TAP-tag. Om subklonering te vergemakkelijken, zijn er twee meer NTAP constructen gegenereerd uit de oorspronkelijke pUAST-NTAP: pUAST-NTAP 1 en pUAST-NTAP +2. Samen de drie NTAP constructen omvat alle drie mogelijke leesramen om het gebruik van de MCS tegemoet. Alle vectoren die zijn geconstrueerd met behulp van de NTAP of CTAP fragmenten oorspronkelijk gegenereerdSeraphin Lab 1. Klik hier voor grotere afbeelding.
. Figuur 2 Zuivering van Highwire-interagerende eiwitten uit fly hersenen door TAP zuivering Adult hoofden tegen vliegen uiten TAP. (BG380-GAL4, UAS-TAP) of TAP-Hiw (BG380-GAL4, UAS-TAP-Hiw) in het zenuwstelsel worden verzameld, gehomogeniseerd en onderworpen aan TAP zuivering, respectievelijk. De uiteindelijke eluaten werden geanalyseerd met eendimensionale SDS-PAGE gel gevolgd door zilverkleuring. De pijlpunt geeft het aas eiwit Hiw en de asterisk geeft een afgeknotte TAP eiwit als gevolg van splitsing TeV. In het TAP-Hiw monster, een lijst van de eiwitten worden geïdentificeerd door massaspectrometrie, waaronder HSC-70, β-tubuline, Rae1 en DFSN (aangegeven door pijlen). Dit cijfer wordt gewijzigd van figuur 1a van Tian et al.. 17 Klik hier voor grotere afbeelding.
| Buffer | Samenstelling | Reacties |
| Lysisbuffer | 50 mM Tris-HCl pH 7,5 | LET OP: 1) Voeg DTT en de protease en proteasoomremmers vlak voor gebruik. |
| 125 mM NaCl | 2) Hier te zien is een lysis buffer met 0,5% NP40. Zie Overleg voor aanpassingen op niet-ionische detergenten. | |
| 5% glycerol | ||
| 0,5% NP40 | ||
| 1,5 mM MgCl2 | ||
| 25 mM NaF | ||
| 0,2 mM DTT | ||
| (Het volgen protease en proteasoom remmers) | ||
| 1 mM Na 3 VO 4 | ||
| 0,05 mM MG-115 | ||
| 1 mM PMSF | ||
| Proteaseremmer mix (Sigma P8340) | ||
| Proteaseremmercocktail (Roche 04693159001) | ||
| IgG wasbuffer | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml 2 M voorraad) | |
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M voorraad) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml van 10% voorraad) | <td>||
| H 2 0 tot 100 ml uiteindelijke | ||
| TEV decollete buffer | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml 2 M voorraad) | OPMERKING: DTT toevoegen vlak voor gebruik. |
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M voorraad) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml van 10% voorraad) | ||
| 0,5 mM EDTA (100 pl 0,5 M voorraad) | ||
| 1 mM DTT (100 ui 1 M voorraad) | ||
| H 2 O tot 100 ml finale | ||
| Calmodulin binding buffer | 10 mM β-mercapto-ethanol (69,7 ul van voorraad) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml 2 M voorraad) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M voorraad) | ||
| 1 mM Mg-acetaat (100 ul 1 M voorraad) | ||
| 1 mM imidazool (100 ul 1 M voorraad) | ||
| 2 mM CaCl2 (200 ui 1 M voorraad) | ||
| 0,1% NP40 (1 ml van 10% voorraad) | ||
| H 2 O tot 100 ml finale | ||
| Calmodulin elutiebuffer | 10 mM β-mercapto-ethanol (69,7 ul van voorraad) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml 2 M voorraad) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M voorraad) | ||
| 1 mM Mg-acetaat (100 ul 1 M voorraad) | ||
| 1 mM imidazool (100 ul 1 M voorraad) | ||
| 10 mM EGTA (2 ml 0,5 M voorraad) | 0,1% NP40 (1 ml van 10% voorraad) | |
| H 2 O tot 100 ml finale |
Tabel 1. Samenstelling buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) heeft een dubbele zuiveringsprotocol dat de isolatie en verrijking van eiwitcomplexen via twee onafhankelijke affiniteit zuiveringsstappen maakt. Het ontwerp van de TAP-tag is niet beperkt tot wat in dit protocol, andere proteïne bindende domeinen en motieven zijn ook van toepassing als bufferomstandigheden dienovereenkomstig aangepast. Een goed voorbeeld van andere TAP tags is het GS-TAP tag, een combinatie van een G-eiwit en een streptavidine-bindende motief, gemaakt door groep Giulio Superti-Furga's ter zuiveren eiwit complex in gekweekte zoogdiercellijnen 18. De GS-TAP werd later aangepast om eiwit-eiwit interacties te bestuderen in Drosophila S2 cellen en embryo's 19. Een recente Jupiter publicatie van Bailey et al.. Aangetoond hoe de GS-TAP procedure werd uitgevoerd met mobiele kweeklysaat 20. Hier presenteerden we het gebruik van TAP-tag in Drosophila zenuwweefsel (adult hoofden) voor grootschalige proteomics screening. Dit protocol kan eventueel worden aangepast aan andere weefsels die grootschalige monstername mogelijk, zoals embryo. De volwassen organen verzameld op de bovenste zeef (stap 2.3.2.3) kunnen ook worden gebruikt voor TAP, die een zeer uitdagende taak zijn. De lysis buffer moet worden gemodificeerd en geconditioneerd om de enorme proteasen in het spijsverteringskanaal bij de eerste en de zuiveringsprocedure aanzienlijk worden verkort om de belichtingstijd van de proteïnen verminderen de proteasen te remmen. Hoewel de verschillende TAP-tags vereisen verschillende handelingen en buffer voorwaarden voor affiniteit zuiveringen, de algemene beginselen voor TAP zijn hetzelfde. Hieronder bespreken we zaken die de kwaliteit van TAP resultaten zullen beïnvloeden.
Het succes van de TAP benadering afhankelijk genereren rechts transgen. Ten eerste moet de TAP tag zelf de totale conformatie van het aas eiwit, dat cruciaal is voor zijn vermogen behouden niet veranderente interageren met fysiologische bindingspartners. Het is dus van cruciaal belang om te beslissen waar de TAP tag fuseren om het gen van belang. De beslissing kan worden genomen op basis van eerdere studies van het eiwit, met name informatie over de structuur of functionele-epitode gelabeld transgenen. Mocht dergelijke informatie niet beschikbaar is, tagging het aas eiwit in N-of C-terminale parallel aanbevolen. Dan functionele rescue experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen welk transgen worden gebruikt. Ten tweede moet de expressieniveaus van het transgene eiwit dicht bij die van het endogene eiwit. Dit is vooral belangrijk als de Gal4/UAS systeem normaal drijven de expressie van het transgen op verschillende tijdstip en op een veel hoger niveau in vergelijking met de endogene eiwitten die ofwel verhogen valse positieven of er onverwachte gevolgen die het profiel van de interactie eiwit wijzigen netwerken in de cellen. Zo kan overexpressie steigers eiwitten cause dominant negatieve effecten en overexpressie eiwitten die enzymatische activiteiten, zoals kinasen bezitten vaak oorzaak gain-of-function effecten die kunnen beïnvloeden ook de mogelijkheid van hun endogene bindingspartners om met hen. Aldus zullen GAL4/UAS systeem worden vermeden bij het tijdstip en het niveau van de expressie van het gen van belang is essentieel voor het behoud van de endogene interacties die alleen aanwezig in normale omstandigheden. In plaats daarvan moet de expressie van het transgen TAP gelabeld worden bestuurd onder zijn eigen promoter. Dit kan worden bereikt door vervanging van de UAS sequentie met het endogene promoter sequentie, of door fusie van de TAP sequentie in frame met de exonal sequentie in een genomisch DNA-fragment dat de gehele loci van het gen van belang 21 bevat. In sommige gevallen kan de TAP experiment functieverlies-mutant achtergrond van het gen van interesse worden uitgevoerd om concurrentie van het endogene eiwit inc verminderenorporating in multiprotein complexen. Voor dit geval, een eiwit null achtergrond, indien beschikbaar, de ideale voorwaarde om de endogene eiwit volledig te elimineren. Met behulp van de genetische mutant achtergrond zal altijd de kans vergroten om resultaten te produceren met een hogere kwaliteit.
Oplosbaarheid van het aas eiwit is een andere cruciale factor voor succes. Ionogene detergenten worden normaliter in de lysisbuffer naar de plasmamembraan te lossen en behoudt het eiwitcomplex, oplosbaar en intact, in een status die dicht bij de fysiologische omgeving. Echter afhankelijk van de vraag of de eiwitten van belang-membraan geïntegreerde of-geassocieerde eiwitten, kunnen de samenstelling en concentratie van ionische detergentia cruciaal het aas eiwit oplosbaar. 0.1-0.3% NP40 vaak toereikend cytosolische eiwitten oplosbaar te maken. Voor membraaneiwitten, wordt een combinatie van NP40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%), en Triton X-100 (0,05-0,5%) soms nodig om oplosbaarheidLize en voldoende eiwitten te verrijken voor de TAP experiment. Aangezien een streng lysisbuffer vaak zwakker eiwit-eiwit interacties verstoren, moet een balans worden bereikt die voldoende oplosbare lokaas eiwitten aanwezig in het monster, terwijl tegelijkertijd de meeste eiwit-eiwit interacties worden bewaard. Een algemeen principe is dat altijd proberen om de minste soorten wasmiddelen te gebruiken met de laagste concentratie.
Om het oplossen van problemen te vergemakkelijken, is het sterk aanbevolen om een kleine hoeveelheid van het monster te redden van elke stap van de twee zuiveringen. Na SDS-PAGE en eiwitkleuring / Western analyse van de monsters kan de niveaus van het aas eiwit en de sequentiële verrijking van bepaalde soorten eiwit te controleren. Als bijvoorbeeld een plotselinge verlaging van de aas eiwit werd gedetecteerd in hoeveelheid van de stroomsnelheid na TEV splitsing (stap 3.3.3), is het waarschijnlijk dat het aas eiwit werden verloren tijdens de IgG kraal wassen (stap 3.1.4) . Een possbaar oorzaak zou de ontoereikende detergent samenstelling van de IgG wasbuffer zijn. Er is een sterke daling van de samenstelling en concentratie van de detergentia IgG wasbuffer (0,1% NP-40) met tegenover de lysisbuffer. De aas eiwit kan gevoelig voor deze veranderingen en distantiëren van de IgG groep aan de kralen. Instellen van de IgG wassen richting lysisbuffer kan helpen het probleem op te lossen. Als alternatief, hoewel minder waarschijnlijk, de TEV decollete (stap 3.2) misschien niet voldoende gewerkt om het aas bevattende complex los te maken van de IgG kralen. De stappen van een tweede inspectie waard zijn de gelijkschakeling van de IgG kralen met de TEV buffer (stap 3.2.1) en de enzymactiviteit, kan verkeerd gebruik van het enzym zou verlammen.
Houd er rekening mee dat zelfs met de twee-staps zuiveringsproces, er nog steeds zal zijn valse positieven en eiwitten die worden afgebroken-specifiek aanwezig in de finale-TAP gezuiverd complex. Een manier om de niet-specifieke interacties te identificeren, bijalthans gedeeltelijk, is een controle met de TAP TAP enige transgen parallel met TAP gelabeld-transgen in het TAP zuivering experimenten omvatten. Eiwitten die in het alleen-TAP procedure worden verwijderd uit de lijst die in TAP-transgen zuivering.
Een succesvolle TAP mengsels van proteïnen die mogelijk zijn geassocieerd met het eiwit van interesse in vivo zuiveren. De volgende stap is de moleculaire identificatie van deze eiwitten en massaspectrometrie wordt vaak gebruikt voor dit doel. Afhankelijk van de resultaten van SDS-PAGE en de behoeften van het experiment, kan de moleculaire identiteit van het gezuiverde eiwit complex worden bepaald de volgende twee manieren: 1) elke afzonderlijke eiwitband kunnen worden uitgesneden uit de gel en onderworpen aan een lage- complexiteit LC-MS/MS, of 2) het elueren fractie dat de piek eiwitgehalte (normaal gesproken de tweede elutie) bevat, kan direct worden onderworpen aan een matige complexiteit LC-MS/MS. Zo'n schot-gun proteomic aanpak mogelijk alle eiwitten in het complex te identificeren, afhankelijk van het dynamische bereik van de MS apparatuur 22.
Samengevat presenteren we een methode om eiwit-eiwit interacties in neurale weefsels van een genetisch modelorganisme identificeren - de fruitvlieg. Er zijn een aantal voordelen van toepassing TAP methode om de vliegen: 1) fruitvliegen hebben een korte levenscyclus, zodat het relatief snel en eenvoudig transgene vliegen genereren en weefsels in grote hoeveelheid te verkrijgen, beide zijn cruciaal voor de TAP benadering, 2) de vlieg genoom volledig geannoteerd en bevat 70% van humane ziekte veroorzakende genen, en 3) het belangrijkste, is het gemakkelijk om functioneel valideren karakteriseren kandidaat interagerende eiwitten in vliegen. Er zijn uitgebreide middelen die beschikbaar zijn in de vlieg onderzoeksgemeenschap voor de karakterisering van een bepaald gen, zoals transgene gebaseerde RNAi collectie nuttig om te bestuderen weefsel-specifieke verlies-van-functie van een meerderheid van het gens, en mutante allelen deficiëntie voor de meeste genloci alsook cDNA klonen en transgenen nuttig gain-of-function studies. Wij geloven dat de vlieg TAP methode een waardevolle aanvulling op de gereedschapskist van oa vliegen labs zullen zijn. In toekomstperspectief kan deze werkwijze worden gecombineerd met vlieg gedragsparadigma's en menselijke ziektemodellen om de verandering in eiwit-eiwit interactie netwerk in antwoord op specifieke omstandigheden en prikkels screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken EUROSARF voor het sturen van gist TAP expressie plasmiden. We zijn ook dankbaar voor redactionele hulp van Ryan Labadens. Dit werk werd ondersteund door een NIH / NINDS subsidie (R01NS070962) naar CW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R.
