Isolering af Cellular lipiddråber: To oprensningsteknikker start fra gærceller og menneskelige moderkager
Summary
To teknikker til isolering cellulære lipiddråber fra 1) gærceller og 2) menneskelige moderkager præsenteres. Det centrale i begge procedurer er densitetsgradientcentrifugering, hvor den resulterende flydende lag, der indeholder de små dråber kan let visualiseres ved øjet, ekstraheret og kvantificeret ved Western blot-analyse for renhed.
Abstract
Lipiddråber er dynamiske organeller, der kan findes i de fleste eukaryote og visse prokaryote celler. Strukturelt dråber består af en kerne af neutrale lipider omgivet af et phospholipid monolag. En af de mest nyttige teknikker i fastlæggelse af de cellulære roller dråber har været proteom identifikation af bundne proteiner, som kan isoleres sammen med de små dråber. Her er to metoder beskrevet at isolere lipiddråber og deres bundne proteiner fra to vidtrækkende eukaryoter: fission gær og menneskelige placenta villøse celler. Selv om begge teknikker har forskelle, den vigtigste metode – densitetsgradientcentrifugering – deles af begge præparater. Det viser den brede anvendelighed af de præsenterede dråber isolation teknikker.
I den første protokol, er gærceller omdannes sfæroplaster ved enzymatisk nedbrydning af deres cellevægge. De resulterende sphæroplaster derefter GENTly lyseret i en løstsiddende homogenisator. Ficoll tilsættes til lysatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres tre gange. Efter den første centrifugering, er lipiddråber lokaliseret til hvid-farvet flydelag af centrifugerør sammen med det endoplasmatiske reticulum (ER), plasmamembranen og vakuoler. To efterfølgende spin anvendes til at fjerne disse tre andre organeller. Resultatet er et lag, der kun har dråber og bundne proteiner.
I den anden protokol, er placenta villøse celler isoleret fra humant sigt moderkager ved enzymatisk behandling med trypsin og DNase I. Cellerne homogeniseres i en løstsiddende homogenisator. Lav hastighed og mellemstore hastighed centrifugeringstrin anvendes til at fjerne ubrudte celler, celleaffald kerner og mitokondrier. Saccharose sættes til homogenatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres for at adskille lipiddråber fra den anden cellular fraktioner.
Renheden af lipiddråber i begge protokoller bekræftes ved Western blot-analyse. Dråben fraktioner fra begge præparationer er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.
Introduction
Cellular lipiddråber er dynamiske organeller, der tjener flere funktioner i celler. De er opbevaring knudepunkter for neutrale lipider, der kan omdannes til energi eller anvendt til phospholipid syntese. Dråberne spiller en central rolle i fysiologiske og patologiske tilstande, herunder atherosklerose, fedme og relaterede metaboliske sygdomme samt infektionssygdomme 1,2. Desuden er de interessante kilder til biodiesel.
Er indhentet mange oplysninger om de cellulære roller lipiddråber fra proteom og lipidomic analyse af dråber oprenset fra vidtrækkende organismer 3. Disse organismer har inkluderet bakterier 4,5, gær 6-11, planter 12,13, nematoder 14, og flyver 15,16. I betragtning af den interesse i rollen lipiddråber i humane metaboliske sygdomme har smådråber også blevet isoleret fra dyrkede dyreceller ogNimal væv. Dyrkede cellelinier har inkluderet 3T3-L1 adipocytter 17, kinesisk hamster ovarie (CHO) K2 celler 18, humane hepatocyes 19,20 og epitelcellelinier 21. Dyrevæv, hvorfra dråber er blevet isoleret har medtaget mus skeletmuskulatur 22, lever 23 og mælkekirtler 23. Som nævnt ovenfor er målet for de fleste dråber isolation undersøgelser er at udføre proteom analyse af de bundne faktorer og lipidomic analyse af neutrale og phospholipider.
Da neutrale lipider – den mest talrige komponent af lipiddråber – er mindre tætte end de fleste andre cellulære materialer, er isolering af dråber traditionelt blevet udført ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering. Denne teknik er kernen i begge preps præsenteres her. Tidligere teknikker 6,24 kombineres og modificeres til en visuel præsentation af isolation af dråber fra dyrkede fission gærcellerog noncultured humane celler opnået fra placenta væv. Målet er at vise den brede anvendelighed af denne teknik ved at vælge to vidt forskellige celletyper som udgangspunkter for dråben isolation. Denne teknik bør være nyttige for dem, der ønsker at isolere dråber fra de fleste organismer.
Protokol 1 beskriver isoleringen af lipiddråber fra fission gær, Schizosaccharomyces pombe, som har været anvendt som en model for at observere dråbedannelse under eukaryot celledeling 25. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet brugt i udstrakt grad som en model organisme for at studere lipid dråber biologi. Protokol 1 er gældende for begge organismer og forskelle i forberedelserne er fremhævet.
Protokol 2 beskriver isolationen af lipiddråber fra placenta villøse celler, som igen er opnået fra human placenta sigt. Densamling af langsigtede moderkager giver en unik mulighed for sikkert og etisk opnå 200-250 g af let tilgængelig humant væv 26, som indeholder et betydeligt antal lipid dråber. Dette er i modsætning til de fleste lipid dråbe isolation arbejde i højere eukaryoter, hvor dråberne stammer fra dyrkede celler. I disse studier er fedtsyrer ofte tilsat til kulturen for at fremme syntesen af neutrale lipider og dermed væksten af dråber. Dette er i modsætning til det arbejde her, hvor lipiddråber dannes under native betingelser i placentavæv.
Renhederne af lipid dråbe fraktioner bestemmes ved Western Blot-analyse under anvendelse af organel markør-antistoffer. Disse to protokoller vil give lipid dråbe fraktioner, der er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i denne protokol
Sørg for at være i overensstemmelse med medier og celletætheder under væksten af dyrkede celler. Cellular lipiddråber er unikke i, at deres associerede proteiner er meget afhængige af den miljø, hvor cellerne dyrkes 17. Derfor skal de medier, hvori cellerne dyrkes, og tætheden af cellerne overvåges nøje før lysering.
Proteinsammensætningen lipiddråber er en funkti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association pris 13SDG14500046 til PD, en Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) til PD, og af Læger for Medicinsk Uddannelse og Forskning Foundation (Univ. of Tennessee) pris til JM Forfatterne takker Caroline Leplante (Yale Univ..) til protokollen til konvertering fission gær til sfæroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) for brugen af hans rystende inkubatorer, bordplade centrifuge og Western Blot-analyse udstyr og Center for Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) for anvendelsen af deres ultra-centrifuge, Günther Daum for gær-antistoffer (Graz Univ. of Technology, Østrig.), personalet i Institut for Obstetrik og Gynækologi (Univ. Tennessee Medical Center) til teknisk bistand .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
