में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान<em> ड्रोसोफिला</emअग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि द्वारा> वयस्क प्रमुखों (नल)
Summary
ड्रोसोफिला लेकिन नहीं में गहराई से जैव रासायनिक विश्लेषण की इसकी उपयुक्तता के लिए, अपने शक्तिशाली आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रसिद्ध है. यहाँ हम मक्खी दिमाग से ब्याज की किसी भी प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों की पहचान करने के लिए एक नल आधारित प्रक्रिया मौजूद है. यह प्रक्रिया संभावित अनुसंधान के नए रास्ते के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फल मक्खी) का उपयोग किया जेनेटिक स्क्रीन जैविक विज्ञान के अग्रिम में कई मील का पत्थर खोजों बना दिया है. हालांकि, आनुवांशिक विश्लेषण से प्राप्त ज्ञान का विस्तार करने के उद्देश्य से जैव रासायनिक स्क्रीन का उपयोग केवल हाल ही में पता लगाया था. यहाँ हम प्रोटीन जटिल शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन है कि वयस्क मक्खी सिर से ब्याज की किसी भी प्रोटीन के साथ एसोसिएट्स. इस विधि vivo में मक्खी न्यूरॉन्स में मिलकर एक आत्मीयता शुद्धि (नल) टैग के साथ जुड़े हुए चारा प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला Gal4/UAS प्रणाली का लाभ लेता है, और फिर मूल रूप में स्थापित करने के लिए एक समान एक नल प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्धि के दो दौर लागू करता है बातचीत के दौरान प्रोटीन जटिल शुद्ध करने के लिए खमीर 1. इस प्रक्रिया के अंत में, कई प्रोटीन परिसरों का एक मिश्रण जिसका आणविक पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता प्राप्त की है. उम्मीदवार प्रोटीन की मान्यता आर से लाभ होगाesource और मक्खियों में नुकसान के समारोह पढ़ाई प्रदर्शन करने में आसानी. समान दृष्टिकोण अन्य मक्खी ऊतकों को लागू किया जा सकता है. हम उड़ मॉडल प्रणाली में आनुवंशिक जोड़तोड़ और इस प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के संयोजन तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में और परे मूलभूत समस्याओं से निपटने के लिए जबरदस्त क्षमता रखती है कि विश्वास करते हैं.
Introduction
एक विशेष जैविक प्रक्रिया मध्यस्थता आणविक मार्ग है कि या नेटवर्क को परिभाषित करने के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान का अंतिम लक्ष्य होता है. फ्लाई जेनेटिकविदों विशेष रूप से साथ समानांतर में, एक साथ काम करते हैं, या नदी के ऊपर या ब्याज की एक जीन के बहाव के कारकों की पहचान करने के लिए, आनुवंशिक स्क्रीन (बढ़ाने और शमन स्क्रीन दोनों) संशोधक, आगे आनुवंशिकी पर भारी निर्भर है. हालांकि, आगे आनुवंशिकी स्क्रीन अक्सर बार जब उत्परिवर्तित, जिसका नुकसान समारोह के ही स्कोर करने के लिए मेहनत कर रहे हैं कि सूक्ष्म दोष उत्पन्न कार्यात्मक अतिरेक और मुआवजे के साथ प्रारंभिक विकास चरणों में मारक, या जीन के कारण है, जो आवश्यक जीन की पहचान करने में विफल. इस कठिनाई को दूर करने के लिए एक तरह से प्रत्यक्ष प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए स्क्रीन है. एक दशक से अधिक के लिए, आदि खमीर दो संकर, फेज प्रदर्शन, रासायनिक पार से जोड़ने, सह आईपी मिलकर संबंध शुद्धीकरण (नल), सहित जैव रासायनिक विधियों, की बढ़ती सूची. प्रोटीन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रोटीन बातचीत. इन तरीकों में से प्रत्येक शक्तियों और संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए संबंध में कमजोरियों का अपना स्थापित किया है. उनमें से, नल विधि, लगभग शारीरिक शर्तों के तहत शारीरिक संपर्क का पता लगाने के लिए अनुमति देता है विशिष्टता और स्थिरता 2 को बरकरार रखता है और 3,4 विश्लेषण करती उच्च throughput के लिए विस्तार करने की क्षमता भी शामिल है.
नल विधि मूल रूप से Rigautand सहयोगियों 1 द्वारा खमीर में विकसित किया गया था. इस विधि में, ब्याज की एक प्रोटीन एक नल टैग के साथ व्यक्त किया है. एक प्रोटीन आईजीजी को बांधता है कि एक डोमेन और एक calmodulin बाध्यकारी डोमेन: नल टैग दो स्वतंत्र आत्मीयता बाध्यकारी डोमेन बंदरगाहों. दो डोमेन एक TEV (तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस) दरार साइट से अलग होती है. आत्मीयता purifications के दो स्वतंत्र राउंड पर्याप्त अविशिष्ट बंधनों को कम करने और विशिष्ट बाइंडिंग 1 को समृद्ध करने के लिए इस तरह के एक संयोजन की अनुमति देता है. इस उदाहरण के लिए, नल विधि एक बहुत शक्तिशाली metho हैएक्सोजेनस प्रोटीन overexpressing सामान्य रूप से अपने अंतर्जात समकक्ष के साथ जटिल नहीं है कि प्रोटीन के साथ संबद्ध करने के लिए इसे और अधिक खतरा बना सकता है, किसी दिए गए प्रोटीन की विवो बातचीत में पहचान करने के लिए डी. इसके विकास के बाद से, नल विधि सेल संस्कृति आधारित प्रणालियों 5,6 और अन्य में vivo मॉडल प्रणाली 6-9 सहित कई अन्य प्रणालियों, में लागू किया गया है. यहाँ हम ड्रोसोफिला में नल विधि का अनुकूलन का वर्णन. हम पहले ब्याज की जीन के एन या सी टर्मिनल या तो नल टैग की क्लोनिंग और फ्यूजन की सुविधा के लिए pUAST-NTAP और pUAST-CTAP वैक्टर उत्पन्न करते हैं. यूएएस नल टैग transgene तो एक neuronal GAL4 ड्राइवर 10 के नियंत्रण में तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किया है. अगला, वयस्क मक्खी प्रमुखों की एक बड़ी संख्या में तंत्रिका कोशिकाओं के उच्च सामग्री है और आकार अंतर के आधार पर ठंड के बाद शरीर के अन्य भागों से अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं, जो एकत्र किया जाएगा. वयस्क सिर homogenized और मंजूरी दे दी हैं खY अनुक्रमिक centrifugations, और सतह पर तैरनेवाला नीचे वर्णित एक नल प्रक्रिया के अधीन है.
Protocol
Representative Results
Discussion
अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि दो स्वतंत्र संबंध शुद्धीकरण कदम के माध्यम से अलगाव और प्रोटीन परिसरों के संवर्धन की अनुमति देता है कि एक दोहरी शुद्धि प्रोटोकॉल प्रदान करता है. नल टैग की डिजाइन इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें खमीर नल अभिव्यक्ति plasmids भेजने के लिए EUROSARF धन्यवाद. हम भी रयान Labadens से संपादकीय मदद के लिए आभारी हैं. इस काम CW पर एक एनआईएच / NINDS अनुदान (R01NS070962) द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
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