Summary
Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.
Abstract
Gotitas de lípidos son orgánulos dinámicos que se pueden encontrar en la mayoría de las células procariotas eucariotas y ciertos. Estructuralmente, las gotitas consisten en un núcleo de lípidos neutros rodeadas por una monocapa de fosfolípidos. Una de las técnicas más útiles en la determinación de las funciones celulares de las gotitas ha sido la identificación proteómico de las proteínas unidas, que pueden aislarse junto con las gotitas. Aquí, dos métodos se describen para aislar las gotas de lípidos y sus proteínas unidas a partir de dos amplias eucariotas: la levadura de fisión y células vellosidades placentarias humanas. Aunque ambas técnicas presentan diferencias, el método principal - la densidad gradiente de centrifugación - es compartido por ambas preparaciones. Esto demuestra la amplia aplicabilidad de las técnicas de aislamiento de gotitas presentados.
En el primer protocolo, las células de levadura se convierten en esferoplastos por digestión enzimática de sus paredes celulares. Los esferoplastos resultantes se gently lisaron en un homogeneizador holgada. De Ficoll se añade al lisado para proporcionar un gradiente de densidad, y la mezcla se centrifugó tres veces. Después de la primera vuelta, las gotitas de lípidos se localizan en la capa flotante de color blanco de los tubos de centrífuga junto con el retículo endoplásmico (ER), la membrana plasmática, y vacuolas. Dos giros posteriores se utilizan para eliminar estos otros tres orgánulos. El resultado es una capa que tiene sólo gotitas y las proteínas unidas.
En el segundo protocolo, las células de las vellosidades placentarias están aisladas de placentas plazo humano por digestión enzimática con tripsina y DNasa I. Las células se homogeneizaron en un homogeneizador holgada. Pasos de baja velocidad de centrifugación y de velocidad media se utilizan para eliminar las células sin lisar, los desechos celulares, núcleos, mitocondrias y. La sacarosa se añade a la homogeneizado para proporcionar un gradiente de densidad y la mezcla se centrifuga para separar las gotitas de lípidos de la otra cellulafracciones r.
La pureza de las gotas de lípidos en ambos protocolos se confirma mediante análisis Western Blot. Las fracciones de gotas de ambas preparaciones son adecuadas para el análisis proteómico y lipidomic posterior.
Introduction
Las gotas de lípidos celulares son orgánulos dinámicos que sirven múltiples funciones en las células. Ellos son centros de almacenamiento de lípidos neutros, que se pueden transformar en energía o utilizados para la síntesis de fosfolípidos. Las gotitas juegan un papel central en condiciones fisiológicas y patológicas incluyendo la aterosclerosis, la obesidad, y enfermedades metabólicas relacionadas, y también enfermedades infecciosas 1,2. Además, son fuentes interesantes para los combustibles de biodiesel.
Mucha información sobre las funciones celulares de las gotas de lípidos se ha obtenido a partir del análisis proteómico y lipidomic de gotas purificadas de microorganismos de amplio alcance 3. Estos organismos han incluido las bacterias, levadura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematodos 14, y vuela 15,16. Dado el interés en el papel de gotitas de lípidos en enfermedades metabólicas humanos, las gotitas también se han aislado a partir de células animales cultivadas y untejidos Nimal. Líneas de células cultivadas han incluido adipocitos 3T3-L1 17, de ovario de hámster chino (CHO), las células K2 18, hepatocitos humanos 19,20, y líneas de células epiteliales 21. Tejidos animales de la que se han aislado las gotas han incluido ratón músculo esquelético 22, 23 de hígado y las glándulas mamarias 23. Como se mencionó anteriormente, el objetivo de la mayoría de los estudios de aislamiento gotita es para llevar a cabo el análisis proteómico de los factores unidos y análisis lipidomic en el neutro y fosfolípidos.
Desde lípidos neutros - el componente más numeroso de gotitas de lípidos - son menos densos que la mayoría de otros materiales celulares, el aislamiento de las gotas que tradicionalmente se ha realizado utilizando la densidad gradiente de centrifugación. Esa técnica es la pieza central de las dos preparaciones que se presentan aquí. Las técnicas anteriores se combinan 6,24 y modificar en una presentación visual de la aislamiento de gotitas a partir de células de levadura de fisión cultivadasy células humanas culturalizado obtuvieron a partir de tejido placentario. El objetivo es mostrar la amplia aplicabilidad de esta técnica por la elección de dos tipos de células muy diferentes como puntos de partida para el aislamiento de las gotitas. Esta técnica debe ser útil para aquellos que deseen para aislar las gotitas de la mayoría de los organismos.
Protocolo 1 describe el aislamiento de gotitas de lípidos de la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, que ha sido utilizado como un modelo para la observación de la formación de gotas durante la división celular eucariota 25. La levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae se ha usado ampliamente como un organismo modelo para el estudio de la biología de los lípidos de las gotitas. Protocolo 1 es aplicable tanto a los organismos y las diferencias en los preparativos se destacan.
Protocolo 2 describe el aislamiento de gotas de lípidos de las células de las vellosidades placentarias, que son a su vez obtenida de placenta humana a término. Lacolección de placentas plazo proporciona una oportunidad única de obtener seguridad y ética de 200-250 g de tejido humano disponible el 26, que contiene una cantidad significativa de las gotas de lípidos. Esto está en contraste con la mayoría del trabajo de aislamiento gotas de lípidos en eucariotas superiores, donde las gotitas se originan a partir de células cultivadas. En esos estudios, los ácidos grasos se añaden a menudo a la cultura para promover la síntesis de lípidos neutros y por lo tanto el crecimiento de las gotitas. Esto es en contraste con el trabajo aquí donde las gotas de lípidos se forman bajo condiciones nativas en el tejido de la placenta.
Las purezas de las fracciones de gotas de lípidos se determinaron por análisis de Western Blot utilizando anticuerpos marcadores de orgánulos. Estas dos fracciones protocolos producirán gotitas de lípidos que son adecuados para el análisis proteómico y lipidomic posterior.
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Protocol
1. Aislar gotas de lípidos a partir de (fisión) Las células de levadura
Aislamiento de gotitas desde el organismo modelo popular en ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae es casi idéntica a la siguiente protocolo 6. Se observan diferencias en los preparativos.
1. Cultivo de células de levadura
- Preparar los medios de comunicación. Combinar 36 g de YE5S polvo por litro de H2O destilada en botellas de vidrio o frascos de cultivo. Se necesitará alrededor de 2 l de medio. Autoclave los medios de comunicación a 121 ° C durante 20 min. Permita que el medio se enfríen a temperatura ambiente. Para S. cerevisiae reemplazar YE5S con YPD.
- Coloque 10-20 ml de los medios de comunicación YE5S enfriadas en un matraz de cultivo de 250 ml utilizando técnicas estériles. Inocular los medios de comunicación con una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar utilizando un palo de madera estéril o equivalente. Permita que las células crecen a la densidad óptica deseada a 30 ° C. Medir la densidad óptica a unalongitud de onda de 595 nm utilizando un espectrofotómetro.
- Colocar los residuos de medios en los matraces 2.8 L. No utilice más de 1 l de medio por 2,8 L matraz para asegurar una mezcla adecuada durante el crecimiento de las células en el incubador con agitación. El rendimiento final de células húmedas debe ser de unos 10 g para poder adquirir suficientes gotas de lípidos para el análisis proteómico y lipidomic.
- Introducir las células de la etapa 1.2 en los matraces L 2.8 cada uno con 1 l de medio que se prepararon en el paso 1.1.
- Cultivar las células a la densidad deseada a 30 ° C.
- Asegúrese de que las células tienen las gotas de lípidos. Reserva 1 ml de las células. Medir la densidad óptica (DO) de la muestra. Añadir 0,1 ml de un stock de BODIPY 493/503 100 mM en etanol por la DO de las células a la muestra. Coloque 3 l de la muestra entre un portaobjetos de vidrio y una cubierta de vidrio antideslizante. Visualizar bajo un microscopio de fluorescencia con un filtro de GFP (Figura 1A).
- Sedimenten las células desde el paso 1.5 a las 4 y #176; C a 3800 xg durante 10 min. Trabajar en grupos en función de la capacidad de los tubos de centrífuga.
- Vierta los medios YE5S y lavar las células con un tampón de EMM + 600 mM de sorbitol. Sorbitol brinda apoyo osmótica.
- Transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril y sedimentar las células a 4 ° C a 2000 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. Pesar las células húmedas. Resuspender las células en 2 ml de (MME + 600 mM de sorbitol) tampón por gramo de células.
2. La conversión de células de levadura de fisión en esferoplastos y la posterior lisis
- Añadir 5 mg cada una de 1) la enzima lítica de levadura y 2) las levaduras lisis de las enzimas de Trichoderma harzianum por gramo de células húmedas que fueron pesados en el paso 1.9. Para S. cerevisiae aumentar estas enzimas con la misma cantidad de Zymolyase.
- Se incuban las células a 30 º C bajo agitación suave a 100 rpm durante 60 min.
- Asegúrese de que los esferoplastos tienen dr lípidosoplets. Por el paso 1.6 (Figura 1B) repetir.
3. Densidad gradiente de centrifugación
- Se precipitan los esferoplastos por centrifugación a 4 ° C a 2000 xg durante 5 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico.
- Resuspender los esferoplastos sedimentados con hielo frío 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol y 200 mM EDTA. Tenga en cuenta que los esferoplastos son muy frágiles.
- Se precipitan los esferoplastos de nuevo con la misma configuración que en el paso 3.1. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender los esferoplastos usando una pipeta de plástico de transferencia en 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y 200 mM de EDTA a una concentración de 2 ml / g células.
- Transfiera los esferoplastos resuspendidas a un homogeneizador de vidrio y homogeneizar suavemente sobre hielo, 20-30 golpes, con la mano del mortero suelta del homogeneizador de vidrio.
- Transfiera los esferoplastos lisadas a tubos de centrífuga y las cubrirás con el mismo voLume de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM. Elija el número de tubos de centrífuga de usar por lo que cada tubo es de unos dos tercios de su capacidad.
- Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1,5 horas en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
- Transferir suavemente la capa superior flotante blanco (Figura 2A), que contiene las gotitas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir suficiente volumen de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga.
- Añadir el volumen equivalente de 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad.
- Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (rOTOR de deceleración = 0).
- Transferir suavemente la capa blanca que flota superior (Figura 2B), que contendrá las gotas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga.
- Añadir el volumen equivalente de 250 mM de sorbitol, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad.
- Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
- Transferir la capa superior de color blanco (Figura 2 C), lo que debería contener sólo las gotas de lípidos y proteínas unidas, a un tubo de diálisis y diálisis O / N en 10 mM Tris-HCl y 200 mM tampón EDTA para eliminar el Ficoll.
Las placentas fueron recogidos de las mujeres sanas con embarazos únicos sometidos electiva sección cesárea antes del inicio del trabajo de parto espontáneo a término. Los sujetos dieron por escrito, el consentimiento informado para la recogida de su placenta. La colección y uso posterior, de placentas se realizó con la aprobación de la Universidad de Tennessee y la Universidad de Tennessee Graduate School of Medicine en Knoxville Junta de Revisión Institucional (# 8757B y # 3338, respectivamente).
1. Aislar las células de las vellosidades placentarias humanas
Parte 1 del protocolo es una modificación de un protocolo publicado anteriormente por Petroff et al. 26
Preparar las siguientes soluciones:
- De NaCl (1 L): disolver 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) en dH2O para producir una solución 1 L. Filtro de esterilizar (0,2; Micras membrana).
- Solución salina equilibrada de 10x de Hank (10x HBSS) (1 L): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); 0,6 g de KH 2 PO 4 (M 136.086 g / mol); de 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol); 10 g de D-glucosa (M 180,16 g / mol). Disolver cada uno de los constituyentes en dH 2 O para producir una solución de 1 litro. Se esteriliza con filtro (0,2 membrana micras).
- Tampón de digestión de enzima (0,6 ml): combinar 70 ml de HBSS 10x con 3,3 ml de 7,5% de Na biscarbonato, 17,5 ml de HEPES 1 M, y 266,1 ml de dH2O y esterilizar el filtro (0.2 micras de membrana). Almacenar a 4 ° C.
- DNasa I: justo antes del uso, añadir 5 ml estéril al 0,9% de NaCl a un vial de DNasa. Mantener en hielo hasta su uso o almacenar a -20 ° C.
- Preparación de placenta para la disección
- Obtener una placenta humana y el proceso lo más cerca del momento de la entrega de lo posible. Utilice un recipiente sellado tal como un refrigerador para el transporte de la placenta. Sea siempre cuidadoso al ladomateriales biológicos humanos Ling.
- En la campana de seguridad biológica, la transferencia de la placenta a un recipiente estéril autoclavable, y lavar cuidadosamente la sangre de la placenta y las membranas utilizando solución estéril al 0,9% de NaCl (solución salina). Deseche la solución salina con sangre en el vaso de precipitados de 1 litro como residuo biológico líquido.
- Coloque la placenta en un campo estéril, con la superficie lisa que lleva el cordón umbilical hacia arriba. Con, tijeras y pinzas de punta fina afilados eliminar las membranas fetales y el cordón umbilical.
- Voltear la placenta de manera que la superficie materna (superficie rugosa) hacia arriba. Retire el tejido que recubre la placa basal, a unos 3 mm de la superficie.
- Disección de que la placenta
- Diseccionar un cotiledón a la vez evitando la placa coriónica. Recoger el tejido de las vellosidades en un vaso de precipitados de 250 ml con solución salina.
- Enjuague tejido varias veces en un vaso de precipitados separado con 0,9% de NaCl por agitación con fórceps, usando el vaso de precipitados de 1 L para residuos líquidos.
- Transferir un cotiledón a la vez a un plato de 150 mm de Petri. Sujete con fórceps y raspar el tejido con una hoja de afeitar de los vasos en un plato de Petri. Coloque el tejido raspado en el vaso separado que contiene 0,9% de NaCl. Repita el procedimiento para todas las piezas de tejido.
- Transferencia pequeña porción del tejido al tamiz de disociación celular y enjuague con 0,9% de NaCl ampliamente hasta que el efluente se convierte en claro. Repita el procedimiento para todos los tejidos.
- Después de enjuagar el tejido raspado en el tamiz de disociación celular, escurrir el exceso de líquido y peso.
En este punto el tejido se puede almacenar O / N en un matraz Erlenmeyer estéril a 4 ° C en DMEM.
- La digestión enzimática del tejido de la placenta
- Preparar la mezcla de digestión de tejido: 100 ml de tampón de dilución de enzima precalentado, 1 ml de DNasa I y 20 ml de 2,5% de tripsina 10x.
- Divida el tejido, la transferencia de 60 g de tejido recogido total de (por lo general alrededor de 250-300 g) a un matraz de Erlenmeyer estéril de 500 ml.
- Recoger las células disociadas
- Después de los primeros 45 min de disociación, establezca el matraz de digestión con una inclinación hasta que el tejido se asienta.
- Recoger el sobrenadante, teniendo cuidado de no recoger el tejido no disociado. Añadir una cantidad igual de HBSS para el sobrenadante recogido y transferir a tubos de centrífuga de 15 ml estériles. Para porciones adicionales de tejido no disociado, repita el procedimiento desde el paso 3.2 con el tejido no disociado.
- Centrifugar el homogeneizado a 4 ° C a 1000 xg durante 15 min.
- Para cada lote, después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Las células de las vellosidades placentarias son predominantemente en la porción blanca de la pastilla, que recubre las células rojas de la sangre.
- Transfiera células vellosos (porción blanca del pellet) un sterile 50 ml tubo de centrífuga cónico y mantener en hielo.
- Después de recoger las células de las tres etapas de digestión, se filtra la suspensión utilizando un filtro de células de 100 micras de nylon insertada en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 ml estéril. Si la filtración de la suspensión celular se ralentiza, levantar hacia arriba sobre el filtro para extraer un vacío dentro del tubo.
- Centrifugar a 4 ° C a 1000 xg durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
2. Homogeneizar las células vellosas placentarios
- Antes de comenzar con el proceso de aislamiento, preparar 50 ml de lisis hipotónica Medio (HLM) que contienen 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM. Añadir inhibidores de la proteasa a HLM justo antes de su uso y mantener el medio en el hielo.
- En la campana de seguridad biológica, añadir 4 veces el volumen del sedimento celular HLM helada a las células. Suavemente y por completo volver a suspender las células pipeteando las células up-unad-hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
- Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 min.
- Transferir las células a la homogeneizador Dounce, que debe ser en hielo. Lentamente homogeneizar las células mediante la aplicación de 20 a 25 movimientos suaves con la mano del mortero y holgada del homogeneizador.
- Centrifugar el lisado de células a 4 º C a 3000 xg durante 10 min para eliminar las células sin lisar, los núcleos y restos celulares.
- Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo SW28 (o una alternativa que puede ser centrifugada a 25.000 xg). Centrifugar a 4 ° C a 25.000 xg durante 20 min para eliminar las mitocondrias.
3. Aislar las gotas de lípidos por ultracentrifugación
- Preparar 50 ml de carbonato de sodio 100 mM (M 106 g / mol) tampón (pH 11,5) y 50 ml de 60% de sacarosa solución (W / W). Añadir inhibidores de la proteasa para el tampón de carbonato de sodio antes de su uso y mantener en hielo.
- Recoger el sobrenadante de la etapa 2.6 en un tubo de centrífuga de 50 ml, ajustara 20% de sacarosa y la transferencia en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga para un rotor SW28, o equivalente. Sobrenadante densidad de superposición ajustado con ~ 10 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5-1 ml de helado HLM para llenar el tubo.
- Centrifugar a 4 ° C a 130.000 xg durante 45 min utilizando SW28 rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
- Recoger la capa flotante, ajuste a 10% de sacarosa y transferir en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml para un rotor SW41Ti, o equivalente. Densidad de superposición sobrenadante se ajustó con aproximadamente 5 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5 ml de HLM enfriado con hielo.
- Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 60 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0) para minimizar la interrupción de la capa de gotas de lípidos.
- Recoger cuidadosamente la capa flotante superior (Figura 2D), que contienelas gotas de lípidos con una pipeta de 1 ml y repita el paso 3.4.
- Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 30 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
- Recoger cuidadosamente la capa flotante de color blanco superior que contiene gotas de lípidos con una pipeta Pasteur doblada en tres tubos de 1,5 ml que contienen 100 l HLM.
Fracción de gotas de lípidos Caracterización (Protocolos 1 y 2)
La recuperación y la pureza de la fracción de gotas de lípidos se pueden verificar por Western Blot combinada con la luz o microscopía electrónica. Además, alícuotas después de diferentes etapas de centrifugación pueden ser recogidos y retenidos para determinar la eficiencia de purificación. En Western Blotting, es más apropiado para comparar un volumen de la fracción de gotas de lípidos que representa un equivalente de todo el lisado celular de la comparación de las gotas de lípidos a otras fracciones de membrana en Tél base del contenido total de proteínas 24.
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Representative Results
Si la centrifugación en gradiente de densidad trabajó como se esperaba, la capa flotante debe contener gotitas de lípidos y que se haya agotado de otros orgánulos largo de la progresión de los giros de alta velocidad.
Para Protocolo 1, Western blots se realizaron con anticuerpos marcadores a gotitas de lípidos (Erg6p), y orgánulos que se han encontrado para interactuar con gotitas de lípidos en la levadura, ER (Dpm1p), mitocondrias (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), y vacuolas (Vma1p).
Volúmenes iguales de la capa flotante de cada tres giros (pasos 3.7, 3.10, y 3.13) se recogieron, se precipitaron con ácido tricloroacético (concentración final 15%), y se solubilizaron en agua. 13 ml de lisado de células (Figura 3A, "Lys") y de preparación de proteína de cada tres giros (Figura 3A, "Spin1", "spin2", y "Spin3") se separaron en 12% de SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa membrana y immunoblotted con especi orgánuloanticuerpos fic. Como se esperaba, la proteína marcadora gotas de lípidos Erg6p está presente en la capa flotante después de cada uno de los tres giros (Figura 3A); Por1p no está presente en la capa flotante después de Spin1 (Figura 3A); Vma1p está agotado de la capa flotante después de spin2 (Figura 3A), y Dpm1p y Pma1p no están presentes en la capa flotante después de Spin3 (Figura 3A).
Para Protocolo 2, la presencia de gotitas de lípidos aislados a partir de células vellosas placentarios plazo humana se verificó por tinción con un colorante neutro de lípidos específica de fluorescencia, BODIPY 493/503. Las gotas fueron luego visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3B). La pureza de las fracciones aisladas de gotitas de lípidos se evaluó mediante transferencia de Western con proteínas marcadoras de gotitas de lípidos (perilipina 2), ER (calnexina), aparato de Golgi (GM130), mitocondrias (la COX IV) y membrana plasmática (MEK1) (Figura 3C). El dr lípidosoplets se lipidado des con acetona fría y las proteínas se extrajeron. Porcentajes iguales de sobrenadante post-nuclear (PNS), la fracción por debajo de la capa flotante de la última vuelta (paso 3.6, "Spin4" en la Figura 3C), la etapa de lavado subsiguiente (etapa 3.8, "Spin5" en la Figura 3C), y lipidada de-la preparación de proteína de flotar capa de gotas de lípidos (etapa 3.8, "LD" en la Figura 3C) se separaron en 12% de SDS-PAGE, se transfirieron y a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Perilipin 2 (también conocido como ADRP), la proteína de gotas de lípidos, se detectó en el sobrenadante de post-nuclear y en la capa flotante blanco aislado que contiene gotitas de lípidos. No se detectaron proteínas específicas de la membrana plasmática (MEK1) y Golgi (GM130) en fracciones de gotas de lípidos, ya sea en la capa debajo de la capa flotante para Spin4 y Spin5. Como se informó anteriormente, la proteína ER calnexina 18,27,28 y una débil tinción de la proteína de membrana mitocondrial de la COX IV han sido detected en otra parte de la fracción de gotas de lípidos 22. Estos resultados son coherentes con los informes anteriores que muestran que las gotitas de lípidos interactúan con mitocondrias en células de mamíferos 29 y con el ER 30,31.
Figura 1. Las gotas de lípidos celulares en células de levadura de fisión. (A) Campo claro (BF) y ancho de fluorescencia de campo (Fluor.) Imágenes de seis células de levadura de fisión representativas cuando las gotas de lípidos se tiñen con BODIPY 493/503. (B) Campo claro (BF ) y ancho de fluorescencia campo Fluor. imágenes () de un esferoplasto representativa donde las gotas de lípidos se tiñen con BODIPY 493/503. Las barras de escala son de 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande of esta cifra.
Figura 2. Capa flotante después de la centrifugación en gradiente de densidad. Tubos centrífuga después de (A) Spin1 (paso 3.8), (B) spin2 (paso 3.11), y (C) Spin3 (paso 3,14) del Protocolo 1. (D) Tubos centrífuga después Spin4 (paso 3.6) del Protocolo 2. Las capas flotantes que contienen las gotas de lípidos se indican mediante flechas.
Figura 3. Análisis de la pureza de las gotas lipídicas aisladas. (A) Transferencias Western de los pasos clave en el Protocolo 1. Volúmenes iguales de cada preparación de proteínas (Spin1 - paso 3.7, spin2 - paso 3.10, y Spi N3 - paso 3,13) se separó por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y a inmunotransferencia con anticuerpos para Erg6p (LD, gotitas de lípidos), Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitocondrias), Pma1p (PM, membrana plasmática), y Vma1p (vacuolas). (B) de contraste de fase (PC) y ancho de fluorescencia de campo (Fluor.) Imágenes de BODIPY 493/503-stained gotas de lípidos que se han aislado a partir de células de las vellosidades placentarias humanas. (C) transferencias Western de pasos clave en el Protocolo 2. Igual porcentaje pf PNS (sobrenadante de post nuclear), el sobrenadante por debajo de la capa flotante después de la última vuelta (Spin4 - paso 3.6), después de lavado (Spin5 - paso 3,8), y la capa flotante (LD) se separaron por SDS-PAGE, transferidos a membranas y a inmunotransferencia con anticuerpos para perilipina 2 (LD, gotitas de lípidos), calnexina (ER), GM130 (proteína de la matriz de Golgi, de Golgi), la COX IV (citocromo c oxidasa; MT, mitocondrias), y MEK1 (MAPK quinasa; PM, de plasma membrana).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos dentro de este protocolo
Asegúrese de que para ser consistente con los medios de comunicación y las densidades de células durante el crecimiento de las células cultivadas. Gotitas de lípidos celulares son únicos en que sus proteínas asociadas son depende en gran medida el medio ambiente en el que se cultivan las células 17. Por lo tanto, los medios de comunicación en el que se cultivan las células y la densidad de las células deben ser monitoreados de cerca antes de la lisis.
La composición de proteína de gotitas de lípidos es una función de la fase de crecimiento de las células de levadura. Menos proteínas se unen a las gotitas en la fase de crecimiento logarítmico fase estacionaria. También, spheroplasting eficiencia es una función de la fase de crecimiento de las células de levadura. Las células en fase de crecimiento log tendrán mayores rendimientos de esferoplastos que las células en fase estacionaria, porque estos últimos son más resistentes al tratamiento enzimático.
tienda ">Asegúrese de utilizar técnicas suaves para romper las células. Técnicas que rompen la pared celular de la levadura por digestión enzimática son preferibles a las técnicas que se rompen la pared celular a través de la fuerza aplicada. El último método puede perturbar la integridad estructural de las gotitas resultantes en la pérdida de proteínas o lípidos unidos.
Evite la congelación de las muestras después de que las células han sido lisadas. Gotas de congelación, no se recomienda ya que puede afectar su integridad estructural que resulta en la pérdida de la proteína unida o lípidos. La congelación también puede causar que las gotas se fusionen o fragmento 24. Esto puede ser especialmente relevante, ya que se han observado gotas para fragmentar o experimentar la fisión en las células vivas de la levadura 25 y por lo tanto desglose de gotas más grandes en otros más pequeños es posible. Piezas de gotitas que fragmento puede no tener la flotabilidad a aparecer en la fcapa loating durante densidad gradiente de centrifugación. Esto podría reducir artificialmente el número de factores de gotitas que se pueden identificar por esta técnica ya que la composición de proteínas de superficies de las gotas puede ser una función de tamaño de las gotitas 32.
Asegúrese de probar la localización de las gotitas de lípidos factores asociados a las gotas de lípidos. Una de las características de las gotas de lípidos es que interactúan con otros orgánulos 33-37. Por lo tanto, los factores de estos orgánulos se encuentran a menudo en la fracción de gotas de lípidos. Por lo tanto, es importante utilizar técnicas adicionales para asegurar que estos factores se localizan en las gotitas. Los estudios con una proteína de fusión fluorescente ligado a la proteína de interés en células en las que las gotitas de lípidos se tiñen con un marcador fluorescente diferente se deben utilizar para determinar el grado de colocalización 15. Técnicas tales como la correlación de proteína PRofiling se puede utilizar para cuantificar aún más la pureza de la fracción de gotas de lípidos 15. En esta estrategia, dos componentes están cada uno marcado con diferentes aminoácidos que contienen isótopos. El primer componente es un factor de gotas de lípidos conocido, y el segundo componente es la fracción que se está analizando. Las comparaciones se hacen entonces entre las posiciones fraccionales de los dos componentes.
Modificaciones y solución de problemas
Se observan modificaciones en el Protocolo 1 para el aislamiento de gotas de lípidos de la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes. Tenga en cuenta que los tamaños de gotitas de lípidos pueden variar en gran medida. Velocidades de centrifugación en gradiente de densidad pueden ser necesario un aumento de gotitas más pequeñas a acumularse en la capa flotante.
Limitaciones de la técnica
El acceso a una ultra centrífuga con comovolando rotor de cubeta es esencial para el aislamiento de gotitas de lípidos celulares. Aunque este equipo es estándar en la mayoría de los laboratorios de biología celular y bioquímica, que es caro.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes u otros métodos alternativos
Como se mencionó anteriormente, el Protocolo 1 se basa estrechamente en el trabajo de Leber et al. 6 y la parte 1 del Protocolo n º 2 es una modificación de un protocolo publicado anteriormente por Petroff et al. 26
Aplicaciones
Aislamiento de gotas de lípidos es más útil para su posterior análisis proteómico y lipidomic de proteínas unidas, lípidos neutros y fosfolípidos. Los inventarios de las gotitas de lípidos proteínas y lípidos asociados han sido recopilados 4,6-17,19,20,22,23,28.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el premio de la Asociación Americana del Corazón 13SDG14500046 a PD, una Escuela de Energía Sostenible y Premio de Investigación Centro (Universidad de Tennessee) a PD, y para la Educación Médica de los Médicos y la Fundación para la Investigación (Universidad de Tennessee) premio a JM La autores agradecen a Caroline Leplante (Yale Univ.) para el protocolo para la conversión de la levadura de fisión para esferoplastos; Eric T. Boder (Universidad de Tennessee) para el uso de sus incubadoras temblores, centrífuga de mesa y Western Blot equipos de análisis, y el Centro de Biotecnología Ambiental (Universidad de Tennessee) para el uso de su ultra-centrífuga; Günther Daum para anticuerpos levadura (Graz University of Technology, Austria.); al personal del Departamento de Obstetricia y Ginecología (Univ. Tennessee Medical Center) para la asistencia técnica .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
