Summary
Hypoksisk lungevaokonstriksjon (HPV) er et viktig fysiologisk fenomen der ved alveolar hypoksi lungeperfusjon er tilpasset ventilasjon. Det viktigste vaskulære segmentet som bidrar til HPV er den intra-acinare arterien. Her beskriver vi vår protokoll for analyse av HPV av murin lungefartøy med diameter på 20-100 μm.
Abstract
Akutt alveolarhypoksi forårsaker lungevaokonstriksjon (HPV) - også kjent som von Euler-Liljestrand-mekanismen - som tjener til å matche lungeperfusjon med ventilasjon. Frem til nå er de underliggende mekanismene ikke fullt ut forstått. Det viktigste vaskulære segmentet som bidrar til HPV er den intra-acinare arterien. Denne karseksjonen er ansvarlig for blodtilførselen av en individuell acinus, som er definert som den delen av lungen som er distal til en terminal bronkiol. Intra-acinar arterier er for det meste plassert i den delen av lungen som ikke kan nås selektivt av en rekke ofte brukte teknikker som måling av lungearterietrykket i isolerte perfused lunger eller kraftopptak fra dissekerte proksimale lungearteriesegmenter1,2. Analysen av subpleurale kar ved sanntids konfomisk laserskanning luminescensmikroskopi er begrenset til kar med opptil 50 μm i diameter3.
Vi tilbyr en teknikk for å studere HPV av murin intrapulmonale arterier i området 20-100 μm indre diametre. Den er basert på videomorfometrisk analyse av tverrsnittsarterier i presisjonskuttede lungeskiver (PCLS). Denne metoden tillater kvantitativ måling av vasoreaktivitet av små intra-acinar arterier med indre diameter mellom 20-40 μm som ligger ved kiler av alveolar septa ved siden av alveolar kanaler og av større pre-acinar arterier med indre diametre mellom 40-100 μm som går ved siden av bronki og bronkioler. I motsetning til sanntidsavbildning av subpleurale kar i bedøvede og ventilerte mus, oppstår videomorfometrisk analyse av PCLS under forhold uten skjærspenning. I vår eksperimentelle modell viser begge arterielle segmenter en monofasisk HPV når de utsettes for middels gasset med 1% O2 og responsen falmer etter 30-40 min ved hypoksi.
Introduction
I de fleste systemiske vaskulære senger hypoksi induserer vaskodilatasjon, i forhold til vasokonstriksjon forårsaket av hypoksi i lungevaskulaturen. Denne lungespesifikke responsen på senket oksygenspenning kalles hypoksisk lungevaokonstriksjon (HPV), utbrudd i løpet av sekunder og reverserer raskt etter tilbakekobling til normoksisk ventilasjon. Selv om HPV er kjent i mer enn 60 år, er de cellulære oksygensensorene og signalkaskaden(e) som resulterer i vasokonstriksjon fortsatt under debatt. Det er en relativ bred enighet om at hypoksi-fremkalte redoks- og ROS-endringer er avgjørende for HPV og utvikling av lungehypertensjon (gjennomgått i Sylvester et al. 4 og Schumacker et al. 5). Våre egne data støtter en sentral rolle i komplekse II av mitokondrie respiratorisk kjede i HPV6,7. Nylig, Wang et al. presenterte et helt nytt konsept for oksygenmåling og HPV: Basert på deres data foreslår de at alveolar hypoksi er følt av de tilstøtende kapillærene som forårsaker membrandepolarisering av endotelcellene. Responsen forplantes via connexion 40 gapkryss av endotelcellene som fører til innsnevring av glatte muskelceller av oppstrøms arterioler8.
Lungenes arterier løper langs luftveiene, forgrener seg med dem, reduserer kontinuerlig i diameter, og til slutt leverer blod til kapillærsystemet som ligger i alveolarveggene. Denne arterielle sirkulasjonen består av anatomisk og funksjonelt distinkte segmenter. De proksimale kanalarteriene, preget av en overflod av elastiske fibre i veggene, etterfølges av fullt muskulære intrapulmonale arterier som i stor grad kontrollerer lungevaskulær motstand. Trinn for trinn går disse arteriene inn i segmenter der muskellaget blir ufullstendig, og til slutt er karene fri for glatte muskel actin-immunoreaktive celler. Den intra-acinare arterien som fôrer en individuell lungeacinus med blod representerer et delvis muskuløst segment6. På samme måte representerer lungearterialsystemet ikke en ensartet struktur angående hypoksisk respons, men viser markert regionalt mangfold9,10. For eksempel, i proksimale lungearterier isolert fra rotte lunger hypoksi induserer en bifasisk respons, viser en innledende rask sammentrekning av kort varighet som - etter ufullstendig avslapning - etterfølges av en annen langsom, men vedvarende sammentrekning11. I resistensarterier isolert fra rotte lungeparenchyma som fjerde- og femte divisjon av lungearterier (ekstern diameter <300 μm), forårsaker hypoksi monofasisk innsnevring9. Allerede i 1971 konkluderte Glazier og Murray med målinger av endringer i kapillær rød blodlegemekonsentrasjon i lunger av hunder ventilert med hypoksiske gassblandinger at den hypoksiinduserte økningen i vaskulær motstand hovedsakelig skjedde oppstrøms for kapillærene12. I dag representerer intravital mikroskopi av intakte lunger av bedøvede og mekanisk ventilerte mus et kraftig verktøy for analyse av lungemikrovaskulaturen13,14. Eksisjon av et sirkulært vindu i thoracic veggen gir mikroskopisk tilgang til overflaten av lungen og tillater analyse av subpleurale lungekar med opptil 50 μm i diameter. Ved å kombinere denne teknikken med infusjonen av FITC-dextran, Tabuchi et al. vist at bare mellomstore arterioler med diameter på 30-50 μm viser en markert respons på hypoksi som opprettholdt over en periode på 60 min med en mindre demping etter 30 minutter. I motsetning viste små arterioler med diameter på 20-30 μm bare en mindre respons på hypoksi3. Denne teknikken tillater imidlertid ikke analyse av arterier med større diameter som 50 μm siden disse karene ligger for dypt i lungevevet.
For å bygge bro over gapet i analysen av store og svært små lungearterier (som de subpleurale karene) av murin lunger, vedtok vi en metode som ble beskrevet av Martin et al. for analyse av reaktivitet av luftveiene15. Basert på en agarose gel instilling teknikk, det letter forberedelsen av presisjon kuttet lunge skiver (PCLS) fra dette relativt myke og elastiske organet. Innenfor PCLS vasoreaktivitet av tverrsnitt arterier med indre diameter mellom 20-100 μm kan observeres direkte ved videomikroskopi. Påføring av legemidler under hypoksisk inkubasjon av PCLS tillater analyse av deres effekter på HPV. Det er spesielt viktig at denne teknikken også kan brukes på genetisk konstruert mus. Basert på deres plassering i lungen klassifiserer vi arteriene som pre- og intra-acinar kar, med indre diametre på henholdsvis 20-40 μm og 40-100 μm. Under en funksjonell visning leverer den intra-acinare arterien en individuell lungeacinus med blod, og pre-acinar arterien er de foregående karseksjonene. Opptak av bilder på et digitalt kamera tillater etterfølgende kvantifisering av vasoreaction. En åpenbar egenskap ved denne PCLS-modellen er mangelen på skjærstress som virker på endotelet. I perfunderte kar fører akutt HPV derimot til en økning i skjærstress og dermed indusere sekundære mekanismer som NO release16. I tillegg tillater bruk av PCLS målinger av HPV uten ekstrapulmonale nevrale eller hormonelle påvirkninger. I motsetning til cellekultursystemer, for eksempel tilberedt fra hundepulmonale arterielle glatte muskelceller17, er karveggens histologiske arkitektur nesten helt bevart.
Oppsummert gir denne protokollen en nyttig metode for analyse av potensielle molekylære oksygensensorer og / eller cellulære veier som er ansvarlige for HPV av intrapulmonale arterier med indre diametre mellom 20-100 μm under forhold uten skjærspenning.
Protocol
1. Tilberedning av gassblandinger, utstyr, instrumenter og løsninger
Denne delen beskriver nødvendig utstyr og oppsett for protokollen. Du finner mer informasjon om detaljer og produsenten i den tilhørende tabellen.
- Oppnå eller forbered følgende gassblandinger:
- To flasker med normoksisk gassblanding som består av 21% O2,5,3% CO2,73,7% N2.
- En flaske med hypoksisk gassblanding som består av 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2.
- Samle følgende utstyr:
- En mikrobølgeovn, for smelting av agarose.
- Et varmeskap, for å vaske ut agarose fra lungeseksjonene (se nedenfor). Sett inn et rør koblet til en flaske med normoksisk gassblanding i skapet.
- En vibratom med passende barberblader, for å kutte lungene i 200 μm tykke skiver. Det er fordelaktig hvis vibratomet er innredet med et kjølesett for å kjøle ned bufferen i vibratombassenget.
- Et gjennomstrømnings superfusjonskammer montert på et invertert mikroskop, for analyse av HPV av intrapulmonale arterier.
- For å lette fiksering av lungeseksjonene til bunnen av kammeret, koble nylonstrenger til en platinaring (selvkonstruert). Koble perfusjonskammeret til en peristaltisk pumpe med strømningshastigheter justert til henholdsvis 0,7 ml/min og 6 ml/min.
- Monter utstyret slik at mediene under forsøkene lagres i et 37 °C vannbad og bobles med normoksisk eller hypoksisk gass ved hjelp av 21 G x 4 3/4 kanyler. Bruk i tillegg en ny forbindelse fra gassflasken for å la de normoksiske/hypoksiske gassblandingene mates inn i luftrommet i perfusjonskammeret. Forsikre deg om at alle rørene i dette systemet er gasstett.
- Et CCD-kamera montert på et oppreist invertert mikroskop for å ta opp bilder av arterien analysert.
- Forbered følgende instrumenter:
- For fremstilling av lungene: et sterilt dissekeringssett, inkludert en grov saks og to par tang, en fin saks for åpning av brystet, en mikroscissor for å kutte et hull i luftrøret for å fylle ut agarose, og sy bomull (ca. 20 cm) for ligasjon av luftrøret for å forhindre utstrømning av agarose.
- For fylling av luftveiene med agarose: Koble en 2 ml sprøyte til det fleksible plastrøret til en IV-indwelling kanyle (20 G x 1 1/4).
- For perfusjon av lungene med buffer: Fest en 50 ml sprøyte som et bufferreservoar ca 40 cm over arbeidsplassen for musepreparatet.
- For utstrømning av bufferen: Koble sprøyten til et rør som en kanyle på 25 G x 1 er festet til. Bruk en klemme på røret for å justere utløpet til ca. 1 dråpe/sek (ca. 0,3-0,4 ml/min).
- Klargjør følgende buffere og medier:
- Lag 1000 ml HEPES-Ringer buffer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2,2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glukose, pH 7,4). Oppbevar den sterile filterte bufferen (porestørrelse på filter: 0,2 μm) ved 4 °C.
- Ca 30 min før du starter isolering av lungene forbereder følgende løsninger:
- Løs opp 1,5 % m/v lavt smeltepunkt i HEPES-Ringer-bufferen (totalt volum 10 ml) og smelt det ved å lage mat i en mikrobølgeovn. Deretter avkjøles den ned til 37 °C ved lagring i et varmeskap. Forvarm 2 ml sprøyten for å fylle agarose i lungeveiene.
- Ta 20 ml av HEPES-Ringer-bufferen, tilsett heparin i en endelig konsentrasjon på 250 I.U./ml, og varm bufferen til 37 °C. Umiddelbart før bruk tilsett natriumnittroprusside til en endelig konsentrasjon på 75 μM. Dette er perfusjonsbufferen for å løpe av blodet fra lungevaskulaturen.
- Sett 200 ml HEPES-Ringer buffer i et glassbeger og oppbevar det på is. Denne bufferen vil være nødvendig for å kjøle ned de agarosefylte isolerte lungene.
- Fyll ca 200 ml MEM supplert med 1% penicillin/streptomycin i et glassbeger og oppbevar det ved 37 °C i varmeskapet. Boble mediet med normoksisk gassblanding. Dette vil bli brukt til fjerning av agarose fra lungeseksjonene.
- Prewarm 2 flasker MEM supplert med 1% penicillin /streptomycin i et vannbad til 37 °C og boble dem med henholdsvis normoksisk og hypoksisk gassblanding i minst 2 timer før du starter de videomorfometriske målingene. Ca. 250 ml MEM vil være nødvendig per måling.
- Samle følgende tilleggsmaterialer:
- 70% EtOH for desinfeksjon.
- Lagerløsning av heparin (25.000 I.U./5 ml), lagret ved 4 °C (se ovenfor).
- Lagerløsning av NO donor natriumnittroprusside (Nipruss): 10 mM i H2O, lagret på is (se ovenfor).
- Lagerløsning av trombose analog U46619: 10 μM i etanol, lagret på is.
- Superlim.
- Sy bomull for ligasjon av luftrøret etter fylling med agarose.
2. Dyr
Bruk mus (for eksempel av stammen C57Bl6) av begge kjønn i en alder av 10-25 uker. HPV kan også analyseres i knockout-stammer og tilsvarende villtypestammer.
Alle eksperimenter ble utført i henhold til NIH-retningslinjene for pleie og bruk av eksperimentelle dyr, og ble godkjent av de lokale institusjonsstyrene.
3. Isolering av murine lunger og tilberedning av presisjonskuttede lungeskiver (PCLS)
- Drep musen ved cervical dislokasjon. Umiddelbart etter drap steriliserer du den ventrale kroppsoverflaten med 70% EtOH og bruker den grove saksen til å kutte huden langs ventral midtlinje fra haken til bekkenet.
Merk: Siden det er kjent at inhalative bedøvelsesmidler som isofluran har innvirkning på den vaskulære tonen18,19, ikke bruk flyktige bedøvelsesmidler. - Etter åpning av bukhulen, legg tarmløkkene til side og kutt de store bukkarene for blødning. Etter å ha penetrert membranen med den fine saksen, vil lungene kollapse som følge av luftinngang i pleuralhulen. Bruk saksen til å løsne membranen fra den dårligere thoraxåpningen. Klipp ribbenene og kragebenet sidelengs for å fjerne den ventrale delen av ripburet.
Merk: Det er viktig at lungene ikke blir skadet i dette trinnet, siden ellers vil oppblåsthet av lungene med agarose være umulig! Bruk kun sterile instrumenter og laboratorieglass. - Før du starter perfusjonen av lungevaskulaturen, kutt et lite hull i venstre ventrikel i hjertet for utslipp av bufferen. Fyll sprøytereservoaret med varm (37 °C) HEPES-Ringer-buffer som inneholder heparin og natriumnittroprusside (perfusjonsbuffer) og forfør lungevaskulaturen sakte via høyre ventrikel.
Merk: Perfusjon er effektiv når lungene endrer farge og får et hvitt utseende. I dette trinnet er det viktig å legge til natriumnittroprusside i perfusjonsbufferen; Dette forhindrer at pre-acinar arteriene rive av fra det omkringliggende vevet. - Fjern spyttkjertlene, små muskler og bindevev fra luftrøret. Koble luftrøret fra det omkringliggende bindevevet og trådsy bomull mellom spiserøret og luftrøret for senere ligasjon.
- Bruk mikroscissoren til å kutte et lite hull i den øvre delen av luftrøret mellom to nærliggende trakeale brusk. Sett nå inn det fleksible plastrøret til en IV-indwelling kanyle via det lille hullet i luftrøret og fest det forsiktig med sy bomull. Fyll luftveiene langsomt med det varme (37 °C) lave smeltepunktet. Vær oppmerksom på lungene: Først begynner høyre lunge å ekspandere etterfulgt av venstre lunge. Fylling fullføres når begge lungene er oppblåst til et volum som kan sammenlignes med in vivo-situasjonen (ca. 1,2-2,0 ml avhengig av kjønn, alder og vekt).
Merk: Hvis bare én lunge ekspanderer, kan plastrøret ha blitt satt inn for dypt slik at det har nådd bronchusen. I dette tilfellet må det trekkes litt ut. Husk at agarose vil størkne når den gradvis avkjøles. - Når lungene er fulle, trekk samtidig ut plastrøret og ligat luftrøret med sy bomull for å forhindre utstrømning av agarose. Deretter kutter du luftrøret over ligaturen og løsner lunger og hjerte på blokk fra brystet.
Merk: For nybegynnere kan det være nyttig å be en kollega om støtte i ligasjonstrinnet. - Overfør organpakken til iskald HEPES-Ringer-buffer for å størkne agarose. Dette skjer i løpet av få minutter.
- Skill de enkelte lungelobene og fest en lobe med superlim på prøveholderen på vibratomet.
Merk: Det er nyttig å stikke et stykke champagnekork på holderen som fungerer som skewback under kutting av det elastiske lungevevet. Avhengig av lungeloben som brukes og på orienteringen på prøveholderen, kan PCLS oppnådd være mer egnet for analyse av små eller store kar. For det meste bruker vi venstre lobe og høyre kranial lobe for fremstilling av PCLS. For å få tverrsnitt små intra-acinar arterier, lim kranial høyre lobe med hilum til holderen og skjær fra periferien. For å få tverrsnitt av pre-acinar arterier, juster hilum av høyre lobe med champagnekorken. - Bruk en vibratom utstyrt med et friskt barberblad for å kutte lungeloben i 200 μm tykke skiver (hastighet: 12 = 1,2 mm/sek; frekvens: 100; amplitude: 1,0). Samle PCLS i vibratombassenget fylt med 4 °C kald HEPES-Ringer-buffer.
Merk: Kjøling av HEPES-Ringer anbefales, men ikke viktig. - For fjerning av agarose, overfør organdelene til et glassbeger fylt med ca. 200 ml 37 °C varm MEM. Sett begeret inn i varmeskapet der et rør koblet til en flaske med normoksisk gassblanding settes inn. Boble MEM med normoksisk gass slik at lungeseksjonene sakte beveger seg i mediet. Etter ca 2 timer vil "agarose plakk" som fyller luftområdene bli fjernet fra lungevevet. Dette kan gjenkjennes av det faktum at seksjonene ikke lenger svømmer på toppen av mediet, men bosetter seg på bunnen av begeret.
4. Videomorfometrisk analyse av intrapulmonale arterier av PCLS
- For videomorfometrisk analyse av intrapulmonale arterier, overfør en PCLS til gjennomstrømnings superfusjonskammeret fylt med 1,2 ml normoksisk gasset MEM. Fest PCLS nederst i kammeret med nylonstrenger koblet til en platinaring (ytre/indre diameter: 14/10 mm).
- Skann PCLS mikroskopisk for tverrsnittsarterier med indre diametre mellom 20-100 μm.
Merk: Lumen i arteriene er foret av flate endotelceller. De omkringliggende glatte muskelcellene kan identifiseres i fasekontrastbildet som en "mørk ring" rundt lumen (se fasekontrastbilder i figur 2). I motsetning kan luftveiene identifiseres av det opprinnelig pseudostratifiserte columnar epitelet som passerer på vei til pleuraloverflaten til et enkelt kolonneepitel etterfulgt av et enkelt cuboidal epitel.- Mål den indre diameteren i begynnelsen av hvert eksperiment.
Merk: I litt skråt kuttede kar kan den sanne indre diameteren på den rørformede strukturen bestemmes i en 90° vinkel til lumens lengste akse. Store pre-acinar arterier med indre diametre >40 μm kjøre ved siden av bronkier og bronkioler. Små intra-acinar arterier med indre diameter <40 μm ligger ved kiler av alveolar septa ved siden av alveolae og alveolar kanaler6.
- Mål den indre diameteren i begynnelsen av hvert eksperiment.
- Eksperimentell design:
- Begynn hvert eksperiment med en "tilpasningsfase" der kammeret er perfundert med normoksisk gasset medium (strømningshastighet: 0,7 ml / min; 10 min). Deretter tester du fartøyets levedyktighet: Analyser kontraktiliteten til arterien ved å legge til 12 μl 10 μM U46619 (sluttkonsentrasjon 0,1 μM; 10 min; ingen strømning).
Merk: For dette arbeidet defineres et fartøy som levedyktig når lysområdet reduseres med minst 30% (for målemetode nedenfor). - Etter å ha vasket ut stoffet med normoksisk gasset medium (strømningshastighet: 6 ml / min; 10 min) utvider arterien ved påføring av 3 μl 10 mM Nipruss (sluttkonsentrasjon 25 μM; 10 min; ingen strømning).
- Igjen, fjern stoffet med en 10 min vask med normoksisk gasset medium (strømningshastighet: 6 ml / min) etterfulgt av 10 min ved en strøm på 0,7 ml / min.
- Induser hypoksisk lungevaokonstriksjon ved inkubasjon av PCLS med hypoksisk gasset medium (strømningshastighet: 0,7 ml/min; 40 min). Ved et ekstra rørsystem, mate den hypoksiske gassblandingen inn i luftrommet i perfusjonskammeret.
- Fjern det hypoksiske mediet med en 20 min vask med normoksisk gasset medium (strømningshastighet: 6 ml/min).
- På slutten av hvert eksperiment legger du til 1,2 μl 10 μM U46619 (endelig konsentrasjon 0,01 μM; 20 min; ingen strømning) til perfusjonskammeret for å indusere vasokonstriksjon.
Merk: Dette siste trinnet tillater bestemmelse av om en endring i hypoksisk respons (for eksempel indusert ved samtidig påføring av et stoff i hypoksisk fase eller observert i en PCLS utarbeidet fra en knockout musstamme) er spesifikk for hypoksiindusert innsnevring eller om det gjenspeiler en generell innvirkning på kontraktilitet. Konsentrasjonen på 0,01 μM tilsvarer EC50-verdien av U46619 som ble estimert i tidligere konsentrasjonskontraksjonsmålinger (ikke publisert). - Bruk en annen PCLS til å utføre kontrolleksperimenter med normoksisk i stedet for hypoksisk gasset MEM og normoksisk gassblanding i luftrommet i perfusjonskammeret.
- Begynn hvert eksperiment med en "tilpasningsfase" der kammeret er perfundert med normoksisk gasset medium (strømningshastighet: 0,7 ml / min; 10 min). Deretter tester du fartøyets levedyktighet: Analyser kontraktiliteten til arterien ved å legge til 12 μl 10 μM U46619 (sluttkonsentrasjon 0,1 μM; 10 min; ingen strømning).
5. Analyse av vasoreaktivitet og grafisk presentasjon
- Bruk egnet programvare ta bilder fra tverrsnitt arterien hvert minutt under hele eksperimentet.
- Bruk av egnet programvare evaluerer endringer av lysområdet på fartøyene ved å fôre de indre grensene for hånd ved hjelp av fullskjermbilder.
Merk: Det er tilstrekkelig å analysere hvert andre bilde for å få klare grafer. Men når en betingelse i gjennomstrømnings superfusjonskammeret endres til en annen, analyser hvert bilde. De resterende bildene fungerer som sikkerhetskopi i tilfelle ett fotografi ikke kan analyseres.
Dessverre må dette tidkrevende trinnet gjøres for hånd og ikke av passende programmer, siden noen ganger er blodceller festet til den vaskulære veggen som beveger seg under målingen, eller det er ikke et perfekt tverrsnitt av fartøyet, men et tangentielt avsnitt der en pålitelig lokalisering av de indre grensene bare kan gjøres under visuell kontroll. - Definer verdien oppnådd for fartøyets lumen i begynnelsen av eksperimentet som 100% og uttrykk vasokonstriksjon eller dilatasjon som relativ reduksjon eller økning av denne verdien.
- For hvert eksperiment plotter det relative lysområdet mot tiden ved hjelp av egnet programvare.
- For å oppsummere flere eksperimenter, plotte midler til de relative lysområdene +/- standardfeil av gjennomsnittet (SEM) mot tiden.
Merk: For en klar presentasjon av effekten av ulike stoffer på hypoksi- eller U46619-indusert lungevaokonstriksjon eller av hypoksisk respons av knockoutmusstammer, kan den første fasen av forsøkene, der fartøyets levedyktighet testes, utelates fra grafen. I dette tilfellet er verdiene oppnådd i begynnelsen av eksponeringen for redusert oksygen definert som 100%.
6. Statistisk analyse
- Analyser forskjeller mellom eksperimentelle grupper med Kruskal-Wallis- og Mann-Whitney-testen, der p≤0,05 anses som signifikant, og p≤0,01 svært signifikant.
Merk: For ytterligere informasjon om forberedelse og driftsbruk av PCLS, se også20,21.
Representative Results
I figur 1 gis resultatene av måling av HPV av en stor pre-acinar arterie og i figur 2 av små intraacinære arterier. I fasekontrastbildene (figur 1A og 2A) blir det klart at det er mulig å diskriminere disse 2 klassene arterier basert på deres plassering i lungevevet: Pre-acinar arterier kjører i nært nabolag til bronkier og bronkioli (Figur 1A), mens de intra-acinar arteriene ligger ved kiler av alveolar septa og omgitt av alveolae (Figur 2A). Med litt øvelse er det mulig å se endringene i lysområdet som svar på U46619 på fasekontrastbildene (Figur 1A og 2A). Imidlertid er hypoksisk lungevaokonstriksjon ofte ikke så uttalt og blir bare tydelig etter fullstendig evaluering av endringene i lysområdene (Figur 1B, 1C, 2B og, 2C). Av didaktisk grunn har vi gitt et eksempel på en pre-acinar arterie som viser en uvanlig uttalt vasokonstriksjon. I gjennomsnitt resulterer HPV i en 20-30% reduksjon av lysområdet.
I figur 2 vises opptakene av små intra-acinar arterier inkubert med hypoksisk gasset medium med eller uten 50 μM pinacidil (en ikke-selektiv åpner av mitokondrie ATP-sensitive kaliumkanaler) og den hemmende effekten av stoffet blir tydelig synlig. Den siste delen av eksperimentet demonstrerer selektiviteten av virkningen av stoffet på HPV: Vasokonstriksjon indusert av trombokananalogen U46619 endres ikke ved tilsetning av pinacidil. Faktisk er kurven for arterien utsatt pinacidil går tydelig lavere enn de to andre, men omfanget av reduksjon av lysområdet med U46619 alene er sammenlignbar. I dette tilfellet var det den ufullstendige reversjon av HPV som forårsaker forskjellen mellom kurvene. I denne grafen er også en arterie utsatt for normoksisk gasset medium inkludert som ekstra kontroll. Under denne tilstanden kan ingen endringer i lysområdet påvises.
I figur 3 vises dataene for hele serien med målinger om påvirkning av pinacidil på HPV. For sammenligning av de to gruppene for statistiske forskjeller ble datasettene for de angitte tidspunktene analysert med Kruskal-Wallis- og Mann-Whitney-testen. HPV ble tydelig avskaffet i nærvær av pinacidil, mens U46619-indusert sammentrekning var uendret.
Alternativt er det mulig å identifisere forskjeller mellom grupper ved sammenligning av området under kurven som beskrevet i Müller-Redetzky et al. 22
Figur 1. Måling av HPV av en stor pre-acinar arterie. (A) Fasekontrastbilder av en tverrsnittet pre-acinar arterie (a) som går i nærheten av en tverrsnitt bronchus (B). Bildene er tatt på de tidspunktene som er angitt i (B) av sirkler: i begynnelsen av målingen (a), på slutten av behandlingen med U46619 (b), på slutten av eksponeringen for Nipruss (c), etter 30 eller 40 min i hypoksisk gasset medium (d, e), etter vask med normoksisk gasset medium (f), og etter den endelige anvendelsen av U46619 (g). I grafen (B) er endringer i lysområdet plottet mot tiden, mens lysområdet i begynnelsen av eksperimentet er definert som 100% og vasokonstriksjon / -dilatasjon er gitt som relative verdier. I dette tilfellet induserer hypoksi en 60% reduksjon av lysområdet. (C) For en klarere presentasjon av den hypoksiske responsen er den første fasen av eksperimentet der vasoreaktiviteten ble testet, ikke inkludert, men verdien oppnådd umiddelbart før eksponering for redusert oksygen er satt til 100% (se også figur 2). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Påvirkning av pinacidil (en ikke-selektiv åpner av mitokondrie ATP-sensitive kaliumkanaler; mitokKATP) på HPV av små intraacinære arterier. (A) Intra-acinar arterier (a) ligger ved kiler av alveolar septa. Alv = alveolus. Sekvensen av de individuelle forholdene som brukes i disse eksperimentene, er gitt i overskriften til grafen (B). Hypoksisk eksponering utføres i nærvær eller fravær av 50 μM pinacidil. Kontrollinkubasjoner gjøres med normoksisk gasset medium. Bilder vist i (A) er tatt i begynnelsen av målingen (a, a', a"), på slutten av behandlingen med U46619 (b, b', b"), på slutten av eksponeringen for Nipruss (c, c', c"), etter 30 eller 40 min i hypoksisk eller normoksisk gasset medium (d, d', d"; e, e', e"), etter vask med normoksisk gasset medium (f, f', f"), og etter den endelige anvendelsen av U46619 (g, g', g"). For en klarere presentasjon av responsen på normoksia/hypoksi/hypoksi+pinacidil settes verdiene som oppnås umiddelbart før eksponering for normoksisk-/hypoksisk-gasset medium som 100% (C). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Hemming av HPV ved pinacidil. Opptakene av små intra-acinar arterier utsatt for hypoksisk gasset medium med eller uten 50 μM pinacidil er oppsummert og presentert som midler ± SEM. I (A) gis de fullstendige opptakene, i (B) vises de relative dataene i forhold til verdien i begynnelsen av den hypoksiske inkubasjonen. Ingen vasoreaktivitet kan påvises i PCLS som utsettes for hypoksisk gasset medium som inneholder pinacidil. Vasokonertriksjon indusert av U46619 påvirkes ikke av stoffet. "n" i parentes refererer til antall arterier / antall dyr som PCLS ble laget av. Med andre ord beskriver det første tallet antall lungeseksjoner analysert, og det andre tallet gir antall mus som disse seksjonene ble utarbeidet fra. På de gitte tidspunktene testes forskjellene mellom begge gruppene for betydning. n.s.: ikke signifikant, *: p≤0,05, **: p≤0,01, ***: p≤0,001. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 4. Skjematisk oversikt over metoden. Kort sagt, mus blir drept av livmorhals dislokasjon. Etter åpning av brystet er lungene fylt med lavt smeltepunkt agarose og etter nedkjøling kuttet i 200 μm tykk presisjon kuttet lungeskiver (PCLS). Etter å ha fjernet agarose ved 37 °C overføres en PCLS til gjennomstrømnings superfusjonskammeret der den utsettes for normoksisk medium eller til middels gasset med 1% O2. Vasoreaktivitet registreres som endringer i lysområdet. Klikk her for å vise større bilde.
Discussion
Den isolerte ventilerte og perfunderte muse lungen er en utmerket modell for analyse av den fysiologiske responsen til lungevaskulærsystemet på endringer i oksygentilførselen og tillater blant annet kontinuerlig måling av lungearterialtrykket1. Denne modellen tillater imidlertid ikke identifisering og analyse av de vaskulære segmentene som viser den sterkeste responsen på hypoksi. Dette er fordelen med vår videomorfometriske analyse av PCLS som letter måling av HPV av individuelle arterier med indre diametre på 20-100 μm. PCLS representerer en attraktiv in vitro-modell siden de ligner på orgelet de er forberedt fra. I motsetning til cellekultursystemer er alle celletyper til stede i den opprinnelige vevsmatrisekonfigurasjonen. Videre er en lunge tilstrekkelig for fremstilling av mange PCLS, slik at minst delvis eksperimenter kan standardiseres ved bruk av seksjoner fra samme mus. Ifølge 3R-konseptet (reduksjon, raffinement og erstatning av laboratoriedyr i livsvitenskapen) til Russell og Burch23 argumenterer dette faktum også for bruk av PCLS.
Imidlertid må man huske på at vevet er skadet ved å kutte med en vibratom og langsgående signalering for eksempel via endotelcellene som postulert av Kübler et al. 14 er ikke lenger mulig.
I utgangspunktet ble PCLS hovedsakelig brukt til biokjemiske, farmakologiske og toksikologiske studier, men i mellomtiden brukes de også til måling av bronkial kontraktilitet, mucociliary funksjon og vaskulære responser (for vurderinger se Sanderson20 og Davies21). Holdt et al. har utført en studie der de sammenlignet modellene av isolert perfundert og ventilert mus lunge og av PCLS24. De fant ved analyse av responsen fra luftveier og lungefartøy til en rekke endogene mediatorer at viktige egenskaper ved hele lungen ble opprettholdt i PCLS.
I PCLS etableres ikke hypoksiske forhold via luftveiene som i den intakte lungen, men ved inkubasjon av lungeseksjonen i hypoksisk gasset medium. Vi har analysert oksygen partielt trykk (pO2) av medium pregassed med 1% O2,5.3% CO2,93.7% N2 og med 21% O2,5.3% CO2,73.7% N2, henholdsvis ved hjelp av en blodgass analysator. Umiddelbart før du matet den inn i perfusjonskammeret, var pO2 av den hypoksiske gassede MEM 40 mmHg og den av det normoksiske gassede mediet 160 mmHg6. I den intakte lungen HPV induseres når alveolar pO2 faller under 50 mmHg25, en situasjon som åpenbart kan etterlignes ved påføring av hypoksisk gasset medium. Våre data om omfanget av HPV samsvarer godt med resultater oppnådd med en annen eksperimentell tilnærming. Yamaguchi et al. har påført isolerte rotte lunger for å undersøke mikrovessels med diameter på 20-30 μm ved sanntid konfokal laser skanning luminescens mikroskopi koblet til et høysensitivt kamera med en bildeforsterker10. De observerte en gjennomsnittlig reduksjon i diameter på 2,7 μm etter eksponering av lungene til hypoksi. Man kan beregne at en 20% reduksjon av lysområdet når vi måler det i systemet vårt tilsvarer ca 15% reduksjon i diameter.
I våre eksperimenter har vi klassifisert arteriene som henholdsvis pre- og intra-acinar kar, med indre diametre på 40-100 μm og 20-40 μm. Hos mennesker skjer overgangen fra muskulære til ikke-muskulære arterier i diameterområdet 70-100 μm. Hos mus er glatte muskelceller til stede ned til en ekstern diameter på 20 μm26. Av denne grunn er det ikke mulig å analysere arterier med diametre under 20 μm siden de ikke kan identifiseres basert på fasekontrastbildet. I den andre enden av skalaen er fartøy med diameter over 100 μm neppe å finne i PCLS og ofte strippet fra det omkringliggende vevet.
Faktisk diskuteres en rekke molekylære kandidater som molekylære oksygensensorer eller som en del av signalkaskaden som resulterer i HPV (for en gjennomgang se Sylvester et al. 4). Når passende knockoutmus er tilgjengelig, kan videomorfometri brukes til analyse av vasoreaktivitet av pre- og intraacinære arterier sammenlignet med ville dyr. PCLS har imidlertid også blitt brukt til andre problemer: Faro et al. brukte dem til å karakterisere utviklingen av endotelavhengig utvidelse i lunge etter fødselen29 og PCLS tilberedt fra marsvin utsatt for røyk eller luft daglig i 2 uker ble brukt til å demonstrere virkningen av sigarettrøyk på vasoreaktivitet via induksjon av endotel dysfunksjon30.
Kritiske trinn i protokollen
I våre eksperimenter klassifiserte vi arteriene som pre-acinar (indre diametre på 40-100 μm) og intra-acinar (indre diametre på 20-40 μm). Spesielt for fremstilling av lungeseksjoner som skal brukes til analyse av større fartøy, er det viktig å legge natriumnitroprusside til perfusjonsbufferen. Dette stoffet forhindrer sammentrekning av karene under prøvepreparatet og dermed deres rip off fra det omkringliggende vevet som fører til ufullstendig vasodilatasjon. Natriumnittroprusside i perfusjonsbufferen er ikke så viktig for fremstilling av lungeseksjon som skal brukes til analyse av små arterier fordi de er sterkt forankret til alveolar septa.
Alle eksperimenter bør startes med inkubasjoner der reaktivitet av arteriene testes. Sjelden fikk vi lungepreparater der ingen respons av fartøy til entreprenører eller dilatatorer var påviselig. Vi vet ikke årsaken til dette: Kan være at volumet av agarose fylt i lungene var for stort eller for lavt, slik at kutting av orgelet i PCLS ikke var optimalt. Alternativt er det tenkelig at agarose var avkjølt for fort under innåndingsprosedyren, noe som resulterte i skadelig skjærspenning. I tilfelle at i en individuell PCLS er ingen levedyktig arterie detekterbar, må delen kastes og erstattes av en annen.
Beslutningen om levedyktigheten til en arterie ble tatt basert på responsen på U46619. Påføring av U46619 i en konsentrasjon på 0,1 μM induserer en vasokonstriksjon som - etter litt trening - er synlig direkte i bildesekvensen på skjermen. Siden det er noen varianser i vasoreaktiviteten, undersøker vi virkningen av et stoff på HPV ved å måle vasoresponsen i lungeseksjoner utsatt for stoffet eller til mediet alene i sin tur.
HPV av en individuell arterie er ofte neppe påviselig i mikroskopet, og i gjennomsnitt resulterer det i en reduksjon av lysområdet på ca 20-30%. Imidlertid har små endringer i diameteren til en arterie en tydelig inngang på strømningsmotstand. I henhold til ligningen "R = 1/r4" med R = motstand og r = radius, er strømningsmotstanden omvendt proporsjonal med radiusens fjerde kraft. La meg gi et eksempel: En "ideell arterie" som viser et sirkulært tverrsnitt med en diameter på 40 μm (r = 20 μm) har et lysområde på ca 1260 μm2. Når lysområdet reduseres med 20%, kan vi beregne at fartøyets diameter reduseres med 10,5% til 35,8 μm (r = 17,9 μm). Ifølge ligningen gitt ovenfor, vil strømningsmotstanden til dette fartøyet øke fra 6,25 x 10-6 til 9,71 x 10-6 som er med ca. 55%. Ved en reduksjon av lysområdet med 30% ville radiusen reduseres med ca 16%, men strømningsmotstanden vil øke med ca 100%. Selv om disse beregningene er en forenkling der en laminær blodstrøm og en karform av et stivt rør antas, er det antydende virkningen av allerede mindre endringer i diameteren på strømningsmotstanden.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen er sponset av Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
| Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
| Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
| Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
| Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
| Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
| Various scissors and forceps | |||
| Sewing cotton | |||
| 2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
| Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
| Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
| Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
| NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
| KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
| MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
| CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
| Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
| Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
| Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
| Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
| 70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
| Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
| U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
| Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
| Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
| SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |
References
- Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).
- Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor. J. Physiol. 536, 211-224 (2001).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).
- Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. Hypoxic pulmonary vasoconstriction. Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).
- Schumacker, P. T. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).
- Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).
- Paddenberg, R., et al. Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries. Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).
- Wang, L., Yin, J., et al. Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction. J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).
- Archer, S. L., Huang, J. M., et al. Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and. 78, 431-442 (1996).
- Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis. Circ. Res. 82, 722-728 (1998).
- Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia. Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).
- Glazier, J. B., Murray, J. F. Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion). J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).
- Bhattacharya, J., Staub, N. C. Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung. Science. 210, 327-328 (1980).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs. J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).
- Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).
- Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium. J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).
- Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung. Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Davies, J. Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook. , John Wiley & Sons. 57-68 (2012).
- Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice). PLoS One. 7 (5), (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Universities Federation for Animal Welfare. , Wheathampstaed, UK. (1959).
- Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. Characterization of airway and vascular responses in murine lungs. Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).
- Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis. Thieme Verlag. , 198-19 (2009).
- Will, J. The Pulmonary Circulation. in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).
- Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice. Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).
- Wright, J. L., Churg, A. Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices. J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).
