Summary
Hypoxic pulmonell vasoconstriction (HPV) är ett viktigt fysiologiskt fenomen genom vilket vid alveolar hypoxi lungperfusion matchas med ventilation. Det stora kärlsegmentet som bidrar till HPV är intraacinär artär. Här beskriver vi vårt protokoll för analys av HPV av murinpulmonellkärl med diametrar på 20-100 μm.
Abstract
Akut alveolär hypoxi orsakar lungvasokonstriktning (HPV) - även känd som von Euler-Liljestrand-mekanismen - som tjänar till att matcha lungperfusion med ventilation. Hittills har de underliggande mekanismerna inte förståtts fullt ut. Det stora kärlsegmentet som bidrar till HPV är intraacinär artär. Denna kärlsektion är ansvarig för blodtillförseln av en enskild acinus, som definieras som den del av lungdetal till en terminal bronkiol. Intraacinära artärer finns till största delen av den del av lungan som inte selektivt kan uppnås med ett antal vanliga tekniker såsom mätning av lungartärtrycket i isolerade perfunderade lungor eller kraftinspelningar från dissekerade proximala lungartärsegment1,2. Analysen av subpleurala kärl genom konfokal laserskanning i realtid är begränsad till fartyg med upp till 50 μm i diameter3.
Vi tillhandahåller en teknik för att studera HPV av murin intra-pulmonell artärer i intervallet 20-100 μm inre diametrar. Det är baserat på videomorfetrisk analys av tvärsnittsartärer i precisionsskurna lungskivor (PCLS). Denna metod möjliggör kvantitativ mätning av vasoreaktivitet hos små intraacinära artärer med innerdiameter mellan 20-40 μm som är belägna vid grener av alveolar septa bredvid alveolära kanaler och av större preacinära artärer med innerdiametrar mellan 40-100 μm som löper intill bronkier och bronkioler. I motsats till realtidsavbildning av subpleurala kärl hos bedövade och ventilerade möss sker videomorfetrisk analys av PCLS under förhållanden fria från savspänning. I vår experimentella modell uppvisar båda kranskärlens segment en monofasisk HPV när de utsätts för medium gasas med 1% O2 och svaret bleknar efter 30-40 min vid hypoxi.
Introduction
I de flesta systemiska vaskulär sängar hypoxi inducerar vasodilatation, i jämförelse med vasoconstriction orsakas av hypoxi i pulmonell vaskulatur. Detta lungspecifika svar på sänkt syrespänning kallas hypoxisk lungvasokonstriktions (HPV), insets inom några sekunder och vänder snabbt efter återgång till normoxisk ventilation. Även om HPV är känt i mer än 60 år, diskuteras fortfarande cellulära syresensorer och signalkaskader som resulterar i vasokonstriktions. Det finns en relativt bred konsensus att hypoxi-framkallade redox och ROS förändringar är väsentliga för HPV och utvecklingen av pulmonell hypertoni (ses över i Sylvester et al. 4 och Schumacker et al. 5). Våra egna data stöder en central roll av komplexa II av mitokondriell andningskedja i HPV6,7. Nyligen, Wang et al. presenteras ett helt nytt koncept för syreavkänning och HPV: Baserat på deras data föreslår de att alveolar hypoxi avkäns av angränsande kapillärer orsakar membran depolarization av endotelcellerna. Svaret sprids via connexion 40 gap korsningar av endotelceller som leder till förträngning av glatt muskelceller i uppströms arterioles8.
Artärerna i lungan löper längs luftvägarna, förgrenar sig med dem, minskar kontinuerligt i diameter och levererar slutligen blod till kapillärsystemet som ligger i de alveolära väggarna. Denna kranskärlscirkulation består av anatomiskt och funktionellt distinkta segment. De proximala ledningsartärerna, kännetecknade av ett överflöd av elastiska fibrer i väggarna, följs av helt muskulösa intra-pulmonella artärer som till stor del kontrollerar lungvaskulär resistens. Steg för steg passerar dessa artärer in i segment där muskelskiktet blir ofullständigt, och slutligen är kärlen fria från smidiga muskelaktiva-immunreaktiva celler. Intraacinar gatan matar en individuell pulmonell acinus med blod representerar ett delvis muskulöst segment6. På samma sätt representerar lungartärsystemet inte en enhetlig struktur när det gäller det hypoxiska svaret utan uppvisar markerad regional mångfald9,10. Till exempel, i proximala lungartärer isolerade från råtta lungor hypoxi inducerar ett bifasiskt svar, visar en första snabb sammandragning av kort varaktighet som - efter ofullständig avslappning - följs av en andra långsam men ihållande sammandragning11. I resistens artärer isolerade från råtta lung parenkym som fjärde och femte uppdelningen av pulmonell artärer (yttre diameter <300 μm), hypoxi orsakar monofasisk förträngning9. Redan 1971 avslutade Glazier och Murray mätningar av förändringar i den kapillärröda blodcellskoncentrationen i lungor hos hundar ventilerade med hypoxiska gasblandningar att den hypoxiinducerade ökningen av kärlresistens huvudsakligen inträffade uppströms kapillärerna12. Numera representerar intravital mikroskopi av intakta lungor av sövda och mekaniskt ventilerade möss ett kraftfullt verktyg för analys av lungmikrovaskulaturen13,14. Excision av ett cirkulärt fönster i bröstväggen ger mikroskopisk tillgång till lungytan och möjliggör analys av subpleurala lungkärl med upp till 50 μm i diameter. Genom att kombinera denna teknik med infusionen av FITC-dextran, Tabuchi et al. visat att endast medelstora arterioler med diametrar på 30-50 μm uppvisar ett markant svar på hypoxi som upprätthölls under en period av 60 min med en mindre dämpning efter 30 min. Däremot visade små arterioler med diametrar på 20-30 μm endast ett mindre svar på hypoxi3. Denna teknik tillåter dock inte analys av artärer med en diameter större än 50 μm eftersom dessa kärl ligger för djupt i lungvävnaden.
För att överbrygga klyftan i analysen av stora och mycket små lungartärer (såsom subpleurala kärl) av murin lungor, antog vi en metod som beskrevs av Martin et al. för analys av luftvägarnas reaktivitet15. Baserat på en agarose gel ingjutning teknik, underlättar det beredningen av precisionsskurna lungskivor (PCLS) från detta relativt mjuka och elastiska organ. Inom PCLS vasoreactivity av tvärsnittsartärer med innerdiameter mellan 20-100 μm kan observeras direkt genom videomikroskopi. Applicering av läkemedel under hypoxic inkubation av PCLS gör det möjligt att analysera deras effekter på HPV. Det är särskilt viktigt att denna teknik också kan tillämpas på genetiskt konstruerade musar. Baserat på deras placering i lungan klassificerar vi artärerna som pre- och intraacinära kärl, med innerdiametrar på 20-40 μm respektive 40-100 μm. Under en funktionell vy förser intraacinarartären en individuell lungacinus med blod och preacinarartären är de föregående kärlsektionerna. Inspelning av bilder på en digitalkamera möjliggör efterföljande kvantifiering av vasoreaction. En uppenbar egenskap hos denna PCLS-modell är bristen på savstress som verkar på endotel. I perfunderade kärl leder däremot akut HPV till en ökning av saxstress och leder därmed till sekundära mekanismer som NO release16. Dessutom tillåter användningen av PCLS mätningar av HPV utan extrapulmonell neural eller hormonella influenser. I motsats till cellkultursystem, till exempel beredda från hund pulmonell arteriell glattmuskelceller 17, är den histologiska arkitekturen i kärlväggen nästan helt bevarad.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en användbar metod för analys av potentiella molekylära syresensorer och/eller cellulära vägar som ansvarar för HPV av intrapulmonella artärer med innerdiametrar mellan 20-100 μm under förhållanden fria från savspänning.
Protocol
1. Beredning av gasblandningar, utrustning, instrument och lösningar
I det här avsnittet beskrivs nödvändig utrustning och uppsättning för protokollet. Ytterligare information och tillverkarinformation finns i medföljande tabell.
- Erhåll eller förbered följande gasblandningar:
- Två flaskor med normoxisk gasblandning bestående av 21% O2,5,3% CO2,73,7% N2.
- En flaska med hypoxisk gasblandning bestående av 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2.
- Samla in följande utrustning:
- En mikrovågsugn, för att smälta agarosen.
- Ett värmeskåp, för att tvätta bort agarosen från lungsektionerna (se nedan). Sätt i ett rör som är anslutet till en flaska med normoxisk gasblandning i skåpet.
- En vibratome med lämpliga rakblad, för att skära lungorna i 200 μm tjocka skivor. Det är fördelaktigt om vibratome är inredd med ett kylaggregat för att kyla ner bufferten i vibratomebassängen.
- En genomflödes superfusionskammare monterad på ett inverterat mikroskop, för analys av HPV av intrapulmonella artärer.
- För att underlätta fixering av lungsektionerna till botten av kammaren, anslut nylonsträngar till en platinaring (självkonstruerad). Anslut perfusionskammaren till en peristaltisk pump med flödeshastigheter inställda på 0,7 ml/min respektive 6 ml/min.
- Montera utrustningen så att mediet under försöken förvaras i ett vattenbad på 37 °C och bubblar med normoxisk eller hypoxisk gas med hjälp av 21 G x 4 3/4 kanyler. Använd dessutom en andra anslutning från gasflaskan för att tillåta att de normoxiska/hypoxiska gasblandningarna matas in i perfusionskammarens luftutrymme. Se till att alla rör i detta system är gastäta.
- En CCD-kamera monterad på ett upprätt inverterat mikroskop för att spela in bilder av artären analyseras.
- Förbered följande instrument:
- För beredning av lungorna: en steril dissekeringsset inklusive en grov sax och två par tångar, en fin sax för bröstöppning, en mikroscissor för att skära ett hål i luftstrupen för att fylla i agarosen och sy bomull (ca 20 cm) för ligering av luftstrupen för att förhindra utflöde av agarosen.
- För fyllning av luftvägarna med agarose: anslut en 2 ml spruta till det flexibla plaströret på en IV-indwelling kanyl (20 G x 1 1/4).
- För perfusion av lungorna med buffert: fixera en 50 ml spruta som en buffertbehållare ca 40 cm ovanför arbetsplatsen för musberedningen.
- För utflöde av bufferten: anslut sprutan till ett rör som en kanyl på 25 G x 1 är fastsatt på. Använd en klämma vid röret för att justera utflödet till ca 1 droppe/sek (ca 0,3-0,4 ml/min).
- Förbered följande buffertar och media:
- Gör 1 000 ml HEPES-Ringer-buffert (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2,2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glukos, pH 7,4). Förvara den sterila filtrerade bufferten (filtrets porstorlek: 0,2 μm) vid 4 °C.
- Ca 30 min innan isoleringen av lungorna börjar förbereda följande lösningar:
- Lös upp 1,5 % w/v låg smältpunktsagarosa i HEPES-Ringer-bufferten (total volym 10 ml) och smält den genom att laga mat i mikrovågsugn. Kyl sedan ner den till 37 °C genom förvaring i ett värmeskåp. Förvärm 2 ml sprutan för att fylla agarosen i lungvägarna.
- Ta 20 ml HEPES-Ringer-buffert, tillsätt heparin till en slutlig koncentration på 250 I.U./ml och värm bufferten till 37 °C. Tillsätt omedelbart före användning natriumnityriden till en slutlig koncentration på 75 μM. Detta är perfusionsbufferten för att springa av blodet från lungvaskulaturen.
- Lägg 200 ml HEPES-Ringer buffert i en glasbägare och förvara den på is. Denna buffert kommer att behövas för att kyla ner de agarosefyllda isolerade lungorna.
- Fyll ca 200 ml MEM kompletterad med 1% penicillin/streptomycin i en glasbägare och förvara den vid 37 °C i värmeskåpet. Bubbla mediet med normoxisk gasblandning. Detta kommer att användas för avlägsnande av agaros från lungsektionerna.
- Förvärmning 2 flaskor MEM kompletterad med 1% penicillin/streptomycin i ett vattenbad till 37 °C och bubbla dem med normoxisk respektive hypoxisk gasblandning i minst 2 timmar innan de videomorfometriska mätningarna påbörjas. Cirka 250 ml MEM kommer att krävas per mätning.
- Samla in följande ytterligare material:
- 70% EtOH för desinfektion.
- Stamlösning av heparin (25.000 I.U./5 ml), lagrad vid 4 °C (se ovan).
- Stamlösning av NO-donatorn natriumnityrid (Nipruss): 10 mM i H2O, lagrad på is (se ovan).
- Stamlösning av trombananalog U46619: 10 μM i etanol, lagrad på is.
- Superlim.
- Sy bomull för ligering av luftstrupen efter fyllning med agarose.
2. Djur
Använd möss (till exempel stammen C57Bl6) av båda könen vid en ålder av 10-25 veckor. HPV kan också analyseras i knockoutstammar och motsvarande vilda typstammar.
Alla experiment utfördes enligt NIH:s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och godkändes av de lokala institutionella nämnderna.
3. Isolering av murin lungor och förberedelse av precisionsskurna lungskivor (PCLS)
- Döda musen genom livmoderhalsförskjutning. Omedelbart efter avlivning sterilisera ventral kroppsytan med 70% EtOH och använd den grova saxen för att skära huden längs den ventrala mittlinjen från hakan till bäckenet.
Obs: Eftersom det är känt att inhalativa bedövningsmedel som isofluran påverkar kärltonen18,19, använd inte flyktiga bedövningsmedel. - Efter öppnandet av bukhålan, lägg tarmöglorna åt sidan och skär de stora bukkärlen för blödning. Efter att ha penetrerat membranet med den fina saxen kommer lungorna att kollapsa som ett resultat av luftingång i pleurahålan. Använd saxen för att lossa membranet från den sämre bröstöppningen. Skär revbenen och nyckelbenet i senareled för att ta bort den ventrala delen av ripburen.
Obs: Det är viktigt att lungorna inte skadas i detta steg eftersom annars uppblåsthet av lungorna med agarose kommer att vara omöjligt! Använd endast sterila instrument och laboratorieglas. - Innan du börjar perfusionen av lungvaskulaturen, skär ett litet hål i hjärtats vänstra ventrikel för urladdning av bufferten. Fyll sprutbehållaren med varm (37 °C) HEPES-Ringer-buffert som innehåller heparin och natriumnitross (perfusionsbuffert) och sätt långsamt på lungvaskulaturen via rätt ventrikel.
Perfusion är effektivt när lungorna ändrar färg och får ett vitt utseende. I detta steg är det viktigt att tillsätta natriumnityr på perfusionsbufferten. Detta förhindrar att preacinära artärer slits av från den omgivande vävnaden. - Ta bort salivkörtlarna, små musklerna och bindväven från luftstrupen. Koppla bort luftstrupen från den omgivande bindväven och gänga sy bomull mellan matstrupen och luftstrupen för senare ligatur.
- Använd mikroscissatorn för att skära ett litet hål i luftstrupens övre del mellan två närliggande trakealbroser. Sätt nu in det flexibla plaströret på en IV-kanyl i indwelling via det lilla hålet i luftstrupen och fixera det försiktigt med sy bomullen. Fyll långsamt luftvägarna med den varma (37 °C) låga smältpunkten agarosa. Observera lungorna: Först börjar höger lunga expandera följt av vänster lunga. Fyllningen slutförs när båda lungorna är uppblåsta till en volym som är jämförbar med in vivo-situationen (ca 1, 2-2, 0 ml beroende på kön, ålder och vikt).
Obs: Om bara en lunga expanderar kan plaströret ha satts in för djupt så att det har nått bronkerna. I det här fallet måste det dras ut lite. Tänk på att agarosen stelnar när den gradvis svalnar. - När lungorna är fulla, dra samtidigt ut plaströret och ligate luftstrupen med sy bomull för att förhindra utflöde av agarose. Skär därefter luftstrupen ovanför ligaturen och lossa lungor och hjärta på blocket från bröstet.
För nybörjare kan det vara bra att be en kollega om stöd i ligatursteget. - Överför organförpackningen till iskall HEPES-Ringer-buffert för att stelna agarosen. Detta händer inom några minuter.
- Separera de enskilda lungloberna och fixera en lob med superlim på provhållaren på vibratomen.
Obs: Det är bra att sticka en bit av en champagnekork på hållaren som fungerar som skewback under skärning av den elastiska lungvävnaden. Beroende på vilken lunglob som används och dess orientering på provhållaren kan pcls som erhålls vara mer lämpad för analys av små eller stora kärl. Mestadels använder vi vänster lob och rätt hjärnskålen lob för beredning av PCLS. För att få tvärsnitt små intraacinära artärer, limma hjärnskålen höger lob med hilum till hållaren och skiva från periferin. För att få tvärsnittsföracinarartärer, justera hilum av höger lob med champagnekorken. - Använd en vibratome utrustad med ett nytt rakblad för att skära lungloben i 200 μm tjocka skivor (hastighet: 12 = 1,2 mm/sek; frekvens: 100; amplitud: 1,0). Samla PCLS i vibratomebassängen fylld med 4 °C kall HEPES-Ringer-buffert.
Obs: Kylning av HEPES-Ringer rekommenderas men ouppmäsentligt. - För avlägsnande av agaros, överför organsektionerna till en glasbägare fylld med ca 200 ml 37 °C varm MEM. Lägg bägaren i värmeskåpet där ett rör som är sammanfogat med en flaska med normoxisk gasblandning sätts in. Bubbla MEM med den normoxiska gasen så att lungsektionerna långsamt rör sig i mediet. Efter ca 2 timmar kommer "agarose plack" som fyller luftrummet att avlägsnas från lungvävnaden. Detta kan kännas igen av det faktum att sektionerna inte längre simmar på toppen av mediet utan bosätter sig på botten av bägaren.
4. Videomorfometrisk analys av intrapulmonella artärer i PCLS
- För videomorfetrisk analys av intra-pulmonell artärer, överför en PCLS till genomflödes superfusion kammaren fylld med 1,2 ml normoxic gasas MEM. Fixera PCLS längst ner i kammaren med nylonsträngar anslutna till en platinaring (ytter/innerdiameter: 14/10 mm).
- Skanna PCLS mikroskopiskt efter tvärsnittsartärer med innerdiametrar mellan 20-100 μm.
Obs: Artärernas lumen är fodrad av platta endotelceller. De omgivande släta musklerna kan identifieras i faskontrastbilden som en "mörk ring" som omger lumen (se faskontrastbilder i figur 2). Däremot kan luftvägarna identifieras genom det ursprungligen pseudostifierade kolumnära epitelet som passerar på väg till pleuraytan till ett enkelt kolumnärt epitel följt av ett enkelt kuboidt epitel.- Mät innerdiametern i början av varje experiment.
Obs: I lätt snedskurna kärl kan rörstrukturens sanna innerdiameter bestämmas i 90° vinkel mot lumens längsta axel. Stora preacinära artärer med innerdiametrar >40 μm löper intill bronkier och bronkioler. Små intraacinära artärer med innerdiameter <40 μm finns vid grenar av alveolar septa bredvid alveolae och alveolära kanaler6.
- Mät innerdiametern i början av varje experiment.
- Experimentell design:
- Börja varje experiment med en "anpassningsfas" där kammaren är perfused med normoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 0,7 ml/min; 10 min). Testa sedan kärlets livskraft: Analysera artärens kontraktilitet genom att tillsats av 12 μl 10 μM U46619 (slutlig koncentration 0,1 μM; 10 min; inget flöde).
Anm.: För detta arbete definieras ett kärl som livskraftigt när luminalområdet minskas med minst 30 % (för mätmetod se nedan). - Efter att ha tvättat ut läkemedlet med normoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 6 ml/min; 10 min) vidgas artären genom applicering av 3 μl 10 mM nipruss (slutlig koncentration 25 μM; 10 min; inget flöde).
- Återigen, ta bort läkemedlet med en 10 minuters tvätt med normoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 6 ml/min) följt av 10 min vid ett flöde av 0,7 ml/min.
- Inducera hypoxisk lungvasokonstriktion genom inkubation av PCLS med hypoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 0, 7 ml/min; 40 min). Genom ett extra rörsystem matar du in hypoxisk gasblandning i perfusionskammarens luftutrymme.
- Ta bort det hypoxiska mediet med en 20 minuters tvätt med normoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 6 ml/min).
- I slutet av varje experiment, tillsätt 1,2 μl 10 μM U46619 (slutlig koncentration 0,01 μM; 20 min; inget flöde) till perfusionskammaren för att inducera vasokonstriktions.
Obs: Detta sista steg gör det möjligt att avgöra om en förändring av det hypoxiska svaret (t.ex. framkallad genom samtidig applicering av ett läkemedel i hypoxisk fas eller observerad i en PCLS som framställs av en knockoutmusstam) är specifik för hypoxiinducerad förträngning eller om det återspeglar en allmän inverkan på kontraktiliteten. Koncentrationen på 0,01 μM motsvarar EC50-värdet U46619 som uppskattades i tidigare koncentrationskontraktionsmätningar (ej offentliggjorda). - Använd en annan PCLS för att utföra kontrollexperiment med normoxiska istället för hypoxisk gasad MEM och normoxisk gasblandning i perfusionskammarens luftutrymme.
- Börja varje experiment med en "anpassningsfas" där kammaren är perfused med normoxiskt gasat medium (flödeshastighet: 0,7 ml/min; 10 min). Testa sedan kärlets livskraft: Analysera artärens kontraktilitet genom att tillsats av 12 μl 10 μM U46619 (slutlig koncentration 0,1 μM; 10 min; inget flöde).
5. Analys av vasoreaktivitet och grafisk presentation
- Använd lämplig programvara ta bilder från den tvärsnittsade artären varje minut under hela experimentet.
- Med hjälp av lämplig programvara utvärderas förändringar av kärlens luminala område genom att fodra de inre gränserna för hand med helskärmsbilder.
Det räcker att analysera varannan bild för att få tydliga grafer. Men när ett tillstånd i den genomflödes superfusionskammaren ändras till ett annat, analysera varje bild. De återstående bilderna fungerar som back-up om ett fotografi inte kan analyseras.
Tyvärr måste detta tidskrävande steg göras för hand och inte genom lämpliga program eftersom ibland blodkroppar är fästa vid kärlväggen som rör sig under mätningen eller det är inte ett perfekt tvärsnitt av kärlet utan ett tangentiellt avsnitt där en tillförlitlig lokalisering av de inre gränserna endast kan göras under visuell kontroll. - Definiera det värde som erhålls för kärllumens yta i början av försöket som 100 % och uttryck vasokonstrikt eller dilatation som relativ minskning eller ökning av detta värde.
- För varje experiment plot det relativa luminalområdet mot tiden med hjälp av lämplig programvara.
- För att sammanfatta flera experiment, rita medelvärdet för de relativa luminala områdena +/- standardfelet för medelvärdet (SEM) mot tiden.
Anm.: För en tydlig presentation av effekterna av olika ämnen på hypoxi- eller U46619-inducerad lungvasokonstriktionstrering eller av hypoxiskt svar av knockoutmusstammar kan den inledande fasen av försöken, där kärlets livskraft testas, utelämnas från diagrammet. I detta fall definieras de värden som erhålls i början av exponeringen för reducerat syre som 100%.
6. Statistisk analys
- Analysera skillnader mellan experimentella grupper med Kruskal-Wallis- och Mann-Whitney-testet, där p≤0,05 anses vara signifikant och p≤0,01 mycket signifikant.
Anmärkning: För ytterligare information om förberedelse och operativ användning av PCLS se även20,21.
Representative Results
I figur 1 ges resultaten av mätningen av HPV av en stor preacinär artär och i figur 2 av små intraacinära artärer. I faskontrastbilderna (figurerna 1A och 2A) blir det tydligt att det är möjligt att diskriminera dessa 2 klasser av artärer baserat på deras placering i lungvävnaden: Preacinära artärer löper i nära grannskap till bronkier och bronkioli (Figur 1A), medan de intraacinära artärerna ligger vid grenen av alveolar septa och omgiven av alveolae (Figur 2A). Med lite övning är det möjligt att se förändringarna i luminalområdet som svar på U46619 på faskontrastbilderna (figurerna 1A och 2A). Hypoxisk lungvasokonstriktionsfunktion är dock ofta inte så uttalad och blir tydlig först efter fullständig utvärdering av förändringarna i de luminala områdena (figurerna 1B, 1C, 2B och, 2C). Av didaktisk anledning har vi gett ett exempel på en pre-acinar gatan som visar en ovanligt uttalad vasoconstriction. I genomsnitt resulterar HPV i en 20-30% minskning av luminalområdet.
I figur 2 visas inspelningar av små intraacinära artärer inkuberade med hypoxiskt gasat medium med eller utan 50 μM pinacidil (en icke-elektrisk öppnare av mitokondriella ATP-känsliga kaliumkanaler) och läkemedlets hämmande effekt blir tydligt synlig. Den sista delen av experimentet visar selektiviteten av läkemedlets verkan på HPV: Vasoconstriction inducerad av trombinanalogen U46619 ändras inte genom tillsats av pinacidil. I själva tiden går kurvan för artären som exponeras pinacidil tydligt lägre än de andra två, men omfattningen av minskningen av luminalområdet med enbart U46619 är jämförbar. I det här fallet var det den ofullständiga återgången av HPV som orsakar skillnaden mellan kurvorna. I detta diagram ingår också en artär som utsätts för normoxiskt gasat medium som ytterligare kontroll. Under detta tillstånd kan inga förändringar av luminalområdet upptäckas.
I figur 3 visas data från hela serien mätningar om pinacidils inverkan på HPV. Som jämförelse av de två grupperna för statistiska skillnader analyserades datauppsättningarna för de angivna tidpunkterna med Kruskal-Wallis- och Mann-Whitney-testet. HPV avskaffades tydligt i närvaro av pinacidil medan U46619-inducerad sammandragning var oförändrad.
Alternativt är det möjligt att identifiera skillnader mellan grupper i jämförelse mellan området under kurvan enligt beskrivningen i Müller-Redetzky m.fl. 22 (på 22)
Figur 1. Mätning av HPV av en stor preacinar artär. A)Faskontrastbilder av en tvärsnittsförinfattad preacinärartär a) som löper i närheten av en tvärsnittsbronchus (B). Bilderna är tagna vid de tidpunkter som anges i( B) efter cirklar: i början av mätningen (a), i slutet av behandlingen med U46619 (b), i slutet av exponeringen för Nipruss (c), efter 30 eller 40 min i hypoxiskt gasat medium (d, e), efter tvättning med normoxiskt gasat medium (f) och efter den slutliga appliceringen av U46619 (g). I diagrammet (B) ritas förändringar av luminalområdet mot tiden medan luminalområdet i början av försöket definieras som 100% och vasokonstriktions/-dilatation anges som relativa värden. I detta fall inducerar hypoxi en 60% minskning av luminalområdet. c)För en tydligare presentation av det hypoxiska svaret ingår inte den inledande fasen av det experiment där vasoreaktiviteten testades, utan det värde som erhålls omedelbart innan exponering för reducerat syre fastställs till 100 % (se även figur 2). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Inverkan av pinacidil (en icke-elektrisk öppnare av mitokondriell ATP-känsliga kaliumkanaler; mitoKATP) på HPV av små intraacinära artärer. a)Intraacinära artärer a) är belägna vid grenen av alveolär septa. Alv = alveolus. Sekvensen av de individuella villkor som tillämpas i dessa experiment anges i diagrammets rubrik (B). Hypoxisk exponering utförs i närvaro eller frånvaro av 50 μM pinacidil. Kontrollinkubationer görs med normoxiskt gasat medium. Bilder som visas i( A) är tagna i början av mätningen (a, a', a"), i slutet av behandlingen med U46619 (b, b', b%quot), efter 30 eller 40 min i hypoxiskt eller normoxiskt gasat medium (d, d', d"; e, e', e"), efter tvättning med normoxiskt gasat medium (f, f', f") och efter den slutliga tillämpningen av U46619 (g, g', g). För en tydligare presentation av svaret på normoxia/hypoxi/hypoxi+pinacidil fastställs de värden som erhålls omedelbart före exponering för normoxiskt/hypoxiskt gasat medium till 100 % (C). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Hämning av HPV genom pinacidil. Inspelningarna av små intraacinära artärer som utsätts för hypoxiskt gasat medium med eller utan 50 μM pinacidil sammanfattas och presenteras som ± SEM. Iages de fullständiga inspelningarna iBde relativa uppgifterna i förhållande till värdet i början av hypoxinkubationen. Ingen vasoreaktivitet kan detekteras i PCLS som utsätts för hypoxic-gassed medium som innehåller pinacidil. Vasoconstriction inducerad av U46619 påverkas inte av läkemedlet. "n" inom parentes avser antalet artärer/antal djur från vilka PCLS tillverkades. Med andra ord beskriver det första numret antalet analyserade lungsektioner och det andra numret ger antalet möss från vilka dessa sektioner utarbetades. Vid den angivna tidpunkten testas skillnaderna mellan båda grupperna för betydelse. n.s.: inte signifikant, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Schematisk översikt över metoden. Kort, möss dödas av livmoderhalscancer förskjutning. Efter öppnandet av bröstet fylls lungorna med låg smältpunktsagarosa och efter nedkylning skärs de i 200 μm tjocka precisionsskurna lungskivor (PCLS). Efter att agarosen avlägsnats vid 37 °C överförs en PCLS till den genomflödesflaska i vilken den utsätts för normoxiskt medium eller medium som gasas med 1% O2. Vasoreaktivitet registreras som förändringar i luminalområdet. Klicka här om du vill visa större bild.
Discussion
Den isolerade ventilerade och perfunderade muslungan är en utmärkt modell för analys av det fysiologiska svaret från lungvaskulära systemet på förändringar i syretillförseln och tillåter bland annat kontinuerlig mätning av lungartärtrycket1. Denna modell tillåter dock inte identifiering och analys av de kärlsegment som visar det starkaste svaret på hypoxi. Detta är fördelen med vår videomorfometriska analys av PCLS som underlättar mätningen av HPV av enskilda artärer med innerdiametrar på 20-100 μm. PCLS representerar en attraktiv in vitro-modell eftersom de liknar det organ från vilket de är beredda. I motsats till cellkultursystem finns alla celltyper i sin ursprungliga vävnadsmatriskonfiguration. Dessutom är en lunga tillräcklig för beredning av många PCLS, så att åtminstone delvis experiment kan standardiseras med hjälp av avsnitt från samma mus. Enligt 3R-konceptet (minskning, förfining och ersättning av laboratoriedjur i biovetenskaperna) i Russell och Burch23 argumenterar detta faktum också för användningen av PCLS.
Man måste dock komma ihåg att vävnaden skadas genom skärning med en vibratome och longitudinell signalering till exempel via endotelcellerna som postuleras av Kübler et al. 14 är inte längre möjligt.
Ursprungligen tillämpades PCLS främst för biokemiska, farmakologiska och toxikologiska studier, men under tiden används de också för mätning av bronkial kontraktilitet, mucociliary funktion och vaskulär svar (för recensioner se Sanderson20 och Davies21). Hålls et al. har utfört en studie där de jämförde modellerna av isolerad perfused och ventilerad mus lunga och PCLS24. De fann genom analys av svaren från luftvägarna och lungkärl på en mängd endogena medlare att viktiga egenskaper hos hela lungan bibehölls i PCLS.
I PCLS, hypoxic villkor fastställs inte via luftvägarna som i intakta lungan men genom inkubation av lungsektionen i hypoxic-gassed medium. Vi har analyserat syret partiellt tryck (pO2)av medium förgasat med 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2 och med 21% O2,5,3% CO2,73,7% N2,respektive med hjälp av en blodgasanalysator. Omedelbart innan du matar in den i perfusionskammaren var pO2 av hypoxic gassed MEM 40 mmHg och den av det normoxiska gasade mediet 160 mmHg6. I den intakta lungan framkallas HPV när alveolar pO2 sjunker under 50 mmHg25, en situation som uppenbarligen kan efterliknas genom applicering av hypoxic-gassed medium. Våra data om omfattningen av HPV matchar väl till resultat som erhållits med ett annat experimentellt tillvägagångssätt. Yamaguchi et al. har applicerat isolerade råttlungor för att undersöka mikrovessuler med diametern 20-30 μm genom konfokal laserskanningsluminglassmikroskopi i realtid i kombination med en högkänslig kamera med en bildförstärkare10. De observerade en genomsnittlig minskning av diametern på 2,7 μm efter exponering av lungorna för hypoxi. Man kan beräkna att en 20% minskning av luminalområdet som vi mäter det i vårt system motsvarar cirka 15% minskning av diametern.
I våra experiment har vi klassificerat artärerna som pre- respektive intraacinära kärl med innerdiametrar på 40-100 μm respektive 20-40 μm. Hos människor sker övergången från muskulösa till ickemuskulära artärer i diameterområdet 70-100 μm. Hos möss finns släta muskelceller ner till en yttre diameter på 20 μm26. Av denna anledning är det inte möjligt att analysera artärer med diametrar under 20 μm eftersom de inte kan identifieras baserat på faskontrastbilden. I andra änden av skalan är kärl med diametrar över 100 μm knappast att hitta i PCLS och ofta avskalade från den omgivande vävnaden.
Egentligen diskuteras ett antal molekylära kandidater som molekylära syresensorer eller som komponent i signalkaskaden vilket resulterar i HPV (för en översyn se Sylvester et al. 4). När lämpliga knockoutmöss finns tillgängliga kan videomorfmetri användas för analys av vasoreaktivitet hos pre- och intraacinära artärer jämfört med vilda djur. PCLS har dock också använts för andra problem: Faro et al. använde dem för att karakterisera utvecklingen av endotelberoende utvidgning i lunganefter födseln 29 och PCLS beredda från marsvin som exponerats för rök eller luft dagligen i 2 veckor användes för att visa cigarettrökens inverkan på vasoreaktivitet via induktion av endoteldysfunktion30.
Kritiska steg i protokollet
I våra experiment klassificerade vi artärerna som preacinar (innerdiametrar på 40-100 μm) och intraacinar (innerdiametrar på 20-40 μm). Speciellt för beredning av lungsektioner som bör användas för analys av större kärl är det viktigt att tillsätta natriumnityr på perfusionsbufferten. Detta läkemedel förhindrar sammandragning av kärlen under provberedningen och därmed deras rip off från den omgivande vävnaden vilket leder till ofullständig vasodilatation. Natriumnityr i perfusionsbufferten är inte så viktigt för beredningen av lungsektionen som bör användas för analys av små artärer eftersom de är starkt förankrade i den alveolära septan.
Alla experiment bör startas med inkubationer där artärernas reaktivitet testas. Sällan fick vi lungpreparat där inget svar från fartyg till entreprenörer eller dilatatorer kunde upptäckas. Vi vet inte orsaken till detta: Kan vara att volymen av agaros som fylldes i lungorna var för stor eller för låg så att skärning av organet i PCLS inte var optimal. Alternativt är det tänkbart att agarosen kyldes ner för snabbt under instillationsproceduren vilket resulterade i skadlig saxstress. Om ingen livskraftig artär kan upptäckas i en enskild PCLS måste avsnittet kasseras och ersättas av en annan.
Beslutet om en artärs livskraft fattades baserat på svaret på U46619. Applicering av U46619 vid en koncentration av 0,1 μM inducerar en vasokonstriktions som - efter viss träning - är synlig direkt i bildsekvensen på skärmen. Eftersom det finns vissa avvikelser i vasoreaktiviteten undersöker vi effekten av ett läkemedel på HPV genom att mäta vasoresponsen i lungsektioner som exponeras för läkemedlet eller enbart för mediet i sin tur.
HPV av en enskild artär är ofta knappast detekterbar i mikroskopet, och i genomsnitt resulterar det i en minskning av luminalområdet på ca 20-30%. Små förändringar i diametern på en artär har dock en distinkt ingång på flödesmotståndet. Enligt ekvationen "R = 1/r4" med R=motstånd och r=radie är flödesmotståndet omvänt proportionellt mot radiens fjärde effekt. Låt mig ge ett exempel: En "idealisk artär" som uppvisar ett cirkulärt tvärsnitt med en diameter på 40 μm (r=20 μm) har en luminal yta på ca 1 260 μm2. När luminalområdet minskas med 20%, kan vi beräkna att kärlets diameter minskas med 10,5% till 35,8 μm (r =17,9 μm). Enligt ekvationen ovan skulle flödesmotståndet för detta fartyg öka från 6,25 x 10-6 till 9,71 x 10-6 som är med cirka 55%. Vid en minskning av luminalområdet med 30% skulle radien minska med cirka 16%, men flödesmotståndet skulle öka med cirka 100%. Även om dessa beräkningar är en överimplementering där ett laminärt blodflöde och en kärlform av ett styvt rör antas det vara suggestivt av effekten av redan mindre förändringar av diametern på flödesbeständigheten.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning sponsras av Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
| Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
| Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
| Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
| Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
| Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
| Various scissors and forceps | |||
| Sewing cotton | |||
| 2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
| Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
| Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
| Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
| NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
| KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
| MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
| CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
| Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
| Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
| Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
| Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
| 70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
| Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
| U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
| Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
| Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
| SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |
References
- Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).
- Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor. J. Physiol. 536, 211-224 (2001).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).
- Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. Hypoxic pulmonary vasoconstriction. Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).
- Schumacker, P. T. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).
- Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).
- Paddenberg, R., et al. Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries. Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).
- Wang, L., Yin, J., et al. Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction. J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).
- Archer, S. L., Huang, J. M., et al. Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and. 78, 431-442 (1996).
- Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis. Circ. Res. 82, 722-728 (1998).
- Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia. Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).
- Glazier, J. B., Murray, J. F. Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion). J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).
- Bhattacharya, J., Staub, N. C. Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung. Science. 210, 327-328 (1980).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs. J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).
- Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).
- Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium. J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).
- Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung. Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Davies, J. Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook. , John Wiley & Sons. 57-68 (2012).
- Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice). PLoS One. 7 (5), (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Universities Federation for Animal Welfare. , Wheathampstaed, UK. (1959).
- Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. Characterization of airway and vascular responses in murine lungs. Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).
- Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis. Thieme Verlag. , 198-19 (2009).
- Will, J. The Pulmonary Circulation. in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).
- Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice. Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).
- Wright, J. L., Churg, A. Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices. J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).
