アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分析の需要に対応します。
アグロインフィルトレーションとPVXのアグロパネシスは、植物の候補遺伝子の機能解析のための2つの効率的な一過性発現アッセイです。アグロインフィルグに最も一般的に使用される薬剤は、多くの二分植物種の病原体であるアグロバクテリウム・トゥメファシエンスです。これは、多くの植物種にアグロインフィルトレーションを適用できることを意味します。ここでは、これらの方法をジャガイモ(ソラナム結節)、その関連野生の塊茎を含むソラナム種(ソラナムセクションペトタ)およびモデル植物ニコティアナベンタミナにこれらの方法を適用する際に、我々のプロトコルと期待される結果を提示する。単一遺伝子の機能解析に加えて、抵抗性(R)またはアビロリジェンス(Avr)遺伝子、農浸浸法アッセイは、単にRとAvrトランスジーンを同じ細胞に送達することによって、特定の宿主病原体相互作用に関連するR-AVR相互作用を再現するのに非常に適している。しかし、いくつかの植物遺伝子型は、例えばいくつかのジャガイモの遺伝子型について観察されるように、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答を上げることができる。アグロインフィルトレーションと比較して、PVXアグロプレシフィシンによるAVR活性の検出は、より敏感で、機能的なスクリーンでより高いスループットであり、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答に対する感受性が低い。しかし、PVXに対する非特異的な防御が起こり、ウイルスによる極度の抵抗による応答を逃す危険性があります。このような制限にもかかわらず、我々の経験では、アグロインフィルトレーションとPVXの農業感染は、お互いの結果を確認するために同時に使用することができる適切かつ補完的なアッセイの両方です。
エフェクトロミクスは、近年、作物植物における耐性(R)遺伝子を同定する強力なツールとして、高スループット機能ゲノミクスアプローチが出現し、病原体のアビラレンス(Avr)遺伝子と一致する。R遺伝子を使用してより時間のかかる安定した変換とは対照的に、エフェトロミクス戦略は病原体遺伝子配列の一過性アッセイに基づいています。
ゲノミクス時代以降、植物病原体のゲノムは広く探求されてきました。例えば、最も壊滅的な植物病原体を含むoomycetesの場合、大規模な配列が生成され、植物5-10との相互作用の間に役割を果たす遺伝子について分析されている。病原体タンパク質の1つのクラスは、感染を促進するために宿主細胞の構造および機能を操作するエフェクターを表す(病原性因子)または防御応答(アビルール因子)11-13を誘発する。R遺伝子を含む植物細胞におけるAvr遺伝子の発現は、通常、過敏細胞死反応(HR)14,15をもたらす。RおよびAvr遺伝子のプランタ発現では、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス-ベースの一過性変換(アグロインフィルトレーション)16などの一過性発現系を用いて達成することができる。この一過性の変換は、ウイルス発現系(agro感染)17,18と組み合わせて適用することもできる。
アグロインフィルトレーションの場合、最も一般的に使用される薬剤は、ジコット植物の広範な宿主病原体である A.tumefaciens である。 タメファシエンス には、腫瘍誘発(Ti)プラスミドが含まれている。TiプラスミドからのDNA(T-DNA)の転写は、細菌の病原性機械が活性化された後に植物細胞に移入する。これは、傷ついた植物細胞において、わずかに酸性環境19で放出される低分子量フェノール化合物および単糖体によって引き起こされ得る。病原性遺伝子は、主要な静脈によって定義された葉パネルへの アグロバクテリウム 懸濁液の浸潤後に活性化される。そして、葉パネル内の植物細胞を形質転換し、T-DNA領域に含まれるトランスジーンを発現させます。
アグロ感染は、植物細胞へのウイルスの転座を媒介する創傷接種 性アグロバクテリウムに基づいています。その後、ウイルスはアグ ロバクテリウムの不在下で、隣接する植物組織にさらに広がる。農菌感染のために、いくつかの植物ウイルスを使用することができます。RNAウイルスは、感染した植物の非常に高いレベルに増殖することができるので、遺伝子発現のための理想的なベクターです。植物RNAウイルスの中でも、 ポテトウイルス X(PVX)は、エフェロミクススクリーンに広く使用されています。挿入遺伝子の機能試験を容易にするために、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターおよびノパリン合成酵素ターミネーターによって横たわるPVXゲノムを含むバイナリベクターを 、A.トゥメファシエンス20のT-DNAにクローン化した。T-DNAが植物細胞に移された後、T-DNAに含まれるPVXゲノムは、35Sプロモーターから転写される。その後、ウイルス粒子は感染した植物に全身的に広がり、その結果、挿入された遺伝子の発現が生じる。この方法は 、アグロバクテリウム とPVXの両方に基づいて、PVXのアグロパレンス感染と呼ばれています。
ここでは、農浸潤とPVXの両方の農業感染アッセイの例を示します。宿主植物として、エフェトロミクスのアプローチが開拓され、成功した3,4を証明したポテト胚芽(ソラナムセクションペトータ)を使用しています。我々はまた、ソラナス植物14,21,22のモデル植物として有名なニコチアナベンタミアナを使用しています。
農浸潤や農菌のような一過性のアッセイは、現代の分子植物病理研究に不可欠な効率的な方法です。いくつかの制限にもかかわらず、これらの方法は、プラントにおける効率的で堅牢な高スループット機能分析の需要を満たしています。
このアグロインフィルトレーションシステムは、植物種の範囲で広く使用されている機能アッセイである。アグロインフィルトレーションは、相互作用タンパク質の同時発現を伴う同じ細胞へのいくつかの遺伝子の送達を促進する。これは、R−AVR関係を再現する場合に、一致するR遺伝子を発現する株を有するAvr遺伝子を発現するアグロバクテリウム株をコインフィルトすることにより有利である。また、既知のR-AVR対に対して、そのようなコインフィルトは正の制御として使用することができる。このような制御を含む重要なのは、一部の植物遺伝子型において、応答を検出するための閾値を下回る変換効率が得られるためである。陰性コントロールを含む、例えば遺伝子挿入を伴わないベクターを含むアグロバクテリウム株は、ある種の植物遺伝子型がアグロバクテリウムに対する非特異的防御応答を上げるかどうかを判断することも不可欠である。この特徴は、ジャガイモの胚芽の特定の頻度で発生し、すべてのソラナム種は、このアグロバクテリウムベースの発現系に適しているわけではありません。一般的に、アグロインフィルトロートアッセイは、N.ベンタミアナおよびほとんどのジャガイモ遺伝子型で非常にうまく機能します。エフェクロミクスに加えて、遺伝子導入からのタンパク質の産生や植物細胞における共焦点顕微鏡によるタンパク質の局在化など、農浸浸法に関する様々な潜在的な用途があります。
PVXの農業感染は非常に敏感なスクリーニングシステムであり、典型的にはハイスループットのスクリーニングのためにより適している。 アグロバクテリウム は現在、局所的にしか存在しないため、PVXウイルスがトランスジーンのさらなる広がりを引き継ぐので、この細菌に対する非特異的な反応は今やあまり不安ではない。しかし、植物はPVXに対して耐性があり、または極度の抵抗性(ER)応答を取り付け、その場合は農菌感染法は適さない。PVXの農業感染方法のもう一つの制限は、目的の遺伝子の挿入サイズである。観察された表現型の応答は、創傷を取り巻く激しい黒壊死から接種場所付近のかすかな壊死までさまざまである。 N.ベンタミナ 種と ソラナム 種の両方で、PVXの農業感染は、農浸浸よりも敏感であると認識されている。
多様な試験された植物遺伝子型の遺伝的背景には、いくつかの制限がある(上記参照)ことを考慮に入れ、我々は一般的にPVXの農業感染および農浸濾過によって同様の結論を得る。これらの結果は、タンパク質浸潤29 およびELISA3などの他のアッセイで得られるのと同様にも同等である。両システムの長所と限界を考慮して、両方法を使用して互いを補完するか、独立した結果を確認することをお勧めします。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ワーゲニンゲン大学基金(WUF)、中国大学院生奨学金協議会プログラム、NWO-VIDI助成金12378によって部分的に支援されています。
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |