Summary
Deux techniques pour isoler des gouttelettes lipidiques cellulaires à partir de 1) cellules de levure et 2) placentas humains sont présentés. L'élément central de ces deux procédés est centrifugation en gradient de densité, où la couche flottante résultant contenant les gouttelettes peuvent être facilement visualisés à l'oeil nu, on extrait et quantifié par analyse par transfert de Western pour la pureté.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques sont des organites dynamiques qui peuvent être trouvés dans la plupart des cellules procaryotes eucaryotes et certaines. Structurellement, les gouttelettes sont constitués d'un noyau de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides. Une des techniques les plus utiles pour déterminer les rôles cellulaires de gouttelettes a été identification protéomique des protéines liées, qui peuvent être isolées avec les gouttelettes. Ici, deux méthodes sont décrites pour isoler des gouttelettes lipidiques et leurs protéines liées de deux vastes eucaryotes: fission levure et les cellules des villosités placentaires humains. Bien que les deux techniques présentent des différences, la principale méthode - centrifugation en gradient de densité - est partagée par les deux préparations. Ceci démontre la grande applicabilité des techniques d'isolement de gouttelettes présentés.
Dans le premier protocole, des cellules de levure sont transformées en sphéroplastes par digestion enzymatique de leurs parois cellulaires. Les sphéroplastes résultants sont ensuite Gentment lysées dans un homogénéisateur ample. Ficoll est ajouté au lysat de fournir un gradient de densité, et le mélange est centrifugé trois fois. Après la première rotation, les gouttelettes lipidiques sont localisées sur la couche flottante de couleur blanche des tubes de centrifugeuse en même temps que le réticulum endoplasmique (RE), de la membrane plasmique, et vacuoles. Deux tours suivants sont utilisés pour enlever ces trois autres organites. Le résultat est une couche qui ne comporte que des gouttelettes et des protéines liées.
Dans le second protocole, les cellules des villosités placentaires sont isolés à partir de placentas à terme humain par digestion enzymatique à la trypsine et la DNase I. Les cellules sont homogénéisées dans un homogénéisateur ample. Étapes à basse vitesse et de centrifugation à vitesse moyenne sont utilisés pour éliminer les cellules intactes, des débris cellulaires, noyaux et des mitochondries. Le saccharose est ajouté à l'homogénat de fournir un gradient de densité et le mélange est centrifugé pour séparer les gouttelettes de lipides à partir de l'autre cellulafractions de r.
La pureté des gouttelettes lipidiques dans les deux protocoles est confirmée par analyse Western Blot. Les fractions de gouttelettes de deux préparations sont adaptés à l'analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.
Introduction
Gouttelettes lipidiques sont des organites cellulaires dynamiques qui servent plusieurs fonctions dans les cellules. Ce sont des concentrateurs de stockage pour les lipides neutres, qui peuvent être converties en énergie ou utilisés pour la synthèse des phospholipides. Les gouttelettes jouent un rôle central dans des conditions physiologiques et pathologiques, y compris l'athérosclérose, l'obésité et les maladies métaboliques, ainsi que les maladies infectieuses 1,2. En outre, ils sont des sources intéressantes pour le biodiesel.
Beaucoup d'informations sur les rôles cellulaires de gouttelettes lipidiques a été obtenu à partir de l'analyse protéomique et lipidomiques de gouttelettes purifiés à partir d'organismes de grande envergure 3. Ces organismes ont inclus des bactéries, des levures 4,5 6-11, plantes 12,13, 14 nématodes et les mouches 15,16. Compte tenu de l'intérêt dans le rôle de gouttelettes lipidiques dans les maladies métaboliques de l'homme, les gouttelettes ont également été isolés à partir de cellules animales cultivées et untissus Nimal. Les lignées cellulaires cultivées ont inclus les adipocytes 3T3-L1, 17 ovariennes de hamster chinois (CHO) ou des cellules de K2 18, 19,20 hepatocyes humains et des lignées de cellules epitheliales 21. Les tissus animaux dont les gouttelettes ont été isolées ont inclus la souris muscle squelettique 22, 23 foie et les glandes mammaires 23. Comme mentionné ci-dessus, le but de la plupart des études d'isolement de gouttelettes est d'effectuer l'analyse protéomique sur les facteurs liés lipidomiques et analyse sur le neutre et les phospholipides.
Etant donné que les lipides neutres - les plus nombreux composants de gouttelettes lipidiques - sont moins denses que la plupart des autres matériaux cellulaires, l'isolement des gouttelettes a été traditionnellement effectuées en utilisant la centrifugation en gradient de densité. Cette technique est la pièce maîtresse des deux préparations présentées ici. Les techniques précédentes sont réunies et 6,24 modifiés dans une présentation visuelle de la séparation de gouttelettes à partir de cellules de levure de fission cultivéeset les cellules humaines noncultured obtenues à partir de tissu placentaire. L'objectif est de montrer la large applicabilité de cette technique en choisissant deux types de cellules très différentes comme points de départ pour l'isolement des gouttelettes. Cette technique devrait être utile pour ceux qui souhaitent isoler des gouttelettes de la plupart des organismes.
Protocole 1 décrit l'isolement de gouttelettes de lipides à partir de la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, qui a été utilisé comme modèle pour l'observation de la formation de gouttelettes au cours de la division cellulaire eucaryote 25. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a été largement utilisée comme un organisme modèle pour l'étude de la biologie des gouttelettes de lipide. Protocole 1 est applicable à la fois aux organismes et les différences dans les préparatifs sont mis en évidence.
Protocole n ° 2 décrit l'isolation de gouttelettes de lipides à partir de cellules villeuses placentaires, qui sont à leur tour obtenu à partir de placentas humains à terme. Lacollection de placentas à terme offre une occasion unique d'obtenir en toute sécurité et éthique 200-250 g de tissu humain facilement disponibles 26, qui contient un nombre important de gouttelettes lipidiques. Ceci est en contraste avec la plupart des travaux d'isolation de gouttelettes de lipides chez les eucaryotes supérieurs, où les gouttelettes provenant de cellules cultivées. Dans ces études, les acides gras sont souvent ajoutés à la culture pour favoriser la synthèse des lipides neutres et donc la croissance de gouttelettes. Ceci est en contraste avec le travail ici où des gouttelettes lipidiques sont formées dans des conditions natives dans le tissu placentaire.
Les puretés des fractions lipidiques de gouttelettes sont déterminées par analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps marqueurs organelles. Ces deux protocoles donneront lipidiques fractions de gouttelettes qui sont appropriés pour l'analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Isoler gouttelettes lipidiques (de fission) cellules de levure
Isolation des gouttelettes de l'organisme modèle populaire en herbe levure Saccharomyces cerevisiae est presque identique au protocole 6 suivant. Différences dans les préparatifs sont notées.
Une. Des cellules de levure de croissance
- Préparer les médias. Combiner 36 g de poudre par litre YE5S de dH 2 O dans des bouteilles en verre ou des fioles de culture. Environ 2 L de médias sera nécessaire. Autoclave les médias à 121 ° C pendant 20 min. Autoriser les médias à refroidir à température ambiante. Pour S. cerevisiae remplacer YE5S avec YPD.
- Placez 10-20 ml de médias YE5S refroidis dans un flacon de 250 ml de culture en utilisant des techniques stériles. Ensemencer le support avec une petite quantité de cellules de levure à partir d'une plaque de gélose à l'aide d'un bâton en bois ou équivalent stérile. Laissez les cellules se développent à la densité optique désirée à 30 ° C. Mesurer la densité optique à unelongueur d'onde de 595 nm en utilisant un spectrophotomètre.
- Placez le support restant dans les 2,8 L flacons. Ne pas utiliser plus de 1 L de support par 2,8 L fiole pour assurer un mélange approprié pendant la croissance des cellules dans l'incubateur sous agitation. Le rendement final de cellules humides devrait être d'environ 10 g de pouvoir acquérir suffisamment de gouttelettes lipidiques pour l'analyse protéomique et lipidomiques.
- Présentez les cellules de l'étape 1.2 dans les 2,8 L flacons ayant chacun 1 L de médias qui ont été préparés à l'étape 1.1.
- Cultiver les cellules à la densité souhaitée à 30 ° C.
- Assurez-vous que les cellules ont des gouttelettes lipidiques. Réserve 1 ml de cellules. Mesurer la densité optique (OD) de l'échantillon. Ajouter 0,1 ml d'une 100 mM de BODIPY 493/503 dans de l'éthanol par DO de cellules de l'échantillon. Placez 3 pi de l'échantillon entre une lame de verre et une lamelle de verre. Visualiser au microscope à fluorescence avec un filtre de GFP (Figure 1A).
- Pellet les cellules de l'étape 1.5 à 4 & #176, C à 3800 g pendant 10 min. Travailler par lots en fonction de la capacité des tubes à centrifuger.
- Verser les médias YE5S et laver les cellules avec un tampon de EMM + 600 mM de sorbitol. Sorbitol fournit un soutien osmotique.
- Transférer les cellules dans un tube de 50 ml à centrifuger stérile et sédimenter les cellules à 4 ° C à 2000 xg pendant 10 min. Retirer le surnageant. Peser les cellules humides. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de (EMM + 600 mM de sorbitol) tampon par gramme de cellules.
2. La conversion des cellules de levure de fission en sphéroplastes et la lyse ultérieure
- Ajouter 5 mg chacune 1) levure enzyme lytique et 2) de levure de lyse enzymes de Trichoderma harzianum par gramme de cellules humides qui ont été pesés à l'étape 1.9. Pour S. cerevisiae augmenter ces enzymes avec la même quantité de Zymolyase.
- Incuber les cellules à 30 ° C sous agitation à 100 rpm pendant 60 min douce.
- Assurez-vous que les sphéroplastes ont dr lipidesoplets. Par étape de 1,6 (figure 1B) répéter.
3. Centrifugation en gradient de densité
- Pellet les sphéroplastes par centrifugation à 4 ° C à 2000 x g pendant 5 min.
- Retirez délicatement le surnageant à l'aide d'une pipette de transfert en plastique.
- Resuspendre doucement les sphéroplastes granulés avec de la glace froid 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol, et 200 pM EDTA. Gardez à l'esprit que les sphéroplastes sont très fragiles.
- Pellet les sphéroplastes à nouveau en utilisant les mêmes paramètres que dans l'étape 3.1. Retirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les sphéroplastes à l'aide d'une pipette de transfert en plastique dans 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et 200 uM d'EDTA à une concentration de 2 ml / g de cellules.
- Transférer les sphéroplastes remises en suspension dans un homogénéisateur en verre et homogénéiser doucement sur la glace, 20-30 coups, avec le pilon lâche de l'homogénéisateur en verre.
- Transférer les sphéroplastes lysées à tubes de centrifugation et superposer avec la même volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et 200 uM de tampon EDTA. Choisissez le nombre de tubes de centrifugation à utiliser de sorte que chaque tube est d'environ deux tiers plein.
- Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1,5 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rotor décélération = 0).
- Transférer doucement la couche supérieure flottant blanc (figure 2A), qui contient des gouttelettes, dans un nouveau tube (s) de la centrifugeuse en utilisant soit une pipette ou une pipette Pasteur plié. Ajouter suffisamment de volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d'EDTA à l'échantillon de façon à ce qu'il remplisse environ le tiers du tube de centrifugation.
- Ajouter le volume équivalent de 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d'EDTA à la partie supérieure de l'échantillon (s) dans le nouveau tube (s) de centrifugation. Après addition de ce tampon les tubes doivent être d'environ deux-tiers.
- Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rOtor décélération = 0).
- Transférer doucement la couche supérieure flottant blanc (figure 2B), qui contiendra les gouttelettes, dans un nouveau tube (s) de la centrifugeuse en utilisant soit une pipette ou une pipette Pasteur plié. Ajouter 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d'EDTA à l'échantillon de façon à ce qu'il remplisse environ le tiers du tube de centrifugation.
- Ajouter le volume équivalent de 250 mM de sorbitol, 10 mM Tris-HCl, et un tampon 200 uM d'EDTA à la partie supérieure de l'échantillon (s) dans le nouveau tube (s) de centrifugation. Après addition de ce tampon les tubes doivent être d'environ deux-tiers.
- Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rotor décélération = 0).
- Transférer la couche supérieure blanche (figure 2C), qui doit contenir que les gouttelettes de lipides et les protéines liées, à un tube de dialyse, et on dialyse O / N dans 10 mM de Tris-HCl et 200 uM de tampon EDTA pour éliminer le Ficoll.
Placentas ont été recueillies auprès des femmes en bonne santé avec les grossesses uniques qui subissent une section césarienne avant le début du travail spontané à terme. Sujets ont écrit, le consentement éclairé pour la collecte de leur placenta. La collection et l'utilisation ultérieure, de placentas a été réalisée avec l'approbation de l'Université du Tennessee et de l'Université du Tennessee Graduate School of Medicine à l'Institutional Review Board Knoxville (# 8757B et # 3338, respectivement).
Une. Isoler les cellules des villosités placentaires humains
Partie 1 du protocole est une modification d'un protocole publié plus tôt par Petroff et al. 26
Préparer les solutions suivantes:
- De NaCl (1 L): dissoudre 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) dans dH 2 O pour obtenir une solution à 1 L. Stériliser par filtration (0,2; Um membrane).
- Solution saline équilibrée de 10x Hank (10x HBSS) (1 litre): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g de D-glucose (M 180,16 g / mol). Dissoudre chacun des constituants dans dH 2 O pour donner une solution de 1 litre. Stériliser par filtration (membrane de 0,2 um).
- Un tampon de digestion enzymatique (0,6 ml): combiner 70 ml de HBSS 10x avec 3,3 ml de 7,5% de Na biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES, et 266,1 ml dH 2 O; stériliser par filtration (membrane de 0,2 um). Stocker à 4 ° C.
- DNase I: juste avant utilisation, ajouter 5 ml de NaCl 0,9% stérile dans un flacon de DNase. Garder sur la glace jusqu'à utilisation ou conserver à -20 ° C.
- Placenta préparation pour la dissection
- Obtenir un placenta et processus au plus près du moment de la livraison que possible humaine. Utiliser un récipient fermé tel qu'un refroidisseur pour transporter le placenta. Soyez toujours prudent lorsque la mainling matériels biologiques humains.
- Dans la hotte de sécurité biologique, transférer le placenta dans un récipient autoclavable stérile, et laver soigneusement sang de placenta et les membranes à l'aide de NaCl 0,9% stérile (solution saline) solution. Jeter saline sanglante dans le bécher de 1 L de déchets biologiques liquides.
- Placer le placenta sur un champ stérile, avec la surface portant le cordon ombilical vers le haut. Avec tranchants, ciseaux pointes fines et pince retirer les membranes foetales et cordon ombilical.
- Retournez le placenta de sorte que la surface maternelle (surface rugueuse) est orientée vers le haut. Enlever le tissu de la plaque de base sus-jacente, d'environ 3 mm de la surface.
- Disséquer le placenta
- Disséquer un cotylédon à la fois d'éviter la plaque chorionique. Recueillir des villosités dans un bécher de 250 ml avec une solution saline.
- Rincer tissu plusieurs fois dans un bêcher séparé avec 0,9% de NaCl par tourbillonnement avec une pince, à l'aide du bêcher de 1 litre pour les déchets liquides.
- Transférer un cotylédon à la fois pour un plat de 150 mm de Pétri. Tenir avec une pince et gratter le tissu avec une lame de rasoir de navires sur boîte de Pétri. Placez le tissu gratté dans le bécher séparé contenant 0,9% de NaCl. Répétez l'opération pour tous les morceaux de tissu.
- Transfert petite partie du tissu au tamis de dissociation cellulaire et rincer à 0,9% de NaCl largement jusqu'à l'éluat devient clair. Répétez l'opération pour tous les tissus.
- Après rinçage du tissu gratté dans le tamis de dissociation cellulaire, la vider de liquide et l'excès de poids.
A ce stade, le tissu peut être conservé O / N dans un ballon d'Erlenmeyer stérile à 4 ° C dans du DMEM.
- Digestion enzymatique du tissu placentaire
- Préparer le mélange de digestion du tissu: 100 ml de tampon de dilution de l'enzyme préchauffé, 1 ml de DNase I et de 20 ml de trypsine à 2,5% 10x.
- Diviser le tissu, le transfert de 60 g de tissu recueilli au total (habituellement d'environ 250 à 300 g) à un ballon de 500 ml d'Erlenmeyer stérile.
- La collecte des cellules dissociées
- Après le premier 45 min dissociation, mettre le ballon de digestion à une inclinaison jusqu'à ce que le tissu s'installe.
- Recueillir le surnageant, en prenant soin de ne pas percevoir les tissus non dissocié. Ajouter une quantité égale de HBSS au surnageant recueilli et les transférer dans des tubes de 15 ml à centrifuger stériles. Pour des portions supplémentaires de tissu non dissocié, répéter la procédure à partir de l'étape 3.2 avec le tissu non dissocié.
- Centrifuger l'homogénat à 4 ° C à 1000 xg pendant 15 min.
- Pour chaque lot, après centrifugation, aspirer le surnageant sans perturber le culot. Les cellules des villosités placentaires sont en majorité dans la partie blanche de la pastille, recouvrant les globules rouges.
- Transférer les cellules des villosités (partie blanche de la pastille) à une sterile 50 ml tube à centrifuger conique et garder sur la glace.
- Après avoir recueilli les cellules à partir de chacune des trois étapes de digestion, un filtrage de la suspension en utilisant un tamis cellulaire en nylon de 100 um inséré dans la partie supérieure de 50 ml d'un tube de centrifugation conique stérile. Si la filtration de la suspension cellulaire ralentit, soulevez sur le filtre pour créer un vide dans le tube.
- Centrifuger à 4 ° C à 1000 xg pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans déranger le culot.
2. Homogénéisation des cellules des villosités placentaires
- Avant de commencer le processus d'isolement, de préparer 50 ml de lyse hypotonique moyen (HLM) contenant 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 et EDTA 1 mM. Ajouter inhibiteurs de la protéase à HLM juste avant utilisation et conserver le milieu de la glace.
- Dans le capot de protection biologique, ajouter 4 fois le volume du culot cellulaire d'glacée HLM aux cellules. Doucement et entièrement remettre les cellules par pipetage des cellules jusqu'à-und-bas à l'aide d'une pipette de 10 ml.
- Incuber les cellules en suspension sur de la glace pendant 10 min.
- Transférer les cellules à l'homogénéisateur Dounce, qui devrait se retrouver sur la glace. Homogénéiser lentement les cellules en appliquant 20-25 caresses avec le pilon ample de l'homogénéisateur.
- Centrifuger le lysat de cellules à 4 ° C à 3000 xg pendant 10 min pour éliminer les cellules non rompues, des débris cellulaires et les noyaux.
- Recueillir le surnageant et transférer dans un tube SW28 (ou alternative qui peut être centrifugé à 25 000 xg). Centrifuger à 4 ° C à 25000 g pendant 20 min pour éliminer les mitochondries.
3. Isolement de gouttelettes lipidiques par ultracentrifugation
- Préparer 50 ml de carbonate de sodium 100 mM (M 106 g / mol) tampon (pH 11,5) et 50 ml de saccharose à 60% (m / m) solution. Ajouter des inhibiteurs de la protéase dans le tampon de carbonate de sodium, juste avant l'utilisation et la maintenir sur de la glace.
- Recueillir le surnageant de l'étape 2.6 dans un tube de centrifugeuse de 50 ml, ajusterà 20% de saccharose et de transfert dans la partie inférieure d'un tube d'ultracentrifugation pour un rotor SW28, ou l'équivalent. Surnageant densité Overlay ajusté avec ~ 10 ml de tampon de carbonate de sodium 100 mM glacé (pH 11,5) et 0,5-1 ml de glace-froid HLM pour remplir le tube.
- Centrifugeuse à 4 ° C à 130 000 g pendant 45 min à l'aide SW28 oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rotor décélération = 0).
- Recueillir la couche flottante, ajuster à 10% de saccharose et le transférer dans le fond d'un tube d'ultracentrifugation 13,2 ml pour un rotor SW41Ti, ou l'équivalent. Superposition densité ajustée surnageant avec environ 5 ml de tampon carbonate de sodium 100 mM glacé (pH 11,5) et 0,5 ml de HLM glacée.
- Centrifugeuse à 4 ° C à 274 000 g pendant 60 min à l'aide SW41Ti oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rotor décélération = 0) pour minimiser la perturbation de la couche lipidique de gouttelettes.
- Recueillir soigneusement la couche flottante supérieure (figure 2D) contenantgouttelettes lipidiques avec une pipette de 1 ml et répéter l'étape 3.4.
- Centrifugeuse à 4 ° C à 274 000 g pendant 30 min à l'aide SW41Ti oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l'autre à un arrêt (rotor décélération = 0).
- Recueillir soigneusement la couche flottante de couleur blanche supérieure contenant des gouttelettes lipidiques avec une pipette Pasteur plié en trois tubes de 1,5 ml contenant 100 ul HLM.
Gouttelettes lipidiques caractérisant fraction (protocoles n ° 1 et 2)
La récupération et la pureté de la fraction lipidique de la gouttelette peut être vérifiée par Western Blot combinée avec de la lumière ou par microscopie électronique. En outre, des parties aliquotes après différentes étapes de centrifugation peuvent être recueillis et conservés pour la détermination de l'efficacité de la purification. En Western blot, il est plus approprié pour comparer un volume de la fraction des gouttelettes de lipides qui représente un équivalent de l'ensemble du lysat de cellules que l'on compare les gouttelettes lipidiques à d'autres fractions membranaires de tIl base de la teneur totale en protéines 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Si la centrifugation en gradient de densité a fonctionné comme prévu, la couche flottante doit contenir des gouttelettes lipidiques et être épuisé d'autres organites tout au long de la progression des tours à grande vitesse.
Pour le protocole 1, les Western blots ont été réalisées avec des anticorps de marqueurs à des gouttelettes lipidiques (Erg6p), et des organites qui ont été trouvés pour interagir avec les gouttelettes lipidiques dans la levure, ER (Dpm1p), les mitochondries (Por1p), la membrane plasmique (Pma1p), et vacuoles (Vma1p).
Des volumes égaux de la couche flottante de chacune des trois rotations (étapes 3,7, 3,10, et 3,13) ont été recueillis, précipités avec de l'acide trichloroacétique (15% concentration finale), et solubilisées dans l'eau. 13 ml de lysat cellulaire (Figure 3A, "Lys") et la protéine de préparation de chacune des trois rotations (Figure 3A, "Spin1", "Spin2", et "Spin3") ont été séparées sur 12% de SDS-PAGE, transférés sur nitrocellulose membrane, et immunoblot avec organite spécianticorps fictions. Comme on s'y attendait, le lipide gouttelette protéine marqueur Erg6p est présent dans la couche flottante, après chacune des trois rotations (Figure 3A); Por1p n'est pas présent dans la couche flottante après Spin1 (Figure 3A); Vma1p épuisement de la couche flottante après Spin2 (Figure 3A), et Dpm1p Pma1p et ne sont pas présents dans la couche flottante après Spin3 (Figure 3A).
Pour le protocole 2, la présence de gouttelettes de lipides isolés à partir de cellules placentaires villeuses terme humain a été vérifiée par coloration avec un colorant spécifique des lipides neutres de fluorescence, BODIPY 493/503. Les gouttelettes sont ensuite visualisées sous un microscope à fluorescence (Figure 3B). La pureté de l'isolement des fractions lipidiques de gouttelettes a été évaluée par Western Blot avec des protéines servant de marqueurs pour les gouttelettes lipidiques (Perilipin 2), ER (calnexine), l'appareil de Golgi (GM130), les mitochondries (COX IV) et la membrane plasmique (MEK1) (Figure 3C). Le dr lipidiqueoplets ont été radiées de lipide avec de l'acétone froid et les protéines ont été extraites. Pourcentages égaux de surnageant post-nucléaire (SNP), la fraction en dessous de la couche flottante de la dernière centrifugation (étape 3.6, «Spin4" sur la figure 3C), l'étape de lavage ultérieur (étape 3.8, «Spin5" sur la figure 3C), et de-prep lipidée de la protéine de la couche flottante de gouttelettes de lipides (étape 3.8, "LD" sur la figure 3C) ont été séparées sur 12% de SDS-PAGE, transférés et une immuno-empreinte avec des anticorps indiqués. Perilipin 2 (également connu sous le nom PAAC), la protéine de gouttelettes de lipide, a été détectée dans le surnageant post-nucléaire et dans la couche flottante blanc isolé contenant des gouttelettes lipidiques. Protéines spécifiques pour la membrane plasmique (MEK1) et l'appareil de Golgi (GM130) n'ont pas été détectés dans les fractions de gouttelettes lipidiques dans les deux couche sous la couche flottante pour Spin4 et Spin5. Comme indiqué précédemment, la calnexine de protéine ER 18,27,28 et une faible coloration de la protéine de la membrane mitochondriale COX IV ont été deteDECT ailleurs dans la fraction lipidique des gouttelettes 22. Ces résultats sont en accord avec des rapports antérieurs montrant que les gouttelettes de lipides interagissent avec les mitochondries dans des cellules de mammifères 29 et avec l'ER 30,31.
Figure 1. Gouttelettes lipidiques cellulaires dans des cellules de levure de fission. (A) Fond clair (BF) et large fluorescence de champ (Fluor.) des images de six cellules de levure de fission représentatives où les gouttelettes lipidiques sont teints avec BODIPY 493/503. (B) Fond clair (BF ) et large fluorescence de champ (Fluor.) des images d'un représentant sphéroplaste où les gouttelettes lipidiques sont teints avec BODIPY 493/503. Barres d'échelle sont 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande of ce chiffre.
Figure 2. Couche flottante après centrifugation en gradient de densité. Tubes à centrifuger après (A) Spin1 (étape 3.8), (B) Spin2 (étape 3.11), et (C) Spin3 (étape 3.14) du Protocole 1. (D) Tubes à centrifuger après Spin4 (étape 3.6) du Protocole 2. Les couches flottantes contenant des gouttelettes lipidiques sont indiqués par des flèches.
Figure 3. Analyse de la pureté des gouttelettes lipidiques isolés. (A) Western Blot des étapes clés du protocole 1. Volumes égaux de chaque préparation de protéine (Spin1 - étape 3.7, Spin2 - étape 3.10, et Spi n3 - étape 3.13) a été séparé par SDS-PAGE, transférés sur des membranes de nitrocellulose, et une immuno-empreinte avec des anticorps pour Erg6p (LD, des gouttelettes lipidiques), Dpm1p (ER), Por1p (MT, les mitochondries), Pma1p (PM, membrane plasmique), et Vma1p (vacuoles). (B) contraste de phase (PC) et large fluorescence de champ (Fluor.) des images de BODIPY 493/503-stained gouttelettes lipidiques qui ont été isolés à partir des cellules des villosités placentaires humains. (C) des transferts de Western des étapes clés dans le protocole 2. Égal pourcentage pf PNS (surnageant après nucléaire), surnageant dessous de la couche flottante après le dernier tour (Spin4 - étape 3.6), lavage subséquent (Spin5 - étape 3.8), et la couche flottante (LD) ont été séparées par SDS-PAGE, transférés à membranes et immunoblot avec des anticorps pour Perilipin 2 (LD, gouttelettes lipidiques), la calnexine (ER), GM130 (Golgi protéine de la matrice, l'appareil de Golgi), COX IV (cytochrome c oxydase, MT, les mitochondries), et MEK1 (MAPK kinase; PM, plasma membrane).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les étapes critiques de ce protocole
Assurez-vous d'être cohérent avec les médias et les densités cellulaires au cours de la croissance des cellules en culture. Gouttelettes lipidiques cellulaires sont uniques que leurs protéines associées dépendent fortement de l'environnement dans lequel les cellules sont cultivées 17. Par conséquent, les médias, dans lequel les cellules sont cultivées et la densité des cellules doivent être étroitement surveillés avant la lyse.
La composition protéique des gouttelettes lipidiques est une fonction de la phase des cellules de levure de la croissance. Moins de protéines seront liés aux gouttelettes en phase de croissance logarithmique par rapport à la phase stationnaire. En outre, l'efficacité sphéroplastes est une fonction de la phase des cellules de levure de la croissance. Cellules en phase de croissance logarithmique auront des rendements plus élevés de sphéroplastes que les cellules en phase stationnaire, car ces derniers sont plus résistants au traitement enzymatique.
tente ">Assurez-vous d'utiliser des techniques douces pour casser les cellules. Techniques qui décomposent la paroi cellulaire de la levure par digestion enzymatique sont préférés aux techniques qui se percent la paroi cellulaire par la force appliquée. Cette dernière méthode peut perturber l'intégrité de la structure des gouttelettes résultant de la perte de protéines ou de lipides liés.
Éviter le gel des échantillons après que les cellules ont été lysées. Gouttelettes de congélation n'est pas recommandée car elle peut affecter leur intégrité structurelle résultant en la perte de la protéine liée ou lipides. La surgélation peut aussi causer des gouttelettes de fusionner ou fragment 24. Cela peut être particulièrement pertinent puisque les gouttelettes ont été observés à fragmenter ou subir la fission dans les cellules de levure vivantes 25 et donc la répartition des gouttelettes plus grosses dans les plus petits est possible. Pièces de gouttelettes qui fragment peut pas avoir la flottabilité pour apparaître dans la fcouche de loating pendant la centrifugation en gradient de densité. Ceci pourrait réduire artificiellement le nombre de facteurs de gouttelettes qui seraient identifiés par cette technique étant donné que la composition de protéines de surfaces de gouttelettes peut être une fonction de la taille des gouttelettes 32.
Assurez-vous de vérifier la localisation des facteurs associés lipidique de gouttelettes de gouttelettes lipidiques. L'une des caractéristiques de gouttelettes lipidiques est qu'ils interagissent avec d'autres organites 33-37. Par conséquent, les facteurs de ces organites sont souvent trouvés dans la fraction lipidique des gouttelettes. Par conséquent, il est important d'utiliser des techniques supplémentaires pour s'assurer que ces facteurs se localisent sur les gouttelettes. Des études avec une protéine de fusion fluorescente liée à la protéine d'intérêt dans des cellules où les gouttelettes lipidiques sont colorées avec un marqueur fluorescent différent doit être utilisé pour déterminer l'étendue de la co-localisation 15. Techniques telles que la protéine corrélation profiling peut être utilisé pour quantifier en outre la pureté de la fraction lipidique de gouttelettes 15. Dans cette stratégie, les deux composants sont chacune marquées avec différents acides aminés contenant un isotope. Le premier composant est un facteur de gouttelettes de lipide connue, et le deuxième composant est la fraction qui est en cours d'analyse. Les comparaisons sont ensuite mis entre les emplacements des fractions des deux composants.
Modifications et dépannage
Modifications du protocole 1 pour isoler des gouttelettes lipidiques de la levure Saccharomyces cerevisiae sont notés. A noter que les tailles des gouttelettes de lipides peut varier considérablement. peuvent avoir besoin d'être augmenté pour les petites gouttelettes à s'accumuler dans la couche flottante vitesses gradient de densité de centrifugation.
Limites de la technique
L'accès à une centrifugeuse ultra avec commedécollement rotor à godets est essentiel pour l'isolation de gouttelettes de lipides cellulaires. Bien que cette pièce d'équipement est standard dans la plupart de la biologie cellulaire et la biochimie des laboratoires, il est cher.
L'importance de la technique par rapport aux méthodes existantes ou d'autres méthodes alternatives
Comme mentionné ci-dessus, protocole n ° 1 est étroitement basée sur le travail de Leber et al. 6 et la partie 1 du protocole no 2 est une modification d'un protocole publié plus tôt par Petroff et al. 26
Applications
L'isolement des lipides des gouttelettes est plus utile pour l'analyse protéomique et lipidomiques ultérieure de protéines liées, lipides neutres et des phospholipides. Les stocks de lipides gouttelettes protéines et des lipides associés ont été compilées 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la récompense American Heart Association 13SDG14500046 à PD, une éducation à l'énergie durable et Centre de recherche Prix (Univ. du Tennessee) à PD, et par la formation médicale des médecins et la Fondation de recherche (Université de Tennessee) prix à JM Le auteurs remercient Caroline Leplante (Yale Univ.) pour le protocole pour convertir la levure à fission à sphéroplastes; Eric T. Boder (Univ. du Tennessee) pour l'usage de ses incubateurs, serrant la table centrifugeuse, et Western Blot équipement d'analyse et le Centre pour Biotechnologie de l'Environnement (Univ. Tennessee) pour l'utilisation de leur ultra-centrifugeuse; Günther Daum pour les anticorps de levure (Graz University of Technology, en Autriche.); le personnel du Département d'obstétrique et de gynécologie (Univ. Tennessee Medical Center) pour l'assistance technique .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R.
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M.
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
