Summary
To teknikker til isolering cellulære lipiddråber fra 1) gærceller og 2) menneskelige moderkager præsenteres. Det centrale i begge procedurer er densitetsgradientcentrifugering, hvor den resulterende flydende lag, der indeholder de små dråber kan let visualiseres ved øjet, ekstraheret og kvantificeret ved Western blot-analyse for renhed.
Abstract
Lipiddråber er dynamiske organeller, der kan findes i de fleste eukaryote og visse prokaryote celler. Strukturelt dråber består af en kerne af neutrale lipider omgivet af et phospholipid monolag. En af de mest nyttige teknikker i fastlæggelse af de cellulære roller dråber har været proteom identifikation af bundne proteiner, som kan isoleres sammen med de små dråber. Her er to metoder beskrevet at isolere lipiddråber og deres bundne proteiner fra to vidtrækkende eukaryoter: fission gær og menneskelige placenta villøse celler. Selv om begge teknikker har forskelle, den vigtigste metode - densitetsgradientcentrifugering - deles af begge præparater. Det viser den brede anvendelighed af de præsenterede dråber isolation teknikker.
I den første protokol, er gærceller omdannes sfæroplaster ved enzymatisk nedbrydning af deres cellevægge. De resulterende sphæroplaster derefter GENTly lyseret i en løstsiddende homogenisator. Ficoll tilsættes til lysatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres tre gange. Efter den første centrifugering, er lipiddråber lokaliseret til hvid-farvet flydelag af centrifugerør sammen med det endoplasmatiske reticulum (ER), plasmamembranen og vakuoler. To efterfølgende spin anvendes til at fjerne disse tre andre organeller. Resultatet er et lag, der kun har dråber og bundne proteiner.
I den anden protokol, er placenta villøse celler isoleret fra humant sigt moderkager ved enzymatisk behandling med trypsin og DNase I. Cellerne homogeniseres i en løstsiddende homogenisator. Lav hastighed og mellemstore hastighed centrifugeringstrin anvendes til at fjerne ubrudte celler, celleaffald kerner og mitokondrier. Saccharose sættes til homogenatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres for at adskille lipiddråber fra den anden cellular fraktioner.
Renheden af lipiddråber i begge protokoller bekræftes ved Western blot-analyse. Dråben fraktioner fra begge præparationer er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.
Introduction
Cellular lipiddråber er dynamiske organeller, der tjener flere funktioner i celler. De er opbevaring knudepunkter for neutrale lipider, der kan omdannes til energi eller anvendt til phospholipid syntese. Dråberne spiller en central rolle i fysiologiske og patologiske tilstande, herunder atherosklerose, fedme og relaterede metaboliske sygdomme samt infektionssygdomme 1,2. Desuden er de interessante kilder til biodiesel.
Er indhentet mange oplysninger om de cellulære roller lipiddråber fra proteom og lipidomic analyse af dråber oprenset fra vidtrækkende organismer 3. Disse organismer har inkluderet bakterier 4,5, gær 6-11, planter 12,13, nematoder 14, og flyver 15,16. I betragtning af den interesse i rollen lipiddråber i humane metaboliske sygdomme har smådråber også blevet isoleret fra dyrkede dyreceller ogNimal væv. Dyrkede cellelinier har inkluderet 3T3-L1 adipocytter 17, kinesisk hamster ovarie (CHO) K2 celler 18, humane hepatocyes 19,20 og epitelcellelinier 21. Dyrevæv, hvorfra dråber er blevet isoleret har medtaget mus skeletmuskulatur 22, lever 23 og mælkekirtler 23. Som nævnt ovenfor er målet for de fleste dråber isolation undersøgelser er at udføre proteom analyse af de bundne faktorer og lipidomic analyse af neutrale og phospholipider.
Da neutrale lipider - den mest talrige komponent af lipiddråber - er mindre tætte end de fleste andre cellulære materialer, er isolering af dråber traditionelt blevet udført ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering. Denne teknik er kernen i begge preps præsenteres her. Tidligere teknikker 6,24 kombineres og modificeres til en visuel præsentation af isolation af dråber fra dyrkede fission gærcellerog noncultured humane celler opnået fra placenta væv. Målet er at vise den brede anvendelighed af denne teknik ved at vælge to vidt forskellige celletyper som udgangspunkter for dråben isolation. Denne teknik bør være nyttige for dem, der ønsker at isolere dråber fra de fleste organismer.
Protokol 1 beskriver isoleringen af lipiddråber fra fission gær, Schizosaccharomyces pombe, som har været anvendt som en model for at observere dråbedannelse under eukaryot celledeling 25. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet brugt i udstrakt grad som en model organisme for at studere lipid dråber biologi. Protokol 1 er gældende for begge organismer og forskelle i forberedelserne er fremhævet.
Protokol 2 beskriver isolationen af lipiddråber fra placenta villøse celler, som igen er opnået fra human placenta sigt. Densamling af langsigtede moderkager giver en unik mulighed for sikkert og etisk opnå 200-250 g af let tilgængelig humant væv 26, som indeholder et betydeligt antal lipid dråber. Dette er i modsætning til de fleste lipid dråbe isolation arbejde i højere eukaryoter, hvor dråberne stammer fra dyrkede celler. I disse studier er fedtsyrer ofte tilsat til kulturen for at fremme syntesen af neutrale lipider og dermed væksten af dråber. Dette er i modsætning til det arbejde her, hvor lipiddråber dannes under native betingelser i placentavæv.
Renhederne af lipid dråbe fraktioner bestemmes ved Western Blot-analyse under anvendelse af organel markør-antistoffer. Disse to protokoller vil give lipid dråbe fraktioner, der er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Isolating lipiddråber fra (Fission) gærceller
Isolering af dråber fra den populære model organisme spirende gær Saccharomyces cerevisiae er næsten identisk med den følgende protokol 6. Forskelle i præparaterne er noteret.
1.. Voksende gærceller
- Forbered medierne. Kombiner 36 g YE5S pulver per liter dH2O i glasflasker eller dyrkningskolber. Ca. 2 L medier vil være nødvendig. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 20 min. Lad medierne til at afkøle til stuetemperatur. For S. cerevisiae erstatte YE5S med YPD.
- Anbring 10-20 ml af den afkølede YE5S medier i et 250 ml dyrkningskolbe ved hjælp af sterile teknikker. Podes mediet med en lille mængde af gærceller fra en agarplade ved hjælp af en steril træpind eller tilsvarende. Lad cellerne vokse til den ønskede optiske densitet ved 30 ° C. Mål den optiske densitet ved enbølgelængde på 595 nm ved anvendelse af et spektrofotometer.
- Placer de resterende medier i de 2,8 L kolber. Brug ikke mere end 1 L medier per 2,8 L kolbe for at sikre korrekt blanding under cellevækst i rysteinkubator. Det endelige udbytte af våde celler, bør være omkring 10 g for at være i stand til at erhverve nok lipiddråber for proteom og lipidomic analyse.
- Indføre cellerne fra trin 1.2 i de 2,8 L kolber hver med 1 L af medier, der blev udarbejdet i trin 1.1.
- Dyrk cellerne til den ønskede densitet ved 30 ° C.
- Sørg for, at cellerne har lipid dråber. Reserve 1 ml af cellerne. Mål den optiske densitet (OD) af prøven. Tilføj 0,1 ml af en 100 mM stamopløsning af BODIPY 493/503 i ethanol pr OD af celler til prøven. Anbringes 3 ul af prøven mellem et objektglas og et dækglas. Visualisere under et fluorescerende mikroskop med et GFP (Figur 1A).
- Pelletere cellerne fra trin 1,5 ved 4 & #176; C ved 3.800 x g i 10 min. Arbejde i partier afhængigt af kapaciteten af centrifugerørene.
- Hæld YE5S medier og vaske cellerne med en buffer af EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol giver osmotisk støtte.
- Overfør cellerne til et sterilt 50 ml centrifugerør og pelletere cellerne ved 4 ° C ved 2.000 x g i 10 min. Supernatanten fjernes. De våde celler vejer. Resuspender cellerne i 2 ml (EMM + 600 mM sorbitol) buffer per gram celler.
2. Konvertering fission gærceller i sfæroplaster og efterfølgende lysis
- Tilsæt 5 mg hver 1) gær lytisk enzym og 2) gær lysering enzymer fra Trichoderma harzianum per gram af våde celler, der blev vejet i trin 1.9. For S. cerevisiae forøge disse enzymer med den samme mængde af Zymolase.
- Inkuberes cellerne ved 30 ° C under forsigtig rystning ved 100 opm i 60 minutter.
- Kontroller, at sfæroplasterne har lipid droplets. Ved at gentage trin 1.6 (fig. 1B).
3. Densitetsgradientcentrifugering
- Pelletere sfæroplasterne ved centrifugering ved 4 ° C ved 2.000 x g i 5 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten med en plastik overførselspipette.
- Forsigtigt resuspendere pelleterede sfæroplaster med iskold 10 mM Tris-HCI, 600 mM sorbitol og 200 pM EDTA. Husk på, at sfæroplasterne er meget skrøbelige.
- Pelleter sfæroplasterne igen med de samme indstillinger som i trin 3.1. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender sfæroplasterne med en plastik overførselspipette i 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCI og 200 uM EDTA ved en koncentration på 2 ml / g-celler.
- Overfør resuspenderede sfæroplaster en glashomogenisator og forsigtigt homogeniseres på is, 20-30 slag med løstsiddende pistil af glashomogenisator.
- Overfør de lyserede sfæroplaster til centrifugerør og overlay med samme volume 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCI og 200 pM EDTA-puffer. Vælg det antal centrifugerør at bruge, så hvert rør er omkring to-tredjedele fuld.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1,5 timer i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillad rotor til kyst til et stop (rotor deceleration = 0).
- Overføre forsigtigt øverste flydende hvide lag (figur 2A), der indeholder de små dråber til en ny centrifugeglas (r) ved hjælp af enten en pipette eller en bøjet Pasteur-pipette. Tilføj nok volumen på mindst 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCI og 200 pM EDTA-puffer til prøven, så det fylder omtrent en tredjedel af centrifugeglasset.
- Tilsæt svarer til mængden af 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCI og 200 pM EDTA-puffer til toppen af prøven (r) i den nye centrifugeglas (r). Efter tilsætning af denne buffer rørene bør være omkring to-tredjedele fyldt.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1 time i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillad rotor til kyst til et stop (rOTOR deceleration = 0).
- Overføre forsigtigt øverste flydende hvide lag (Figur 2B), der indeholder de små dråber til en ny centrifugeglas (r) ved hjælp af enten en pipette eller en bøjet Pasteur-pipette. Tilføj 600 mM sorbitol, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCI og 200 pM EDTA-puffer til prøven, så det fylder omkring en tredjedel af centrifugeglasset.
- Tilsæt ækvivalent volumen på 250 mM sorbitol, 10 mM Tris-HCI og 200 pM EDTA-puffer til toppen af prøven (r) i den nye centrifugeglas (r). Efter tilsætning af denne buffer rørene bør være omkring to-tredjedele fyldt.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1 time i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillad rotor til kyst til et stop (rotor deceleration = 0).
- Overfør øverste hvide lag (figur 2C), som bør kun indeholde de lipid dråber og bundne proteiner, til dialyseslange, og dialyse O / N i 10 mM Tris-HCl og 200 uM EDTA buffer til at eliminere Ficoll.
Moderkager blev indsamlet fra raske kvinder med singleton graviditeter gennemgår elektiv kejsersnit levering forud for udbrud af spontan fødsel ved sigt. Emner gav skriftligt, informeret samtykke til indsamling af deres moderkage. Indsamling, og efterfølgende brug af moderkager blev udført med godkendelse fra University of Tennessee og University of Tennessee Graduate School of Medicine i Knoxville Institutional Review Board (# 8757B og # 3338, henholdsvis).
1.. Isolering af humane placenta villøse celler
Del 1 i protokollen er en ændring af en tidligere publicerede protokol ved Petroff et al. 26.
Forbered følgende løsninger:
- NaCI (1 L): opløses 9 g NaCl (M 58.4 g / mol) i dH2O til opnåelse af en 1 N opløsning. Filtersteriliser (0,2; Um membran).
- 10x Hanks balancerede saltopløsning (10x HBSS) (1 L): 4 g KCl (M 74.5 g / mol), 0,6 g KH 2PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCI (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-glucose (M 180,16 g / mol). Opløses hver af bestanddelene i dH2O til opnåelse af en 1 N opløsning. Filtersteriliser (0,2 um membran).
- Enzymfordøjelse puffer (0,6 ml): kombinere 70 ml 10x HBSS med 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES, og 266,1 ml dH2O, filter steriliseres (0,2 um membran). Opbevares ved 4 ° C.
- DNase I: lige før brug, tilsættes 5 ml steril 0,9% NaCl til et hætteglas med DNase. Hold på is indtil brug eller opbevares ved -20 ° C.
- Forberedelse placenta til dissektion
- Opnå en human placenta og processen så tæt på leveringstidspunktet som muligt. Brug en forseglet beholder, såsom en køler til at transportere placenta. Udvis altid forsigtighed når håndLing menneskelige biologiske materialer.
- I det biologiske sikkerhed hætte, overføre moderkagen til en steril autoklaverbar beholder, og omhyggeligt vaske blod fra moderkagen og membraner ved hjælp af sterilt 0,9% NaCl (saltvand) løsning. Kassér blodige saltvand i 1 L bæger som flydende biologisk affald.
- Placer moderkagen på et sterilt felt, med den glatte overflade bærer navlestrengen opad. Med skarpe, fine-punkts saks og pincet fjerne fosterhinder og navlestreng.
- Vend moderkagen over, så den maternelle overflade (ru overflade) vender opad. Fjern det overliggende rodklumpen væv omkring 3 mm fra overfladen.
- Dissekere moderkagen
- Dissekere en cotyledon ad gangen undgå chorion plade. Saml villous væv i et 250 ml bæger med saltvand.
- Skyl væv flere gange i et separat bæger med 0,9% NaCl ved hvirvlende med en pincet, ved hjælp af 1 L bæger til flydende affald.
- Overfør en cotyledon ad gangen til en 150 mm petriskål. Hold med en pincet og skrabe væv med barberblad fra fartøjer på petriskål. Anbring skrabet væv i separate bægerglas indeholdende 0,9% NaCl. Gentag for alle vævsstykkerne.
- Overfør lille del af det væv, celledissocieringsopløsningen sigte og skylles med 0,9% NaCI udstrakt indtil eluatet bliver klar. Gentag for alle væv.
- Efter skylning af skrabet væv i celledissociering sigte, dræne det overskydende væske og vægt.
På dette tidspunkt kan vævet opbevares O / N i en steril Erlenmeyerkolbe ved 4 ° C i DMEM.
- Enzymatisk fordøjelse af placentavævet
- Forbered vævsfordøjelse blanding: 100 ml forvarmet enzymfortyndingsbuffer, 1 ml DNase I og 20 ml 2,5% 10x trypsin.
- Opdel væv, overføre 60 g fra den totale indsamlede væv (normalt omkring 250-300 g) til en 500 ml steril Erlenmeyerkolbe.
- Indsamling af dissocierede celler
- Efter de første 45 min dissociation, sætte fordøjelsen kolben på en tilt indtil væv afregner.
- Saml supernatanten, pas på ikke at indsamle udissocierede væv. Tilføj en lige mængde HBSS til den indsamlede supernatant og overføres til sterile 15 ml centrifugerør. For yderligere portioner udissocieret væv, gentag proceduren fra trin 3.2 med udissocieret væv.
- Centrifugeres homogenatet ved 4 ° C ved 1.000 x g i 15 min.
- For hvert parti, efter centrifugering, aspireres supernatanten uden at forstyrre bundfaldet. Placenta villøse celler overvejende i den hvide del af pelleten overliggende de røde blodlegemer.
- Overfør villøse celler (hvide del af pillen) til en sterile 50 ml konisk centrifugerør og holde på is.
- Efter indsamling af celler fra alle tre fordøjelse faser filtreres suspensionen ved anvendelse af en 100 um nylon cellefilter indsat i toppen af en steril 50 ml konisk centrifugerør. Hvis filtrering af cellesuspensionen langsommere, løftes opad på filteret for at trække et vakuum i røret.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 1.000 x g i 10 min. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet.
2. Homogenisering placenta villøse celler
- Før start med isolation proces, fremstilles 50 ml hypotonisk lysis Medium (HLM) indeholdende 20 mM Tris-HCI, pH 7,4 og 1 mM EDTA. Tilføj proteasehæmmere til HLM lige før brug, og holder mediet på is.
- I biologiske sikkerhed hætte, tilsættes 4 gange cellepelleten volumen iskold HLM til cellerne. Forsigtigt og grundigt at opblande cellerne ved pipettering cellerne up-end-ned ved hjælp af en 10 ml pipette.
- Inkubér suspenderede celler på is i 10 min.
- Overfør celler til den Dounce homogenisator, som bør være på is. Langsomt homogenisere cellerne ved at anvende 20-25 blide strøg med løstsiddende pistil af homogenisatoren.
- Centrifuger cellelysatet ved 4 ° C ved 3.000 x g i 10 minutter til fjernelse af ubrudte celler, cellerester og kerner.
- Saml supernatanten og overføre til en SW28 rør (eller alternativ, der kan centrifugeres ved 25.000 xg). Der centrifugeres ved 4 ° C ved 25.000 x g i 20 min for at fjerne mitochondrier.
3. Isolerende lipiddråber ved ultracentrifugering
- Forbered 50 ml 100 mM natriumcarbonat (M 106 g / mol) puffer (pH 11,5) og 50 ml 60% sucrose (w / w) opløsning. Tilføj proteasehæmmere til natriumcarbonatpuffer lige før brug og opbevar på is.
- Saml supernatanten fra trin 2.6 i et 50 ml centrifugeglas, justere20% saccharose og overførsel ind i bunden af et ultracentrifugerør en SW28 rotor, eller tilsvarende. Overlay massefylde justeret supernatanten med ~ 10 ml iskold 100 mM natriumcarbonat-puffer (pH 11,5) og 0,5-1 ml iskold HLM at fylde røret.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 130.000 x g i 45 minutter ved hjælp af SW28 swinging bucket rotor. Tillad rotor til kyst til et stop (rotor deceleration = 0).
- Saml flydelag, justeres til 10% sucrose og overføre ind i bunden af en 13,2 ml ultracentrifugerør for en SW41Ti rotor, eller tilsvarende. Overlay massefylde justeret supernatanten med omkring 5 ml iskold 100 mM natriumcarbonat-puffer (pH 11,5) og 0,5 ml iskold HLM.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 274.000 x g i 60 min ved anvendelse SW41Ti svingende spand rotor. Tillad rotor til kyst til et stop (rotor deceleration = 0) for at minimere forstyrrelse af lipid dråber lag.
- Samle det øverste flydende lag (figur 2D), der indeholder forsigtigtlipiddråber med en 1 ml pipette og gentag trin 3.4.
- Der centrifugeres ved 4 ° C ved 274.000 x g i 30 min ved anvendelse SW41Ti svingende spand rotor. Tillad rotor til kyst til et stop (rotor deceleration = 0).
- Indsamle forsigtigt den øverste hvide-farvet flydelag indeholdende lipiddråber med en bøjet Pasteur pipette i tre 1,5 ml rør indeholdende 100 ul HLM.
Karakteriserer lipiddråber fraktion (protokol 1 og 2)
Opsvinget og renheden af fraktionen lipid dråber kan verificeres ved Western Blot kombineret med lys eller elektronmikroskopi. Desuden kan portioner efter forskellige centrifugeringstrin blive indsamlet og bevaret til bestemmelse rensning effektivitet. I western blotting, er det mere hensigtsmæssigt at sammenligne et volumen af lipid dråber fraktion, der repræsenterer en ækvivalent af helcellelysat end at sammenligne lipiddråber til andre membran fraktioner på than grundlag af den samlede proteinindhold 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis densitetsgradientcentrifugering arbejdede som forventet, bør den flydelag indeholde lipiddråber og være udtømt andre organeller i hele udviklingen af højhastigheds-spins.
For protokol 1 blev Western blots udført med markør antistoffer mod lipid dråber (Erg6p), og organeller der er blevet fundet at interagere med lipid dråber i gær, ER (Dpm1p), mitochondrier (Por1p), plasmamembranen (Pma1p), og vacuoles (Vma1p).
Lige dele af de flydelag af hver tre spins (trin 3,7, 3,10 og 3,13) er blevet opsamlet, fældet med trichloreddikesyre (15% slutkoncentration), og opløst i vand. 13 ml af cellelysat (figur 3A, "Lys") og protein prep af hver tre spins (figur 3A, "Spin1", "Spin2" og "Spin3"), blev separeret på 12% SDS-PAGE, overført til nitrocellulose membran, og immunoblottet med organel speciFIC antistoffer. Som forventet, lipid dråber markørproteinet Erg6p er til stede i den flydende lag efter hver af de tre spins (figur 3A), Por1p er ikke til stede i den flydende lag efter Spin1 (figur 3A), Vma1p er opbrugt fra den flydende lag efter Spin2 (figur 3A) og Dpm1p og Pma1p ikke er til stede i den flydende lag efter Spin3 (figur 3A).
For protokol nr. 2 blev tilstedeværelsen af lipid dråber isoleret fra menneskelig sigt placenta villøse celler verificeret ved farvning med et neutralt lipid specifik fluorescens farvestof, BODIPY 493/503. Dråberne blev derefter visualiseret under et fluorescensmikroskop (figur 3B). Renheden af de isolerede lipid dråbe fraktioner blev vurderet ved Western blotting med markørproteiner til lipiddråber (perilipin 2), ER (calnexin) Golgi (GM130), mitochondrier (COX IV) og plasmamembranen (MEK1) (figur 3C). Lipid droplets blev de-lipiderede med kold acetone og proteiner blev udvundet. Lige procenter af post-nukleare supernatant (PNS), fraktionen under flydelag af sidste centrifugering (trin 3.6, "Spin4" på figur 3C), den efterfølgende vask trin (trin 3.8, "Spin5" på figur 3C), og de-lipideret protein prep flydende lipid dråbe lag (trin 3.8, "LD" på figur 3C) blev separeret på 12% SDS-PAGE, overført og immunblottet med angivne antistoffer. Perilipin 2 (også kendt som ADRP), lipid-dråbe-protein blev detekteret i post-nukleare supernatant og i isolerede hvid flydende lag indeholdende lipiddråber. Proteiner er specifikke for plasmamembranen (MEK1) og Golgi (GM130) blev ikke fundet i lipid dråbe fraktioner i begge lag under flydelag for Spin4 og Spin5. Som tidligere rapporteret, har ER protein calnexin 18,27,28 og en svag farvning af mitokondrielle membran protein COX IV været DETEcted andetsteds i lipid dråbe fraktion 22. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at lipiddråber interagere med mitokondrier i pattedyrceller 29 og med ER 30,31.
Figur 1. Lipid dråber i fission gærceller. (A) Bright felt (BF) og bredt felt fluorescens (Fluor.) billeder af seks repræsentative fission gærceller hvor lipiddråber er farvet med BODIPY 493/503. (B) Bright felt (BF ) og bredt felt fluorescens (Fluor.) billeder af et repræsentativt spheroplast hvor lipiddråber er farvet med BODIPY 493/503. Skalapanelerne er 1 mm. Klik her for at se en større version of dette tal.
Figur 2. Flydelag efter densitetsgradientcentrifugering. Centrifugerør efter (A) Spin1 (trin 3.8), (B) Spin2 (trin 3.11), og (C) Spin3 (trin 3.14), i protokol 1. (D) Centrifugerør efter Spin4 (trin 3.6), i protokol 2. De flydende lag indeholdende lipiddråber er angivet med pile.
Figur 3. Analyse af renheden af de isolerede lipiddråber. (A) Western blots af de vigtigste trin i protokol 1. Lige mængder af hvert protein prep (Spin1 - trin 3.7, Spin2 - trin 3.10, og Spi n3 - trin 3.13) blev separeret ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner og immunblottet med antistoffer for Erg6p (LD, lipiddråber) Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitokondrier), Pma1p (PM, plasmamembranen) og Vma1p (vacuoles). (B) Fasekontrast (PC) og bredt felt fluorescens (Fluor.) billeder af BODIPY 493/503-stained lipiddråber, som er blevet isoleret fra humane placenta villøse celler. (C) Western blots af vigtige skridt i protokol 2. Logaritmisk pf PNS (post nukleare supernatant), supernatant under flydelag efter den sidste centrifugering (Spin4 - trin 3.6), efterfølgende vask (Spin5 - trin 3.8), og flydelag (LD) blev adskilt ved SDS-Page, overført til membraner og immunoblottet med antistoffer til perilipin 2 (LD, lipiddråber), calnexin (ER), GM130 (Golgi matrixprotein, Golgi), COX IV (cytochrom c oxidase, MT, mitokondrier), og MEK1 (MAPK kinase, PM, plasma membran).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i denne protokol
Sørg for at være i overensstemmelse med medier og celletætheder under væksten af dyrkede celler. Cellular lipiddråber er unikke i, at deres associerede proteiner er meget afhængige af den miljø, hvor cellerne dyrkes 17. Derfor skal de medier, hvori cellerne dyrkes, og tætheden af cellerne overvåges nøje før lysering.
Proteinsammensætningen lipiddråber er en funktion af vækstfasen af gærceller. Færre proteiner vil blive bundet til dråberne i log vækstfase kontra stationær fase. Også spheroplasting effektivitet er en funktion af vækstfasen af gærceller. Celler i log-vækstfase vil have højere udbytter af sfæroplaster end celler i stationær fase, fordi sidstnævnte er mere modstandsdygtige over for enzymatisk behandling.
telt ">Sørg for at bruge blide teknikker til at bryde åbne cellerne. Teknikker, der nedbryder gærcellemembraner ved enzymatisk fordøjelse er foretrukket frem for teknikker, der briste cellevæggen gennem anvendt kraft. Sidstnævnte metode kan forstyrre den strukturelle integritet af dråberne, hvilket resulterer i tab af bundne proteiner eller lipider.
Undgå nedfrysning prøver efter cellerne er blevet lyseret. Er frysning dråber ikke anbefales, da det kan påvirke deres strukturelle integritet resulterer i tab af bundet protein eller lipider. Frysning kan også forårsage dråberne at smelte eller fragment 24. Dette kan især være relevant, idet dråber er blevet observeret til at fragmentere eller undergå fission i levende gærceller 25 og dermed opdeling af større dråber i mindre er mulig. Stykker af dråber, der fragment har måske ikke den opdrift til at vises i floating lag under densitetsgradientcentrifugering. Dette kan kunstigt reducere antallet af dråber faktorer, der vil blive identificeret ved denne teknik, da proteinsammensætningen af dråber overflader kan være en funktion af dråbestørrelse 32.
Sørg for at teste lokalisering af lipid dråber associerede faktorer lipiddråber. Et af kendetegnene ved lipiddråber er, at de interagerer med andre organeller 33-37. Derfor er faktorer fra disse organeller ofte fundet i fraktion lipid dråbe. Derfor er det vigtigt at anvende yderligere teknikker til at sikre, at disse faktorer lokalisere dråberne. Studier med en fluorescerende fusionsprotein bundet til proteinet af interesse i celler, hvor lipiddråber er farvet med en anden fluorescerende markør bør anvendes til at bestemme omfanget af colokalisering 15. Teknikker såsom protein korrelation profiling kan anvendes til yderligere kvantificere renheden af lipid dråbe fraktion 15. I denne strategi, er to komponenter hver mærket med forskellige isotop-holdige aminosyrer. Den første komponent er en kendt lipid dråbe faktor, og den anden komponent er den fraktion, der bliver analyseret. Sammenligninger foretages derefter mellem fraktioneret placeringer af de to komponenter.
Ændringer og fejlfinding
Ændringer til protokol nr. 1 til isolering lipiddråber fra den spirende gæren Saccharomyces cerevisiae er noteret. Bemærk, at størrelsen af lipiddråber kan variere meget. Kan være nødvendigt at øges for mindre dråber at ophobe sig i flydelag densitetsgradientcentrifugering hastigheder.
Begrænsninger af teknikken
Adgang til en ultracentrifuge med såflagrer spandrotor er afgørende for isoleringen af cellulære lipiddråber. Selv om dette udstyr er standard i de fleste cellebiologi og biokemiske laboratorier, er det dyrt.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende metoder eller andre alternative metoder
Som nævnt ovenfor er protokol 1 nøje baseret på arbejdet i Leber et al. 6 og del 1 i protokol nr. 2 er en ændring af en tidligere publicerede protokol ved Petroff et al. 26.
Ansøgninger
Lipid dråbe isolation er mest nyttig til efterfølgende proteom og lipidomic analyse af bundne proteiner, neutrale lipider og phospholipider. Opgørelser af lipid dråbe associerede proteiner og lipider er blevet udarbejdet 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association pris 13SDG14500046 til PD, en Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) til PD, og af Læger for Medicinsk Uddannelse og Forskning Foundation (Univ. of Tennessee) pris til JM Forfatterne takker Caroline Leplante (Yale Univ..) til protokollen til konvertering fission gær til sfæroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) for brugen af hans rystende inkubatorer, bordplade centrifuge og Western Blot-analyse udstyr og Center for Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) for anvendelsen af deres ultra-centrifuge, Günther Daum for gær-antistoffer (Graz Univ. of Technology, Østrig.), personalet i Institut for Obstetrik og Gynækologi (Univ. Tennessee Medical Center) til teknisk bistand .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R.
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M.
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
