Summary
Два метода для выделения капель сотовой липидов от 1) дрожжевые клетки и 2) человека плаценты представлены. Центральное обеих процедур центрифугирования в градиенте плотности, где в результате плавающий слой, содержащий капельки могут быть легко визуализированы на глаз, экстрагировали и количественно с помощью Вестерн-блот-анализа для чистоты.
Abstract
Липидных капель динамические органеллы, которые можно найти в большинстве эукариотических и некоторых прокариотических клеток. Конструктивно капли состоят из сердцевины нейтральных липидов, окруженных фосфолипидного монослоя. Одним из наиболее полезных методов в определении роли клеточных капель был протеомических идентификация связанные белки, которые могут быть изолированы вместе с капель. Здесь два метода описаны изолировать липидные капли и их связанные белки из двух широких эукариот: дрожжей деления и плацентарные ворсинчатые клеток человека. Хотя оба метода имеют различия, основным методом - градиент плотности центрифугирования - является общим для обоих препаратов. Это показывает широкую применимость представленных методов изоляции капель.
В первом протоколе, дрожжевые клетки преобразуются в сферопластов ферментативным расщеплением их клеточных стенок. Полученные сферопласты то Гентлы лизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Ficoll добавляется в лизате, чтобы обеспечить градиент плотности, и полученную смесь центрифугируют в три раза. После первого спина, капли липидов локализованы к белому плавающий слой из центрифужные пробирки вместе с эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране и вакуоли. Два последующих спины используются для удаления этих трех других органелл. Результатом является слой, который имеет только капли и связанные белки.
Во второй схеме, плацентарные ворсинчатые клетки выделяют из человеческой плаценты срок ферментативным расщеплением трипсином и ДНКазой I. Клетки гомогенизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Низкая скорость и средней скорости центрифугирования шаги используются для удаления неразрушенных клеток, продукты распада клеток, ядер и митохондрий. Сахароза добавляется в гомогенате, чтобы обеспечить градиент плотности и центрифугируют, чтобы отделить липидных капель с другой CELLULAг фракции.
Чистоту липидных капелек в обоих протоколов подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа. Капли фракции из обоих Preps подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Introduction
Капли Сотовый липидов являются динамическими органеллы, которые служат несколько функций в клетках. Они концентраторы для хранения нейтральных липидов, которые могут быть конвертированы в энергию или используемых для синтеза фосфолипидов. Капли играют центральную роль в физиологических и патологических состояний, включая атеросклероз, ожирение и связанные с метаболическими заболеваниями, а также инфекционные заболевания 1,2. Кроме того, они интригуют источники биодизельного топлива.
Много информации на клеточном роли липидных капель, была получена из протеомного и липидомных анализа капель очищенных от широкомасштабных организмов 3. Эти организмы включили бактерий 4,5, дрожжи 6-11, растения 12,13, нематоды 14, и летит 15,16. Учитывая интерес в роли липидных капелек в метаболических заболеваний человека, капли были также выделены из культивируемых клеток животного иНимал тканей. Культивируемые клеточные линии были включены 3T3-L1 адипоцитах 17, яичника китайского хомячка (CHO) клетки K2 18, человеческие hepatocyes 19,20 и эпителиальные клеточные линии 21. Животных тканей, из которого капли были выделены включали мыши скелетных мышц, печени 22 23 и молочных желез 23. Как упоминалось выше, цель большинстве исследований изоляции капель является выполнение протеомного анализа на связанных факторов и липидомных анализа на нейтральный и фосфолипидов.
Поскольку нейтральные липиды - самая многочисленная составляющая липидных капель - менее плотная, чем большинство других сотовых материалов, изоляция капель традиционно выполняется с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод является центральным обоих Preps представленных здесь. Предыдущие методы 6,24 объединены и изменены в визуального представления изоляции капель из культивируемых деления дрожжевых клетоки noncultured человеческие клетки получены из плацентарной ткани. Цель состоит в том, чтобы показать широкой применимости этого метода, выбирая два совершенно разных типов клеток в качестве исходных точек для выделения капель. Эта техника должна быть полезной для тех, кто желает, чтобы изолировать капли от большинства организмов.
Протокол 1 описывается изоляция липидных капель с делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces РотЬе, который был использован в качестве модели для наблюдения образование капель при эукариотической деления клеток 25. Подающая надежды дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE широко используется в качестве модельного организма для изучения липидного капель биологию. Протокол 1 применим как организмов и различия в подготовке выделены.
Протокол 2 описывается изоляция липидные капли от плацентарных ворсинок клеток, которые в свою очередь полученного из человеческой плаценты срок.Коллекция срочных плаценты дает уникальную возможность безопасно и этично получить 200-250 г легкодоступной ткани человека 26, который содержит значительное количество липидных капель. Это в отличие от большинства изоляции липидов капли работы в высших эукариот, где капельки происходят из культивируемых клеток. В этих исследованиях, жирные кислоты часто добавляют в культуры для содействия синтез нейтральных липидов и, следовательно, роста капель. Это в отличие от работы здесь, где липидные капли образуются при нативных условиях в плацентарной ткани.
В чистоты липида фракций капель определяются с использованием органелл маркерные антитела, с помощью анализа вестерн-блоттинга. Эти два протокола даст липидов капель фракций, которые подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция липидные капли от (деления) клеток дрожжей
Выделение капель от популярного модельного организма почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE почти идентичен следующему протоколу 6. Различия в подготовке отмечены.
1. Растущие клетки дрожжей
- Подготовьте СМИ. Объедините 36 г YE5S порошка на литр дН 2 O в стеклянных бутылках или колбы с культурой. Будут необходимы около 2 л массовой информации. Автоклав СМИ при 121 ° С в течение 20 мин. Разрешить СМИ остыть до комнатной температуры. Для S. CEREVISIAE заменить YE5S с YPD.
- Поместите 10-20 мл охлажденных YE5S СМИ в колбу культуры на 250 мл, используя стерильные методы. Инокуляции среды с небольшим количеством дрожжевых клеток из чашки с агаром с использованием стерильного деревянную палочку или его эквивалент. Пусть клетки растут до желаемой оптической плотности при 30 ° С Измерьте оптическую плотность придлина волны 595 нм с использованием спектрофотометра.
- Положите оставшиеся средства массовой информации в 2.8 л колбах. Используйте не более 1 л СМИ за 2,8 л колбу для обеспечения надлежащего перемешивания в процессе роста клеток в дрожащей инкубатора. Конечный выход влажных клеток должно быть около 10 г, чтобы иметь возможность приобрести достаточно липидные капли для протеомики и липидомных анализа.
- Введем клетки от шага 1.2 в 2.8 л колб, каждый из которых 1 л СМИ, которые были подготовлены на стадии 1.1.
- Расти клетки к желаемой плотности при 30 ° С
- Убедитесь в том, что клетки имеют липидные капли. Резервный 1 мл клеток. Измерение оптической плотности (OD) образца. Добавить 0,1 мл 100 мМ запаса BODIPY 493/503 в этаноле на ОД клеток в образце. Поместите 3 мкл образца между предметное стекло и покровным стеклом. Визуализация под флуоресцентным микроскопом с GFP фильтром (рис. 1А).
- Гранул клеток, начиная с шага 1.5 в 4 & #176; C при 3800 мкг в течение 10 мин. Работа в пакетном режиме в зависимости от мощности центрифужных пробирок.
- Вылейте СМИ YE5S и промыть клетки с буфером EMM + 600 мм сорбита. Сорбит обеспечивает осмотическое поддержку.
- Передача клеток в стерильную 50 мл центрифужную пробирку и осаждения клеток при 4 ° С при 2000 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант. Взвесьте влажные клетки. Ресуспендируют клеток в 2 мл (EMM + 600 мМ сорбита) буфера на грамм клеток.
2. Преобразование деления дрожжевых клеток в сферопластов и последующего лизиса
- Добавить 5 мг каждая из 1) дрожжи литическую фермента и 2) дрожжи лизиса ферменты из Trichoderma harzianum на грамм влажных клеток, которые были взвешены в шаге 1.9. Для S. CEREVISIAE увеличить эти ферменты с таким же количеством Zymolyase.
- Инкубируйте клетки при 30 ° С при осторожном встряхивании при 100 оборотах в минуту в течение 60 мин.
- Убедитесь в том, что сферопласты имеют липидный дрoplets. Повторяя шаг 1.6 (рис. 1В).
3. Плотность центрифугирования в градиенте
- Гранул сферопластов центрифугированием при 4 ° С при 2000 х г в течение 5 мин.
- Осторожно удалите супернатант, используя пластиковую передачи пипетки.
- Аккуратно ресуспендирования осаждали сферопластов ледяной 10 мМ Трис-HCl, 600 мМ сорбита и 200 мкМ ЭДТА. Имейте в виду, что сферопласты очень хрупкие.
- Гранул сферопластов снова с теми же настройками, как в пункте 3.1. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют Сферопласты с помощью пластиковой пипетки передачи в 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ EDTA в концентрации 2 мл / г клеток.
- Передача ресуспендировали сферопластов в стеклянный гомогенизатор и осторожно гомогенизируют на льду, 20-30 ударов с свободной одежде пестиком в стеклянном гомогенизаторе.
- Трансфер лизированных сферопластов в центрифужные пробирки и наложения с таким же В.О.Луме 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфере. Выберите количество центрифужные пробирки использовать таким образом, чтобы каждая трубка составляет около две трети.
- Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1,5 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
- Аккуратно перенести верхнюю плавающую белый слой (рис. 2а), в котором содержатся капельки, на новый центрифуге трубки (ы), используя либо пипетки или согнутую пипетки Пастера. Добавить достаточный объем 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфер для образца так, что оно заполняет примерно одну треть от центрифужную пробирку.
- Добавьте эквивалентный объем 8% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ EDTA буфера к верхней части образца (ов) в новой центрифужную пробирку (ов). После добавления этого буфера трубы должна быть около двух третей полных.
- Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (гOTOR замедления = 0).
- Аккуратно перенести верхнюю плавающую белый слой (рис. 2б), которое будет содержать капельки, на новый центрифуге трубки (ы), используя либо пипетки или согнутую пипетки Пастера. Добавить 600 мМ сорбита, 8% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфер для образца так, что оно заполняет примерно одну треть от центрифужную пробирку.
- Добавьте эквивалентный объем 250 мМ сорбитол, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА в верхней части образца (ов) в новой центрифужную пробирку (ов). После добавления этого буфера трубы должна быть около двух третей полных.
- Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
- Трансфер топ белый слой (рис. 2, в), который должен содержать только липидные капли и связанные белки, чтобы диализа, и Диализировать O / N в 10 мМ Трис-HCl и 200 мкМ ЭДТА буфере устранить Ficoll.
Плаценты были собраны от здоровых женщин с одноплодной беременности подвергались плановым кесарево сечение раздел до начала спонтанной родов в срок. Субъекты дали письменное информированное согласие для сбора их плаценты. Сбор, и последующее использование, из плаценты проводили с одобрения из Университета Теннесси и Университета Теннесси Высшей школы медицины в Ноксвилл Institutional Review Board (# 8757B и # 3338, соответственно).
1. Изоляция плацентарных ворсинчатых клетки человека
Часть 1 протокола является модификацией ранее опубликованного протокола по Петров и др. 26.
Подготовьте следующие решения:
- NaCl (1 л): растворить 9 г NaCl (M 58,4 г / моль) в дН 2 O с получением 1 л раствора. Фильтр стерилизуют (0,2; Мкм мембрана).
- Сбалансированный солевой раствор 10x Хэнка (10x HBSS) (1 л): 4 г КСl (М 74.5 г / моль); 0,6 г KH 2 PO 4 (М 136,086 г / моль); 80 г NaCl (М 58.44 г / моль); Na 2 HPO 4 (M 141,96 г / моль), 10 г D-глюкозы (M 180,16 г / моль). Растворите каждой из составляющих в дН 2 O, получая 1 л раствора. Фильтр стерилизуют (0,2 мкм мембраны).
- Фермент пищеварение буфер (0,6 мл): объединить 70 мл 10x HBSS с 3,3 мл 7,5% Na Biscarbonate, 17,5 мл 1 М HEPES, и 266,1 мл дН 2 O; фильтр стерилизуют (0,2 мкм мембрана). Хранить при 4 ° С.
- ДНКазы I: непосредственно перед использованием, добавить 5 мл стерильной 0,9% NaCl к ампуле ДНКазы. Держать на льду до использования или магазине при температуре -20 ° С.
- Подготовка плаценты для вскрытия
- Получение человеческой плаценты и процесс как можно ближе к времени доставки насколько это возможно. Использование герметичном сосуде, такие как охладитель для транспортировки через плаценту. Всегда будьте осторожны, когда рукалин человека биологические материалы.
- В биологическом капотом безопасности, передать через плаценту в стерильную автоклавируемый контейнер и тщательно мыть кровь из плаценты и мембран с использованием стерильного 0,9% NaCl (физиологический раствор) решение. Откажитесь кровавый физиологический раствор в 1 л стакан как жидких биологических отходов.
- Поместите плаценту на стерильной области, с гладкой поверхностью подшипника пуповину вверх. С острыми, тонкой точечных ножницами и пинцетом удалить плодных оболочек и пуповины.
- Переверните плаценту над тем, что материнская поверхность (шероховатая поверхность) вверх. Удалить лежащего на базальной пластинки ткани, около 3 мм от поверхности.
- Пройдя через плаценту
- Проанализируйте один семядолей в то время, избегая хорионический пластину. Сбор ворсинок ткани в 250 мл химический стакан с раствором.
- Промыть ткань несколько раз в отдельном химическом стакане с 0,9% NaCl, вращая щипцами, с использованием 1 л лабораторный стакан для жидких отходов.
- Трансфер один семядолей в то время, к 150 мм чашки Петри. Держите щипцами и очистить ткань с лезвием бритвы с судов на чашку Петри. Поместите Царапины ткани в отдельном стакане, содержащем 0,9% NaCl. Повторите эти действия для всех тканей штук.
- Трансфер небольшую часть ткани в клеточной диссоциации сито и промыть 0,9% раствором NaCl широко пока элюат не станет ясно. Повторите эти действия для всех тканей.
- После промывки Царапины ткани в клеточной диссоциации сито, слить его лишней жидкости и веса.
В этой точке ткань может храниться O / N в стерильной колбе Эрленмейера при 4 ° С в DMEM.
- Переваривание ферментом плацентарной ткани
- Подготовьте ткани пищеварения смесь: 100 мл предварительно нагретого буфера для разведения фермента, 1 мл ДНКазы I и 20 мл 2,5% 10x трипсина.
- Разделите ткани, передавая 60 г от общего собранной ткани (обычно около 250-300 г) в 500 мл стерильной колбе Эрленмейера.
- Сбор разложенных клетки
- После первого 45 мин диссоциации, установите пищеварения колбы при наклоне до ткань не оседает.
- Сбор супернатант, стараясь не собирать недиссоциированного ткани. Добавить равное количество HBSS в собранной супернатанта и передавать в стерильные 15 мл центрифужные пробирки. Для дополнительными порциями недиссоциированной ткани, повторите процедуру, начиная с шага 3.2 с недиссоциированной ткани.
- Центрифуга гомогената при 4 ° С при 1000 х г в течение 15 мин.
- Для каждой партии, после центрифугирования, аспирации супернатант, не нарушая гранул. Плацентарный ворсинчатые клетки преимущественно в белом части гранулы, перекрывающих эритроциты.
- Перенесите ворсинчатых клетки (белые части гранул) к улerile 50 мл коническую центрифужную пробирку и держать на льду.
- После сбора клеток из всех трех этапов пищеварения, Суспензию фильтруют с использованием 100 мкм фильтр Nylon клеток, вставленный в верхней части стерильной 50 мл коническую центрифужную пробирку. Если фильтрация суспензии клеток замедляется, поднять вверх на фильтре обратить вакуум внутри трубки.
- Центрифуга при 4 ° С при 1000 х г в течение 10 мин. Осторожно снимите супернатант, не нарушая гранул.
2. Гомогенизация плацентарных ворсинчатых клетки
- Перед началом процесса изоляции, готовят 50 мл гипотонического лизиса среды (HLM), содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА. Добавить ингибиторы протеазы в СВУ непосредственно перед использованием и держите среду на льду.
- В биологическом капотом безопасности, добавить 4-кратного объема осадка клеток ледяной СВУ к клеткам. Аккуратно и тщательно ресуспендирования клеток с помощью пипетки клетки вверхD-вниз с помощью 10 мл пипетки.
- Инкубируют суспендированных клеток на льду в течение 10 мин.
- Передача клеток в гомогенизаторе Даунса, который должен быть на льду. Медленно гомогенизации клеток путем применения 20-25 нежные удары с свободно облегающие пестиком гомогенизатора.
- Центрифуга клеточный лизат при 4 ° С при 3000 х г в течение 10 мин, чтобы удалить неразрушенные клетки, клеточного дебриса и ядер.
- Сбор супернатант и трансфер в SW28 трубки (или альтернативы, которые могут быть центрифугировали при 25000 х г). Центрифуга при 4 ° С при 25000 мкг в течение 20 мин для устранения митохондрии.
3. Изоляция липидные капли ультрацентрифугированием
- Подготовка 50 мл 100 мМ карбоната натрия (M 106 г / моль) буфер (рН 11,5) и 50 мл 60% сахарозы (вес / вес) раствора. Добавить ингибиторы протеазы в натриево-карбонатном буфере непосредственно перед использованием и хранить на льду.
- Сбор супернатант с шага 2.6 в 50 мл трубки центрифуги, отрегулируйтедо 20% сахарозы и передачи в нижней части ультрацентрифужную пробирку для роторе SW28, или его эквивалент. Наложение плотность регулировать супернатант с ~ 10 мл охлажденного льдом буфера 100 мМ карбоната натрия (рН 11,5) и 0,5-1 мл охлажденного льдом HLM, чтобы заполнить трубки.
- Центрифуга при 4 ° С в 130000 х г в течение 45 мин с использованием SW28 Бакет ротор. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
- Сбор плавающий слой, регулировать до 10% сахарозы и передачи в нижней части 13,2 мл ультрацентрифужную пробирку на роторе SW41Ti, или его эквивалент. Наложение плотность надосадочной жидкости регулируется с примерно 5 мл охлажденного льдом буфера 100 мМ карбоната натрия (рН 11,5) и 0,5 мл охлажденного льдом СВУ.
- Центрифуга при 4 ° С в 274 000 мкг в течение 60 мин с использованием SW41Ti размахивая ротор ведро. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0), чтобы минимизировать разрушение липидной капли слоя.
- Осторожно собрать верхний плавающий слой (рис. 2D), содержащийлипидные капли с пипеткой 1 мл и повторите шаг 3.4.
- Центрифуга при 4 ° С в 274 000 мкг в течение 30 мин с использованием SW41Ti размахивая ротор ведро. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
- Осторожно собрать верхнюю белого цвета с плавающей слой, содержащий липидов капли с изогнутой пипетки Пастера в трех 1,5 мл пробирки, содержащие 100 мкл СВУ.
Капли Характеризуя липидной фракции (протоколы 1 и 2)
Восстановление и чистота липидов капельной фракции может быть проверена путем вестерн-блота в сочетании с световой или электронной микроскопии. Кроме того, аликвоты после различных стадий центрифугирования могут быть собраны и сохранены для определения эффективности очистки. В Западной блоттинга, это более уместно сравнить объем липидной капельной фракции, которая представляет собой эквивалент всей клеточного лизата, чем сравнение липидные капли в другие мембранных фракций по т.он основа общего содержания белка 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если градиент плотности центрифугирования работало как ожидалось, плавающий слой должен содержать липидные капли и быть исчерпаны других органелл всей прогрессии спинов высокоскоростных.
Для протокола 1, западные Кляксы проводились с маркеров антител к липидных капель (Erg6p), и органелл, которые были найдены, чтобы взаимодействовать с липидные капли в дрожжах, ER (Dpm1p), митохондрии (Por1p), плазматическая мембрана (Pma1p) и вакуоли (Vma1p).
Равные объемы плавающего слоя каждых трех спинов (шаги 3,7, 3,10, и 3,13), собирали, осаждали трихлоруксусной кислоты (15% конечная концентрация), и растворяют в воде. 13 мл клеточного лизата (Фиг.3А, "Lys") и белок преп из каждых трех спинов (рис. 3А, "Spin1", "Spin2" и "Spin3") были разделены на 12% SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозу мембрана, и иммуноблоттинг с органелл SPECIFIC антитела. Как и ожидалось, липидов капли маркер белок Erg6p присутствует в плавающем слоя после каждой из трех спинов (фиг.3А); Por1p нет в плавающем слоя после Spin1 (фиг.3А); Vma1p истощается от плавающего слоя после Spin2 (фиг.3А), и Dpm1p и Pma1p не присутствуют в плавающем слоя после Spin3 (фиг.3А).
Для протокола 2, присутствие липидные капли, выделенных из человеческой плаценты срок ворсинок клеток была проверена путем окрашивания нейтрального липида конкретной флуоресценции красителя, BODIPY 493/503. Капли затем визуализировали под флуоресцентным микроскопом (рис. 3б). Чистота выделенных липидов капель фракций оценивали с помощью Вестерн-блоттинга с маркерных белков для липидных капель (perilipin 2), ER (калнексину), Гольджи (GM130), митохондрии (COX IV) и плазматической мембране (MEK1) (Фигура 3С). Липидов дрoplets были сняты с липоилироваться холодным ацетоном и белки были извлечены. Равные проценты постъядерной супернатанта (ПНС), фракцию под плавающим слоем последнего спина (шаг 3,6 ", Spin4" на фиг.3С), последующее стадию промывки (шаг 3,8 ", Spin5" на фиг.3С) и де-липоилироваться белок преп плавучего липидов капли слое (стадия 3,8, "LD" на фиг.3С) были разделены на 12% SDS-PAGE, переносили и иммуноблоттинг с указанными антителами. Perilipin 2 (также известный как ADRP), белок липид капель, был обнаружен в постъядерной супернатанта и в белом слое плавающей содержащей липидные капли. Белки, специфичные к плазматической мембране (MEK1) и Гольджи (GM130) не были обнаружены в липидных фракций капель в любом слое под плавающего слоя для Spin4 и Spin5. Как сообщалось ранее, ER белок калнексину 18,27,28 и слабый окрашивание митохондрий белков мембраны ЦОГ IV были детеИДКТК в другом месте в липидный капельной фракции 22. Эти результаты согласуются с более ранними сообщениями, показывающие, что липидные капли взаимодействовать с митохондрий в клетках млекопитающих 29 и с ER 30,31.
Рисунок 1. Сотовые липидные капли в деления клеток дрожжей. (A) Яркий поле (BF) и широкое поле флуоресценции (Fluor.) изображения шести представительных деления клеток дрожжей где капли липидов, окрашенных BODIPY 493/503. (В) Яркий поле (BF ) и широкое поле флуоресценции (Fluor.) изображения репрезентативной сферопластного где капли липидов окрашенных с BODIPY 493/503. Масштабные бары 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное вариант ое этот показатель.
Рисунок 2. Плавающий слой после центрифугирования в градиенте плотности. Пробирки центрифужные после () Spin1 (шаг 3.8), (Б) Spin2 (шаг 3.11) и (С) Spin3 (шаг 3,14) Протокола 1. (D) Пробирки центрифужные после Spin4 (шаг 3.6) Протокола 2. Плавающие слои, содержащие липидных капель указаны стрелками.
Рисунок 3. Анализ чистоты капель изолированных липидов. (A) Вестерн-блоттинг основных этапов протокола 1. Равные объемы каждого преп белка (Spin1 - шаг 3.7, Spin2 - шаг 3,10, и спинакер n3 - шаг 3,13) разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны, и иммуноблоттинг с антителами в течение Erg6p (LD, липидных капель), Dpm1p (ER), Por1p (MT, митохондрии), Pma1p (РМ, плазматической мембраны), и Vma1p (вакуоли). (В) Фаза контраст (ПК) и широкое поле флуоресценции (Fluor.) изображения BODIPY 493/503-stained липидные капли, которые были выделены из плацентарных ворсинок клеток человека. (C) Вестернблоты из ключевых шагов в Протоколе 2. Равнопроцентная р ПНС (сообщение ядерной супернатант), супернатант ниже плавающего слоя после последнего спина (Spin4 - шаг 3.6), последующей стирки (Spin5 - шаг 3,8), и плавающий слой (LD) были разделены SDS-Page, переданы мембраны и иммуноблоттинг с антителами для perilipin 2 (LD, липидные капли), калнексину (ER), GM130 (белковая матрица Гольджи, Гольджи), COX IV (цитохром с оксидазы MT, митохондрии), и MEK1 (МАРК киназа; PM, плазма мембрана).ad/50981/50981fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках этого протокола
Убедитесь, чтобы быть совместимыми с сред и плотности клеток в процессе роста культивируемых клеток. Клеточные капли липидов являются уникальными в том, что их соответствующие белки сильно зависит от среды, в которой клетки культивируют 17. Таким образом, средства массовой информации, в которых выращиваются клетки и плотность клеток следует тщательно контролировать до лизиса.
Белковый состав липидных капель является функцией фазы роста дрожжевых клеток. Меньше белки будут связаны с капель в фазе роста журнала по сравнению с неподвижной фазы. Кроме того, сферопластов эффективности является функцией фазы роста дрожжевых клеток. Клетки в фазе роста журнала будет иметь более высокие выходы, чем сферопластов клеток в стационарной фазе, поскольку последний более устойчивы к ферментативной обработки.
палатка ">Убедитесь, что используете нежные методы, чтобы взломать предпочтительны клетки. Методы, которые расщепляют дрожжей клеточной стенки путем ферментативного расщепления над методами, которые к разрыву клеточной стенки с помощью прикладных силу. Последний способ может нарушить целостность конструкции капель, приводящих к потере связанные белки или липиды.
Избегайте замораживания образцов после того как клетки были лизированы. Морозильные капли не рекомендуется, поскольку это может повлиять на их структурную целостность, что приводит к потере связанного белка или липиды. Замораживание может также вызвать капельки сплавить или фрагмент 24. Это может быть особенно важно, так как капли были обнаружены фрагментировать или претерпевать расщепление в живых клетках дрожжей 25 и, таким образом, разрушение крупных капель на более мелкие возможно. Кусочки капель, что фрагмент не могут иметь плавучесть, чтобы появиться в еloating слой во время центрифугирования в градиенте плотности. Это может искусственно уменьшить количество факторов капель, которые будут определены этим методом, так как белковый состав капель поверхностей может быть функцией от размера капель 32.
Убедитесь в том, чтобы проверить локализацию липидов капель, связанных факторов, липидные капли. Одним из характеристик липидных капель в том, что они взаимодействуют с другими органелл 33-37. Таким образом, факторы из этих органелл часто встречаются в липидный капельной фракции. Таким образом, важно использовать дополнительные методы, чтобы гарантировать, что эти факторы локализуются в капель. Исследования с флуоресцентным слитого белка, связанного с интересующего белка в клетках, где капельки липидов, окрашенных с другим флуоресцентным маркером следует использовать для определения степени колокализации 15. Такие методы, как корреляции белка прofiling могут быть использованы для дальнейшего количественного чистоту липидов капельной фракции 15. В этой стратегии, два компонента, каждый помечены различных изотопов, содержащих аминокислоты. Первый компонент является известным фактором липидов капель, а второй компонент является фракция, которая анализируется. Сравнения затем между дробных местах двух компонентов.
Изменения и устранение неисправностей
Изменения в Протоколе 1 для выделения липидные капли от начинающих дрожжей Saccharomyces Cerevisiae отмечены. Обратите внимание, что размеры капель липидов может значительно варьироваться. Скорость центрифугирования в градиенте плотности, возможно, потребуется увеличить для небольших капель накапливаться в плавающей слоя.
Ограничения технике
Доступ к ультра центрифуги с каклетят ведро ротор имеет важное значение для выделения капель сотовой липидов. Хотя эта часть оборудования является стандартом в большинстве клеточной биологии и биохимии лабораторий, это дорого.
Значение техники в отношении существующих методов или других альтернативных методов
Как упоминалось выше, Протокол 1 тесно на основе работы Лебер и др.. 6 и частью 1 Протокола 2 является модификацией ранее опубликованного протокола по Петров и др. 26.
Применения
Изоляция липидов капли является наиболее полезным для последующего протеомного и липидомных анализа связанных белков, нейтральных липидов и фосфолипидов. Запасы липидов капель связанных белков и липидов были составлены 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Американская Ассоциация Сердца награждения 13SDG14500046 к PD, устойчивое энергетическое образования и исследовательского центра Award (Университет Теннесси) с БП, и Врачей медицинского образования и исследований Фонда (Университет Теннесси) награда JM The Авторы выражают благодарность Caroline Leplante (Йельский университет) для протокола для преобразования деления дрожжей сферопластов; Эрик Т. Boder (Университет Теннесси) за использование дрожащими инкубаторов, настольной центрифуге и аналитического оборудования иммуноблота; и Центр Экологическая биотехнология (Университет Теннесси) для использования их ультра-центрифуги; Гюнтер Даум для дрожжевых антител (Грац ун-т технологии, Австрия.); личный состав кафедры акушерства и гинекологии (Университет Теннесси Medical Center) для оказания технической помощи .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
