Summary
Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.
Abstract
Lipidedruppeltjes zijn dynamische organellen die gevonden kunnen worden in de meeste eukaryote en bepaalde prokaryote cellen. Structureel, de druppels uit een kern van neutrale lipiden omringd door een fosfolipide monolaag. Een van de meest nuttige technieken het bepalen van de cellulaire rol van druppels is proteomische identificatie van gebonden eiwitten, die kunnen worden geïsoleerd met de druppels. Hier worden twee methoden beschreven om lipide druppels en hun gebonden eiwitten te isoleren van twee brede eukaryoten: splijtgist en menselijke placenta villous cellen. Hoewel beide technieken verschillen, de belangrijkste methode - dichtheidsgradiëntcentrifugatie - wordt gedeeld door beide preparaten. Dit toont de brede toepasbaarheid van de gepresenteerde druppel isolatietechnieken.
In het eerste protocol, worden gistcellen omgezet in sferoplasten door enzymatische afbraak van de celwanden. De resulterende sferoplasten worden vervolgens gently gelyseerd in een loszittende homogenisator. Ficoll wordt toegevoegd aan het lysaat aan een dichtheidsgradiënt geven en het mengsel wordt driemaal gecentrifugeerd. Na de eerste rotatie, worden de lipidedruppeltjes gelokaliseerd in het witgekleurde drijflaag van de centrifugebuizen met het endoplasmatisch reticulum (ER), de plasmamembraan en vacuolen. Twee daaropvolgende spins worden gebruikt om deze drie andere organellen verwijderen. Het resultaat is een laag die alleen druppels en gebonden eiwitten heeft.
In het tweede protocol, worden placenta villous cellen geïsoleerd uit menselijke term placenta door inwerking van het enzym trypsine en DNase I. De cellen worden gehomogeniseerd in een loszittende homogenisator. Lage snelheid en gemiddelde snelheid centrifugeren stappen worden gebruikt om gebroken cellen, cellulaire puin, kernen, en mitochondriën verwijderen. Sucrose wordt aan het homogenaat tot een dichtheidsgradiënt geven en het mengsel wordt gecentrifugeerd om de lipide druppels onderscheiden van andere cellular fracties.
De zuiverheid van het lipide druppels in beide protocollen wordt bevestigd door Western Blot analyse. De druppel fracties uit beide desinfectantia zijn geschikt voor latere proteomics en lipidomic analyse.
Introduction
Cellulaire lipide druppels zijn dynamische organellen die meerdere functies dienen in cellen. Ze zijn opslag knooppunten voor neutrale lipiden, die kan worden omgezet in energie of voor fosfolipide synthese. De druppels spelen een centrale rol in fysiologische en pathologische omstandigheden waaronder atherosclerose, obesitas en gerelateerde metabole ziekten, en ook infectieziekten 1,2. Bovendien, ze zijn intrigerend bronnen voor biodiesel.
Veel informatie over de cellulaire rol van lipide druppels is verkregen van proteomics en lipidomic analyse van druppeltjes gezuiverd uit uiteenlopende organismen 3. Deze organismen hebben opgenomen bacteriën 4,5, gist 6-11, planten 12,13, aaltjes 14, en vliegt 15,16. Gezien het belang van de rol van lipide druppels in menselijke stofwisselingsziekten, druppeltjes zijn ook geïsoleerd uit gekweekte dierlijke cellen en eenNimal weefsels. Gekweekte cellijnen 3T3-L1 adipocyten 17, Chinese hamster ovarium (CHO)-cellen K2 18, humane hepatocyten 19,20 en epitheliale cellijnen 21 opgenomen. Dierlijke weefsels waaruit druppeltjes zijn geïsoleerd zijn muis skeletspieren 22, 23 lever en borstklieren 23 inbegrepen. Zoals hierboven vermeld, het doel van de meeste druppel isolatie studies is proteoomanalyse voeren op de afhankelijke factoren en lipiden analyse van de neutrale en fosfolipiden.
Sinds neutrale lipiden - de meest talrijke onderdeel van lipide druppels - zijn minder dicht dan de meeste andere cellulaire materialen, heeft isolatie van druppeltjes traditioneel met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Die techniek is het middelpunt van beide desinfectantia hier gepresenteerd. Vorige technieken 6,24 worden gecombineerd en bewerkt tot een visuele presentatie van de isolatie van druppeltjes uit gekweekte kernsplijting gistcellenen noncultured menselijke cellen verkregen van placenta weefsel. Het doel is de brede toepasbaarheid van deze techniek zien door te kiezen twee sterk verschillende celtypes als uitgangspunten voor de druppel isolatie. Deze techniek moet nuttig zijn voor diegenen die druppels van de meeste organismen te isoleren.
Protocol 1 beschrijft de isolatie van lipide druppeltjes uit de splijtgist, Schizosaccharomyces pombe, die is gebruikt als een model voor het waarnemen druppelvorming in eukaryote celdeling 25. De gist Saccharomyces cerevisiae is uitgebreid gebruikt als modelorganisme voor het bestuderen van lipide druppel biologie. Protocol nr. 1 is van toepassing op zowel organismen en verschillen in de voorbereidingen worden gemarkeerd.
Protocol 2 beschrijft de isolatie van lipide druppeltjes uit placenta villous cellen, die op hun beurt verkregen uit menselijk term placenta. Decollectie term placenta's biedt een unieke gelegenheid om 200-250 g beschikbaar menselijk weefsel 26, die aanzienlijke aantallen lipide druppels bevat veilig en ethisch te verkrijgen. Dit in tegenstelling tot de meeste lipide druppel isolatie werken in hogere eukaryoten waar de druppels afkomstig uit gekweekte cellen. In deze studies worden vetzuren vaak toegevoegd aan de kweek tot de synthese van neutrale lipiden en daarmee de groei van druppeltjes te bevorderen. Dit in tegenstelling tot de werk hier waar lipide druppeltjes worden gevormd onder natuurlijke omstandigheden in placentaweefsel.
De zuiverheden van het lipide druppel fracties worden bepaald door Western blot analyse onder toepassing organel marker antilichamen. Deze twee protocollen lipide druppel fracties die geschikt zijn voor daaropvolgende proteomische en lipiden analyse opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoleren van lipide druppels uit (kernsplijting) gistcellen
Isolatie van druppeltjes uit de populaire modelorganisme gist Saccharomyces cerevisiae is bijna identiek aan het volgende protocol 6. Verschillen in de voorbereidingen worden genoteerd.
1. Groeiende gistcellen
- Bereid de media. Combineer 36 g YE5S poeder per liter dH 2 O in glazen flessen of kweekflessen. Ongeveer 2 L media nodig. Autoclaaf het medium bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Laat het materiaal afkoelen tot kamertemperatuur. Voor S. cerevisiae vervangen YE5S met YPD.
- Plaats 10-20 ml van de gekoelde YE5S media in een 250 ml kolf met steriele technieken. Geënt media met een kleine hoeveelheid gistcellen uit een agarplaat met een steriele houten stok of gelijkwaardig. Laat de cellen groeien tot de gewenste optische dichtheid bij 30 ° C. Meet de optische dichtheid bij eengolflengte van 595 nm met een spectrofotometer.
- Leg de resterende media in de 2,8 L flessen. Gebruik niet meer dan 1 L van media per 2,8 L fles een goede menging te verzekeren tijdens de celgroei in de schudincubator. De uiteindelijke opbrengst aan natte cellen moet ongeveer 10 g genomen kunnen voldoende lipidedruppeltjes verwerven voor proteomische analyse en lipiden.
- Introduceer de cellen van stap 1.2 naar de 2.8 L kolven elk met 1 L van media die werden bereid in stap 1.1.
- Groeien de cellen om de gewenste dichtheid bij 30 ° C.
- Zorg ervoor dat de cellen hebben lipide druppels. Reserve 1 ml van de cellen. Meet de optische dichtheid (OD) van het monster. Voeg 0,1 ml van een 100 mM voorraad BODIPY 493/503 in ethanol per OD van cellen aan het monster. Plaats 3 pi van het monster tussen een glasplaatje en een glazen afdekplaat slip. Visualiseren onder een fluorescentiemicroscoop met een GFP-filter (Figuur 1A).
- Pellet de cellen van stap 1.5 bij 4 & #176, C bij 3800 xg gedurende 10 minuten. Werk in batches afhankelijk van de capaciteit van de centrifugebuizen.
- Giet het YE5S media en was de cellen met een buffer van EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol biedt osmotische ondersteuning.
- Breng de cellen naar een steriele 50 ml centrifugebuis en pellet de cellen bij 4 ° C bij 2000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. Weeg de natte cellen. Resuspendeer de cellen in 2 ml (EMM + 600 mM sorbitol) buffer per gram cellen.
2. Het omzetten kernsplijting gistcellen in sferoplasten en daaropvolgende lysis
- Voeg 5 mg per 1) gist lytisch enzym en 2) gist lyserende enzymen uit Trichoderma harzianum per gram natte cellen werden gewogen in stap 1.9. Voor S. cerevisiae vergroten deze enzymen met dezelfde hoeveelheid zymolyase.
- Incubeer de cellen bij 30 ° C onder voorzichtig schudden bij 100 rpm gedurende 60 minuten.
- Controleer dat de sferoplasten hebben lipide droplets. Door het herhalen van stap 1.6 (Figuur 1B).
3. Dichtheidsgradiënt centrifugatie
- Pellet de sferoplasten door centrifugeren bij 4 ° C bij 2000 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof met behulp van een plastic overdracht pipet voorzichtig.
- Voorzichtig resuspendeer de gepelleteerde sferoplasten met ijskoude 10 mM Tris-HCl, 600 mM sorbitol, en 200 pM EDTA. Houd in gedachten dat de sferoplasten zijn zeer kwetsbaar.
- Pellet de sferoplasten opnieuw met dezelfde instellingen als in stap 3.1. Verwijder de supernatant en resuspendeer de sferoplasten met een plastic overdracht pipet 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA bij een concentratie van 2 ml / g-cellen.
- Breng de geresuspendeerd sferoplasten een glashomogenisator en zachtjes homogeniseren op ijs, 20-30 slagen, met de loszittende stamper van de glashomogenisator.
- Breng de gelyseerde sferoplasten naar centrifugebuizen en overlay met dezelfde volume van 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer. Kies het aantal centrifuge buizen zodat elke buis ongeveer tweederde vol gebruiken.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 100.000 xg gedurende 1,5 uur in een SW28 rotor of equivalent. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0).
- Zacht overdracht de bovenste zwevende witte laag (figuur 2A), die de druppeltjes bevat een nieuwe centrifugebuis (s) met behulp van een pipet of een gebogen Pasteur pipet. Voeg voldoende volume van 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer om het monster zodat het ongeveer een derde van de centrifugebuis vult.
- Voeg de overeenkomstige hoeveelheid 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer om de bovenzijde van het monster (s) in de nieuwe centrifugebuis (s). Na toevoeging van de buffer de buizen moet ongeveer tweederde vol.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 100.000 xg gedurende 1 uur in een SW28 rotor of equivalent. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0).
- Zacht overdracht de bovenste zwevende witte laag (figuur 2B), die de druppeltjes bevatten een nieuwe centrifugebuis (s) met behulp van een pipet of een gebogen Pasteur pipet. Voeg 600 mM sorbitol, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer om het monster zodat het ongeveer een derde van de centrifugebuis vult.
- Voeg de overeenkomstige hoeveelheid 250 mM sorbitol, 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer om de bovenzijde van het monster (s) in de nieuwe centrifugebuis (s). Na toevoeging van de buffer de buizen moet ongeveer tweederde vol.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 100.000 xg gedurende 1 uur in een SW28 rotor of equivalent. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0).
- Transfer bovenste witte laag (figuur 2C), die alleen de lipide druppels en gebonden eiwitten moeten bevatten dialyse slangen en dialyseren O / N in 10 mM Tris-HCl en 200 pM EDTA buffer om de Ficoll elimineren.
Placenta's werden verzameld van gezonde vrouwen met een eenling zwangerschappen die een electieve keizersnede levering voorafgaand aan het begin van de spontane sociale partners op termijn. Proefpersonen gaf schriftelijke, toestemming voor het verzamelen van hun placenta. De collectie, en het daaropvolgende gebruik van placenta's werd uitgevoerd met goedkeuring van de Universiteit van Tennessee en de Universiteit van Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville Institutional Review Board (# 8757B en # 3338, respectievelijk).
1. Isoleren van menselijke placenta villous cellen
Deel 1 van het protocol is een wijziging van een eerder gepubliceerde protocol door Petroff et al.. 26
Bereid volgende oplossingen:
- NaCl (1 L): los 9 g NaCl (M 58.4 g / mol) in dH 2 O een 1 N oplossing werd verkregen. Filter steriliseren (0.2; Urn membraan).
- 10x Hank's gebalanceerde zoutoplossing (10x HBSS) (1 L): 4 g KCl (M 74,5 g / mol), 0,6 g KH 2PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-glucose (M 180,16 g / mol). Los elk van de bestanddelen in dH 2 O een 1 N oplossing werd verkregen. Filter steriliseren (0,2 um membraan).
- Enzymdigestie buffer (0,6 ml): combineer 70 ml 10x HBSS met 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES, en 266,1 ml dH 2 O; filter steriliseren (0,2 um membraan). Bewaren bij 4 ° C.
- DNase I: vlak voor gebruik, voeg 5 ml steriele 0,9% NaCl tot een flacon van DNase. Blijf op ijs tot gebruik of bewaar bij -20 ° C.
- Voorbereiden van placenta voor dissectie
- Verkrijgen van een menselijke placenta en het proces zo dicht mogelijk bij het moment van levering mogelijk. Gebruik een afgesloten vat zoals een koeler om de placenta te vervoeren. Voorzichtigheid is geboden wanneer de handleng menselijke biologische materialen.
- In de biologische veiligheid kap, overdracht van de placenta naar een steriele autoclaveerbaar container, en het bloed zorgvuldig wassen van placenta en vliezen met steriele 0,9% NaCl (zoutoplossing) oplossing. Gooi bloedige zoutoplossing in de 1 L beker als vloeibare biologisch afval.
- Plaats de placenta op een steriel veld, met het gladde oppervlak waarop de navelstreng naar boven. Met scherpe, fijne punt schaar en pincet verwijderen vruchtvliezen en de navelstreng.
- Flip de placenta om zodat de maternale oppervlak (ruw oppervlak) naar boven is gericht. Haal de bovenliggende basale plaat weefsel, ongeveer 3 mm van het oppervlak.
- Het ontleden van de placenta
- Ontleden een cotyledon tegelijk vermijden van de chorion plaat. Verzamel villous weefsel in een bekerglas van 250 ml met een zoutoplossing.
- Spoel weefsel meerdere malen in een aparte beker met 0,9% NaCl door zwenken met een pincet, met behulp van de 1 L beker voor vloeibaar afval.
- Breng een zaadlob tegelijk een 150 mm petrischaal. Houden met een pincet en schraap weefsel met scheermesje afkomstig van vaartuigen van petrischaal. Plaats geschraapt weefsel in aparte bekerglas met 0,9% NaCl. Herhaal dit voor alle stukken weefsel.
- Overdracht klein gedeelte van het weefsel om de cel dissociatie zeef spoelen met 0,9% NaCl uitgebreid tot het eluaat duidelijk. Herhaal dit voor alle weefsel.
- Na het spoelen van de geschraapt weefsel in de cel dissociatie zeef uitlekken van overtollige vloeistof en gewicht.
Op dit punt kan het weefsel worden opgeslagen O / N in een steriele Erlenmeyer kolf bij 4 ° C in DMEM.
- Enzymatische digestie van het placentaweefsel
- Bereid het weefsel digestiemengsel: 100 ml voorverwarmde enzymverdunning buffer, 1 ml DNase I en 20 ml 2,5% 10x trypsine.
- Verdeel het weefsel, de overdracht van 60 g van de totale verzamelde weefsel (meestal ongeveer 250-300 g) in een 500 ml steriele erlenmeyer.
- Het verzamelen van de gedissocieerde cellen
- Na de eerste 45 min dissociatie, stelt de ontsluitingsrecipiënt op een tilt tot weefsel afwikkelt.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof, zorg ongedissocieerde weefsel niet te innen. Voeg evenveel HBSS de verzamelde supernatant en breng in steriele 15 ml centrifugebuizen. Voor extra porties ongedissocieerde weefsel, herhaal procedure vanaf stap 3.2 met de ongedissocieerde weefsel.
- Centrifugeer het homogenaat bij 4 ° C bij 1000 g gedurende 15 minuten.
- Voor elke partij na centrifugeren, het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren. De placenta villous cellen overwegend witte gedeelte van de pellet, bovenop de rode bloedcellen.
- Breng de villous cellen (witte gedeelte van de pellet) een sterile 50 ml conische centrifugebuis en blijf op ijs.
- Na het verzamelen van de cellen van alle drie fasen digestie, filtreer de suspensie op met een 100 urn nylon cel zeef geplaatst in de top van een steriele 50 ml conische centrifugebuis. Als de filtratie van de celsuspensie vertraagt, lift omhoog over het filter een vacuüm in de buis te trekken.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
2. Homogeniseren placenta villous cellen
- Voordat het isolatieproces bereiden 50 ml hypotone lysis Medium (HLM) bevattende 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 en 1 mM EDTA. Voeg proteaseremmers aan HLM vlak voor gebruik en bewaar het medium op ijs.
- In de biologische beschermkap wordt 4 maal de celpellet volume ijskoude HLM aan de cellen. Voorzichtig maar grondig resuspendeer de cellen door pipetteren de cellen op-eend-down met een pipet 10 ml.
- Incubeer de gesuspendeerde cellen op ijs gedurende 10 minuten.
- Breng de cellen naar de Dounce homogenisator, die moet worden op ijs. Langzaam homogeniseren van de cellen door het toepassen van 20-25 zachte bewegingen met de loszittende stamper van de homogenisator.
- Centrifugeer het cellysaat bij 4 ° C bij 3000 xg gedurende 10 min tot gebroken cellen, kernen en celresten te verwijderen.
- Gebruik de bovenstaande vloeistof en over te dragen aan een SW28 buis (of alternatief dat bij 25.000 xg kan worden gecentrifugeerd). Centrifugeer bij 4 ° C bij 25.000 xg gedurende 20 min naar de mitochondriën te verwijderen.
3. Isoleren van lipide druppels door ultracentrifugatie
- Bereid 50 ml 100 mM natriumcarbonaat (M 106 g / mol) buffer (pH 11,5) en 50 ml 60% sucrose (w / w) oplossing. Voeg proteaseremmers aan de natriumcarbonaatbuffer net voor het gebruik en bewaar op ijs.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof van stap 2.6 in een 50 ml centrifugebuis, passentot 20% sacharose en overdracht naar de bodem van een ultracentrifuge buis een SW28 rotor of equivalent. Overlay dichtheid aangepast supernatant met ~ 10 ml ijskoude 100 mM natriumcarbonaat (pH 11,5) en 0,5-1 ml ijskoude HLM aan de buis te vullen.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 130.000 xg gedurende 45 min met behulp SW28 swinging bucket rotor. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0).
- Verzamel de drijflaag, aanpassen tot 10% sucrose en overdracht naar de bodem van een 13,2 ml ultracentrifuge buis een SW41Ti rotor of equivalent. Overlay dichtheid aangepast supernatant met ongeveer 5 ml ijskoude 100 mM natriumcarbonaat (pH 11,5) en 0,5 ml ijskoude HLM.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 274.000 xg gedurende 60 min met behulp SW41Ti swinging bucket rotor. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0) tot een verstoring van de lipide druppel laag minimaliseren.
- Verzamel zorgvuldig de bovenste drijflaag (figuur 2D) metlipide druppels met een pipet 1 ml en herhaal stap 3.4.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 274.000 xg gedurende 30 min met behulp SW41Ti swinging bucket rotor. Laat rotor tot kust tot stilstand (rotor vertraging = 0).
- Het verzamelen van de top witgekleurde drijflaag met lipide druppels met een gebogen Pasteur pipet in drie 1,5 ml buisjes met 100 ul HLM zorgvuldig.
Karakteriseren lipidedruppeltjes fractie (Protocollen 1 en 2)
De terugwinning en zuiverheid van de lipide druppel fractie kan worden geverifieerd door Western Blot gecombineerd met licht of elektronenmicroscopie. Daarnaast kunnen monsters na verschillende centrifugatiestappen worden verzameld en bewaard voor de bepaling zuiveringsrendement. In Western Blotting is het beter om een volume van de druppel lipide fractie die een equivalent van het gehele cellysaat vertegenwoordigt dan vergeleken lipide druppeltjes andere membraanfracties op t vergelijkHij basis van het totale eiwitgehalte 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als de dichtheid gradiënt centrifugatie werkte zoals verwacht, moet de drijflaag vetdruppels bevatten en uitgeput andere organellen tijdens de progressie van de hoge snelheid spins.
Voor Protocol 1, werden Western blots uitgevoerd met marker antilichamen tegen lipide druppeltjes (Erg6p) en organellen die zijn gevonden om met lipide druppeltjes in gist, ER (Dpm1p), mitochondria (Por1p), plasmamembraan (Pma1p) en vacuolen (Vma1p).
Gelijke volumes van de drijflaag van elk drie spins (stappen 3.7, 3.10 en 3.13) werden verzameld, neergeslagen met trichloorazijnzuur (15% uiteindelijke concentratie), en opgelost in water. 13 ml van het cellysaat (figuur 3A, "Lys") en eiwitten prep elke drie rotaties (figuur 3A, "Spin1", "spin2" en "Spin3") werden gescheiden op 12% SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulose membraan, en immunogeblot met organel specific antilichamen. Zoals verwacht, de lipide druppel merkereiwit Erg6p in de drijflaag na elk van de drie rotaties (figuur 3A) is, Por1p niet in de drijflaag na Spin1 (figuur 3A); Vma1p wordt uitgeput van de drijvende laag na spin2 (Figuur 3A) en Dpm1p Pma1p en zijn niet in de drijflaag na Spin3 (Figuur 3A).
Voor Protocol 2, de aanwezigheid van lipide druppeltjes geïsoleerd uit menselijke placenta term villi cellen werd gecontroleerd door kleuring met een neutrale lipide specifieke fluorescentie kleurstof, BODIPY 493/503. De druppels werden vervolgens zichtbaar gemaakt onder een fluorescentiemicroscoop (Figuur 3B). De zuiverheid van de geïsoleerde lipide druppel fracties werd geëvalueerd door Western blotting met merkereiwitten voor lipidedruppeltjes (perilipin 2), ER (calnexine), Golgi (GM130), mitochondria (COX IV) en plasmamembraan (MEK1) (Figuur 3C). De lipide droplets werden de-gelipideerd met koud aceton en de eiwitten werden geëxtraheerd. Gelijke percentages van post-nucleaire supernatant (PNS), de fractie onder de drijflaag van de laatste rotatie (stap 3.6, "Spin4" op figuur 3C), de daaropvolgende wasstap (stap 3.8, "Spin5" op figuur 3C), en de-gelipideerd eiwit prep drijvende lipide druppel laag (stap 3.8, "LD" in figuur 3C) werden gescheiden op 12% SDS-PAGE, overgebracht en immunoblotting met antilichamen aangegeven. Perilipin 2 (ook bekend als ADRP), de lipide druppel eiwit werd gedetecteerd in post-nucleaire supernatant en in geïsoleerde witte drijflaag bevattende lipide druppeltjes. Eiwitten die specifiek zijn voor de plasmamembraan (MEK1) en Golgi (GM130) werden niet gedetecteerd in lipide druppel fracties in beide lagen onder de drijflaag voor Spin4 en Spin5. Zoals eerder gemeld, hebben de ER eiwit calnexin 18,27,28 en een zwakke kleuring van mitochondriale membraan eiwit COX IV Dete geweestcted elders in de lipide druppel fractie 22. Deze resultaten zijn consistent met eerdere rapporten die aantonen dat lipidedruppeltjes interageren met mitochondria in zoogdiercellen 29 en de ER 30,31.
Figuur 1. Cellulaire lipide druppels in kernsplijting gistcellen. (A) Bright veld (BF) en breedveld fluorescentie (TL-licht) beelden van zes representatieve splijtgist cellen waar de lipide druppels worden geverfd met BODIPY 493/503. (B) Bright veld (BF ) en breedveld fluorescentie (TL-licht) beelden van een vertegenwoordiger sferoplast waar de lipide druppels worden geverfd met BODIPY 493/503. Schaal bars zijn 1 mm. Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.
Figuur 2. Drijflaag na dichtheidsgradiënt centrifugatie. Centrifugeerbuizen na (A) Spin1 (stap 3.8), (B) spin2 (stap 3.11), en (C) Spin3 (stap 3.14) van Protocol nr. 1. (D) Centrifugeerbuizen na Spin4 (stap 3.6), van Protocol nr. 2. De drijvende lagen die de lipide druppeltjes zijn aangegeven met pijlen.
Figuur 3. Analyse van de zuiverheid van het geïsoleerde lipide druppels. (A) Western blots van de belangrijkste stappen in het protocol 1. Gelijke volumes van elk eiwit prep (Spin1 - stap 3.7, spin2 - stap 3.10 en Spi n3 - stap 3,13) werd gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulose membranen en immunoblotting met antilichamen voor Erg6p (LD, lipide druppels), Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitochondria), Pma1p (PM, plasmamembraan) en Vma1p (vacuolen). (B) Fase contrast (PC) en breedveld fluorescentie (TL-licht) beelden van BODIPY 493/503-stained lipide druppels die zijn geïsoleerd uit menselijke placenta villous cellen. (C) Western blots van belangrijke stappen in Protocol nr. 2. Equiprocentueel pf PNS (post-nucleaire supernatant), supernatant onder de drijflaag na de laatste draai (Spin4 - stap 3.6), na wassen (Spin5 - stap 3.8), en drijflaag (LD) werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar membranen en immunogeblot met antilichamen voor perilipin 2 (LD, lipide druppels), calnexin (ER), GM130 (Golgi matrix eiwit, Golgi), COX IV (cytochroom c oxidase, MT, mitochondriën), en MEK1 (MAPK kinase, PM, plasma membraan).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen binnen dit protocol
Zorg overeenstemming met media en celdichtheden te zijn bij de groei van gekweekte cellen. Cellular lipidedruppeltjes zijn uniek omdat hun geassocieerde eiwitten zijn sterk afhankelijk van de omgeving waarin de cellen worden gekweekt 17. Daarom moet het medium waarin de cellen worden gekweekt en de dichtheid van de cellen nauwkeurig gecontroleerd vóór lyse.
De eiwitsamenstelling van lipide druppeltjes is een functie van de groeifase van de gist cellen. Minder eiwitten zullen de druppeltjes worden gebonden log groeifase versus stationaire fase. Ook spheroplasting efficiëntie is een functie van de groeifase van de gist cellen. Cellen log groeifase zal hogere opbrengsten van sferoplasten dan cellen in stationaire fase omdat deze laatste beter bestand tegen enzymatische behandeling.
tent ">Zorg ervoor dat zachte technieken te gebruiken om open te breken de cellen. Technieken die breken de gist celwand door enzymatische afbraak de voorkeur boven technieken die de celwand scheuren door uitgeoefende kracht. De laatste werkwijze kan de structurele integriteit van de druppeltjes resulteert in verlies van gebonden eiwitten of lipiden verstoren.
Vermijd bevriezen monsters nadat de cellen zijn gelyseerd. Vorst druppels wordt niet aangeraden omdat de structurele integriteit leidt tot het verlies van gebonden eiwitten of lipiden kunnen beïnvloeden. Vorst kan ook leiden tot de druppeltjes te smelten of fragment 24. Dit kan met name relevant zijn, omdat druppels werden waargenomen fragmenteren of ondergaan splitsing in levende gistcellen 25 en derhalve afbraak van grotere druppels in kleinere mogelijk. Stukken van druppels die fragment het drijfvermogen te verschijnen in de f niet kunnen hebbenloating laag tijdens dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Dit kan kunstmatig verminderen het aantal druppel factoren die worden geïdentificeerd door deze techniek sinds de eiwitsamenstelling van druppel oppervlakken afhankelijk van druppelgrootte 32 zijn.
Zorg ervoor dat de lokalisatie van lipide druppels geassocieerde factoren te testen om lipide druppels. Een van de kenmerken van lipide druppels is dat ze interageren met andere organellen 33-37. Daarom worden deze factoren uit organellen vaak in de lipide druppel fractie. Daarom is het belangrijk om extra technieken opdat deze factoren lokaliseren de druppels. Onderzoeken met een fluorescerend fusie-eiwit gekoppeld aan het eiwit van interesse in cellen waarin het lipide druppels worden gekleurd met een andere fluorescerende merker worden gebruikt om de mate van colocalization 15. Technieken zoals eiwitten correlatie profiling kan worden gebruikt om de zuiverheid van de lipide fractie druppel 15 verder kwantificeren. In die strategie, zijn twee componenten elk gelabeld met verschillende isotopen aminozuren. De eerste component is een bekende lipide druppel factor, en de tweede component is de fractie die wordt geanalyseerd. Vergelijkingen worden dan gemaakt tussen de fractionele locaties van de twee componenten.
Wijzigingen en probleemoplossing
Wijzigingen aan Protocol nr. 1 voor het isoleren van lipide druppels van de gist Saccharomyces cerevisiae worden genoteerd. Merk op dat de maten van lipide druppels sterk kan variëren. Dichtheidsgradiënt centrifugatie snelheid moet worden verhoogd om kleinere druppeltjes te accumuleren in de drijflaag.
Beperkingen van de techniek
Toegang tot een ultracentrifuge met alswinging rotor is essentieel voor de isolatie van cellulaire lipide druppels. Hoewel dit apparaat is standaard in de meeste celbiologie en biochemie laboratoria, het is duur.
Belang van de techniek voor bestaande methoden of andere alternatieve methoden
Zoals hierboven vermeld, is Protocol 1 sluit nauw aan bij het werk van Leber et al.. 6 en deel 1 van Protocol nr. 2 is een wijziging van een eerder gepubliceerde protocol door Petroff et al.. 26
Toepassingen
Lipide druppel isolatie is vooral handig voor de volgende proteomics en lipidomic analyse van gebonden eiwitten, neutrale lipiden en fosfolipiden. Voorraden van lipide druppels geassocieerde eiwitten en lipiden zijn samengesteld 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association award 13SDG14500046 naar PD, een Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. van Tennessee) tot PD, en door de Physicians 'Medisch Onderwijs en Research Foundation (Univ. van Tennessee) award aan JM De auteurs danken Caroline Leplante (Yale Univ.) voor het protocol voor het omzetten splijtgist om sferoplasten; Eric T. Boder (Univ. van Tennessee) voor het gebruik van zijn schudden incubators, tafelblad centrifuge, en Western Blot analyse apparatuur, en het Centrum voor Milieubiotechnologie (Univ. Tennessee) voor het gebruik van hun ultra-centrifuge, Günther Daum voor gist antilichamen (Graz University of Technology, Oostenrijk.), het personeel van de afdeling Obstetrie en Gynaecologie (Univ. Tennessee Medisch Centrum) voor technische bijstand .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
