Summary

Isolering af Cellular lipiddråber: To oprensningsteknikker start fra gærceller og menneskelige moderkager

Published: April 01, 2014
doi:

Summary

To teknikker til isolering cellulære lipiddråber fra 1) gærceller og 2) menneskelige moderkager præsenteres. Det centrale i begge procedurer er densitetsgradientcentrifugering, hvor den resulterende flydende lag, der indeholder de små dråber kan let visualiseres ved øjet, ekstraheret og kvantificeret ved Western blot-analyse for renhed.

Abstract

Lipiddråber er dynamiske organeller, der kan findes i de fleste eukaryote og visse prokaryote celler. Strukturelt dråber består af en kerne af neutrale lipider omgivet af et phospholipid monolag. En af de mest nyttige teknikker i fastlæggelse af de cellulære roller dråber har været proteom identifikation af bundne proteiner, som kan isoleres sammen med de små dråber. Her er to metoder beskrevet at isolere lipiddråber og deres bundne proteiner fra to vidtrækkende eukaryoter: fission gær og menneskelige placenta villøse celler. Selv om begge teknikker har forskelle, den vigtigste metode – densitetsgradientcentrifugering – deles af begge præparater. Det viser den brede anvendelighed af de præsenterede dråber isolation teknikker.

I den første protokol, er gærceller omdannes sfæroplaster ved enzymatisk nedbrydning af deres cellevægge. De resulterende sphæroplaster derefter GENTly lyseret i en løstsiddende homogenisator. Ficoll tilsættes til lysatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres tre gange. Efter den første centrifugering, er lipiddråber lokaliseret til hvid-farvet flydelag af centrifugerør sammen med det endoplasmatiske reticulum (ER), plasmamembranen og vakuoler. To efterfølgende spin anvendes til at fjerne disse tre andre organeller. Resultatet er et lag, der kun har dråber og bundne proteiner.

I den anden protokol, er placenta villøse celler isoleret fra humant sigt moderkager ved enzymatisk behandling med trypsin og DNase I. Cellerne homogeniseres i en løstsiddende homogenisator. Lav hastighed og mellemstore hastighed centrifugeringstrin anvendes til at fjerne ubrudte celler, celleaffald kerner og mitokondrier. Saccharose sættes til homogenatet for at give en densitetsgradient, og blandingen centrifugeres for at adskille lipiddråber fra den anden cellular fraktioner.

Renheden af ​​lipiddråber i begge protokoller bekræftes ved Western blot-analyse. Dråben fraktioner fra begge præparationer er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.

Introduction

Cellular lipiddråber er dynamiske organeller, der tjener flere funktioner i celler. De er opbevaring knudepunkter for neutrale lipider, der kan omdannes til energi eller anvendt til phospholipid syntese. Dråberne spiller en central rolle i fysiologiske og patologiske tilstande, herunder atherosklerose, fedme og relaterede metaboliske sygdomme samt infektionssygdomme 1,2. Desuden er de interessante kilder til biodiesel.

Er indhentet mange oplysninger om de cellulære roller lipiddråber fra proteom og lipidomic analyse af dråber oprenset fra vidtrækkende organismer 3. Disse organismer har inkluderet bakterier 4,5, gær 6-11, planter 12,13, nematoder 14, og flyver 15,16. I betragtning af den interesse i rollen lipiddråber i humane metaboliske sygdomme har smådråber også blevet isoleret fra dyrkede dyreceller ogNimal væv. Dyrkede cellelinier har inkluderet 3T3-L1 adipocytter 17, kinesisk hamster ovarie (CHO) K2 celler 18, humane hepatocyes 19,20 og epitelcellelinier 21. Dyrevæv, hvorfra dråber er blevet isoleret har medtaget mus skeletmuskulatur 22, lever 23 og mælkekirtler 23. Som nævnt ovenfor er målet for de fleste dråber isolation undersøgelser er at udføre proteom analyse af de bundne faktorer og lipidomic analyse af neutrale og phospholipider.

Da neutrale lipider – den mest talrige komponent af lipiddråber – er mindre tætte end de fleste andre cellulære materialer, er isolering af dråber traditionelt blevet udført ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering. Denne teknik er kernen i begge preps præsenteres her. Tidligere teknikker 6,24 kombineres og modificeres til en visuel præsentation af isolation af dråber fra dyrkede fission gærcellerog noncultured humane celler opnået fra placenta væv. Målet er at vise den brede anvendelighed af denne teknik ved at vælge to vidt forskellige celletyper som udgangspunkter for dråben isolation. Denne teknik bør være nyttige for dem, der ønsker at isolere dråber fra de fleste organismer.

Protokol 1 beskriver isoleringen af lipiddråber fra fission gær, Schizosaccharomyces pombe, som har været anvendt som en model for at observere dråbedannelse under eukaryot celledeling 25. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet brugt i udstrakt grad som en model organisme for at studere lipid dråber biologi. Protokol 1 er gældende for begge organismer og forskelle i forberedelserne er fremhævet.

Protokol 2 beskriver isolationen af ​​lipiddråber fra placenta villøse celler, som igen er opnået fra human placenta sigt. Densamling af langsigtede moderkager giver en unik mulighed for sikkert og etisk opnå 200-250 g af let tilgængelig humant væv 26, som indeholder et betydeligt antal lipid dråber. Dette er i modsætning til de fleste lipid dråbe isolation arbejde i højere eukaryoter, hvor dråberne stammer fra dyrkede celler. I disse studier er fedtsyrer ofte tilsat til kulturen for at fremme syntesen af ​​neutrale lipider og dermed væksten af ​​dråber. Dette er i modsætning til det arbejde her, hvor lipiddråber dannes under native betingelser i placentavæv.

Renhederne af lipid dråbe fraktioner bestemmes ved Western Blot-analyse under anvendelse af organel markør-antistoffer. Disse to protokoller vil give lipid dråbe fraktioner, der er egnet til efterfølgende proteom og lipidomic analyse.

Protocol

1.. Isolating lipiddråber fra (Fission) gærceller Isolering af dråber fra den populære model organisme spirende gær Saccharomyces cerevisiae er næsten identisk med den følgende protokol 6. Forskelle i præparaterne er noteret. 1.. Voksende gærceller Forbered medierne. Kombiner 36 g YE5S pulver per liter dH2O i glasflasker eller dyrkningskolber. Ca. 2 L medier vil være nødvendig. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 20 …

Representative Results

Hvis densitetsgradientcentrifugering arbejdede som forventet, bør den flydelag indeholde lipiddråber og være udtømt andre organeller i hele udviklingen af ​​højhastigheds-spins. For protokol 1 blev Western blots udført med markør antistoffer mod lipid dråber (Erg6p), og organeller der er blevet fundet at interagere med lipid dråber i gær, ER (Dpm1p), mitochondrier (Por1p), plasmamembranen (Pma1p), og vacuoles (Vma1p). Lige dele af de flydelag af hve…

Discussion

Kritiske trin i denne protokol

Sørg for at være i overensstemmelse med medier og celletætheder under væksten af dyrkede celler. Cellular lipiddråber er unikke i, at deres associerede proteiner er meget afhængige af den miljø, hvor cellerne dyrkes 17. Derfor skal de medier, hvori cellerne dyrkes, og tætheden af ​​cellerne overvåges nøje før lysering.

Proteinsammensætningen lipiddråber er en funkti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association pris 13SDG14500046 til PD, en Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) til PD, og ​​af Læger for Medicinsk Uddannelse og Forskning Foundation (Univ. of Tennessee) pris til JM Forfatterne takker Caroline Leplante (Yale Univ..) til protokollen til konvertering fission gær til sfæroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) for brugen af ​​hans rystende inkubatorer, bordplade centrifuge og Western Blot-analyse udstyr og Center for Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) for anvendelsen af ​​deres ultra-centrifuge, Günther Daum for gær-antistoffer (Graz Univ. of Technology, Østrig.), personalet i Institut for Obstetrik og Gynækologi (Univ. Tennessee Medical Center) til teknisk bistand .

Materials

PROTOCOL #1: 
1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts
Edinburgh Minimal Media (EMM) Sunrise Science Products 2005
Yeast extract with 5 supplements (YE5S) Sunrise Science Products 2011 YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.
YPD powder Sunrise Science Products 1875 For S. cerevisiae 
Sorbitol Fisher Scientific BP439
Yeast Lytic Enzyme MP Biomedicals 215352610
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum Sigma-Aldrich L1412
Zymolayse-20T Sunrise Science Products N0766391 For S. cerevisiae 
BODIPY 493/503 Invitrogen D-3922
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 137115AM
1 liter glass bottle
250 ml flask
2.8 liter flasks
2. Yeast lipid droplet isolation
Tris-HCl Fisher Scientific BP153
EDTA Fisher Scientific BP120
Ficoll 400 Fisher Scientific BP525
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane SpectrumLabs 132680
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Diagnostics 11873580001 irritant
Dounce Homogenizer  Sigma-Aldrich D9938
Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) Beckman-Coulter 355642
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane SpectrumLabs 132680
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
 Temperature-controlled shaker New Brunswick Scientific C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge Thermo-Scientific 75004521
Swinging Bucket Centrifuge Rotor Thermo-Scientific 75003607
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor Thermo-Scientific 75003698
Ultracentrifuge LB-M Beckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 342204
PROTOCOL #2 
1. Placental villous cells isolation
Disposable underpads Fisher Scientific 23666062
Autoclavable pan (container), 3L Fisher Scientific 1336110
Fine scissors, sharp-sharp, straight Fine science tools 1406011
London Forceps Fine science tools 1108002
Dumont #7b Forceps Fine science tools 1127020
Razor blades Fisher Scientific S65921
Screen cup for CD-1 Fisher Scientific S1145
40 mesh screen  Fisher Scientific S0770
Fisherbrand cell stainers 100μm Fisher Scientific 22363549
150 mm Petri Dishes Fisher Scientific NC9054771
NaCl Fisher Scientific S642
KCl Fisher Scientific P333
KH2PO4 Fisher Scientific P386
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
D-glucose Fisher Scientific D16
HEPES Fisher Scientific BP310
2.5% trypsin 10x Invitrogen 15090046
DNase I grade II, from bovine pancreas Roche Applied Science 10104159001
Sodium bicarbonate solution Sigma-aldrich S8761
500 ml Erlenmeyer flasks
250 ml beakers
15 ml centrifuge tubes
10 ml serological pipettes
50 ml centrifuge tubes
DMEM Invitrogen 11965084
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells
Tris-HCl Fisher Scientific BP153
EDTA Fisher Scientific BP120
D-Sucrose Fisher Scientific BP220
Sodium Carbonate  Fisher Scientific BP357
EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 11873580001 irritant
Dounce homogenizer  Sigma-Aldrich D9938
Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) Beckman-Coulter 355642
Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) Beckman-Coulter 344059
Disposable borosilicate glass pasteur pipets Fisher Scientific 1367820C
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biological safety hood  Thermo-Scientific
Waterbath Fisher Scientific
 Temperature-controlled shaker New Brunswick Scientific C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge Thermo-Scientific 75004521
Swinging Bucket Centrifuge Rotor Thermo-Scientific 75003607
Ultracentrifuge LB-M Beckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 342204
SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 331336
Western blot
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG LI-COR 926-68071 dilution 1:15000
IRDye  800CW Goat Anti-Mouse IgG LI-COR 926-32210 dilution 1:5000
NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels Invitrogen NP0341
primary antibodies for PROTOCOL #1
Erg6p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:5000
Dpm1p Abcam ab113686 4 μg/ml
Por1p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:5000
Pma1p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:10000
Vma1p (anti-ATP6V1A) Abcam ab113745 0.5 μg/ml
primary antibodies for PROTOCOL #2
perilipin 2 (anti-ADFP) Abcam ab52355 2 μg/ml
calnexin Cell Signaling technology 2679 dilution 1:1000
GM130 Biorbyt orb40533 dilution 1:25
COX IV Cell Signaling technology 4850 dilution 1:1000
MEK1 Biorbyt orb38775 dilution 1:50

References

  1. Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
  2. Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
  3. Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
  4. Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
  5. Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
  6. Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
  7. Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
  8. Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
  9. Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
  10. Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
  11. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
  12. Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
  13. Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
  14. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
  15. Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
  16. Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
  17. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
  18. Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
  19. Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
  20. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
  21. Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
  22. Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
  23. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
  24. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
  25. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
  26. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  27. Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
  28. Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
  29. Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
  30. Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
  31. Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
  32. Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
  33. Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
  34. Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
  35. Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
  36. Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
  37. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).

Play Video

Cite This Article
Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas. J. Vis. Exp. (86), e50981, doi:10.3791/50981 (2014).

View Video