Два метода для выделения капель сотовой липидов от 1) дрожжевые клетки и 2) человека плаценты представлены. Центральное обеих процедур центрифугирования в градиенте плотности, где в результате плавающий слой, содержащий капельки могут быть легко визуализированы на глаз, экстрагировали и количественно с помощью Вестерн-блот-анализа для чистоты.
Липидных капель динамические органеллы, которые можно найти в большинстве эукариотических и некоторых прокариотических клеток. Конструктивно капли состоят из сердцевины нейтральных липидов, окруженных фосфолипидного монослоя. Одним из наиболее полезных методов в определении роли клеточных капель был протеомических идентификация связанные белки, которые могут быть изолированы вместе с капель. Здесь два метода описаны изолировать липидные капли и их связанные белки из двух широких эукариот: дрожжей деления и плацентарные ворсинчатые клеток человека. Хотя оба метода имеют различия, основным методом – градиент плотности центрифугирования – является общим для обоих препаратов. Это показывает широкую применимость представленных методов изоляции капель.
В первом протоколе, дрожжевые клетки преобразуются в сферопластов ферментативным расщеплением их клеточных стенок. Полученные сферопласты то Гентлы лизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Ficoll добавляется в лизате, чтобы обеспечить градиент плотности, и полученную смесь центрифугируют в три раза. После первого спина, капли липидов локализованы к белому плавающий слой из центрифужные пробирки вместе с эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране и вакуоли. Два последующих спины используются для удаления этих трех других органелл. Результатом является слой, который имеет только капли и связанные белки.
Во второй схеме, плацентарные ворсинчатые клетки выделяют из человеческой плаценты срок ферментативным расщеплением трипсином и ДНКазой I. Клетки гомогенизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Низкая скорость и средней скорости центрифугирования шаги используются для удаления неразрушенных клеток, продукты распада клеток, ядер и митохондрий. Сахароза добавляется в гомогенате, чтобы обеспечить градиент плотности и центрифугируют, чтобы отделить липидных капель с другой CELLULAг фракции.
Чистоту липидных капелек в обоих протоколов подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа. Капли фракции из обоих Preps подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Капли Сотовый липидов являются динамическими органеллы, которые служат несколько функций в клетках. Они концентраторы для хранения нейтральных липидов, которые могут быть конвертированы в энергию или используемых для синтеза фосфолипидов. Капли играют центральную роль в физиологических и патологических состояний, включая атеросклероз, ожирение и связанные с метаболическими заболеваниями, а также инфекционные заболевания 1,2. Кроме того, они интригуют источники биодизельного топлива.
Много информации на клеточном роли липидных капель, была получена из протеомного и липидомных анализа капель очищенных от широкомасштабных организмов 3. Эти организмы включили бактерий 4,5, дрожжи 6-11, растения 12,13, нематоды 14, и летит 15,16. Учитывая интерес в роли липидных капелек в метаболических заболеваний человека, капли были также выделены из культивируемых клеток животного иНимал тканей. Культивируемые клеточные линии были включены 3T3-L1 адипоцитах 17, яичника китайского хомячка (CHO) клетки K2 18, человеческие hepatocyes 19,20 и эпителиальные клеточные линии 21. Животных тканей, из которого капли были выделены включали мыши скелетных мышц, печени 22 23 и молочных желез 23. Как упоминалось выше, цель большинстве исследований изоляции капель является выполнение протеомного анализа на связанных факторов и липидомных анализа на нейтральный и фосфолипидов.
Поскольку нейтральные липиды – самая многочисленная составляющая липидных капель – менее плотная, чем большинство других сотовых материалов, изоляция капель традиционно выполняется с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод является центральным обоих Preps представленных здесь. Предыдущие методы 6,24 объединены и изменены в визуального представления изоляции капель из культивируемых деления дрожжевых клетоки noncultured человеческие клетки получены из плацентарной ткани. Цель состоит в том, чтобы показать широкой применимости этого метода, выбирая два совершенно разных типов клеток в качестве исходных точек для выделения капель. Эта техника должна быть полезной для тех, кто желает, чтобы изолировать капли от большинства организмов.
Протокол 1 описывается изоляция липидных капель с делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces РотЬе, который был использован в качестве модели для наблюдения образование капель при эукариотической деления клеток 25. Подающая надежды дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE широко используется в качестве модельного организма для изучения липидного капель биологию. Протокол 1 применим как организмов и различия в подготовке выделены.
Протокол 2 описывается изоляция липидные капли от плацентарных ворсинок клеток, которые в свою очередь полученного из человеческой плаценты срок.Коллекция срочных плаценты дает уникальную возможность безопасно и этично получить 200-250 г легкодоступной ткани человека 26, который содержит значительное количество липидных капель. Это в отличие от большинства изоляции липидов капли работы в высших эукариот, где капельки происходят из культивируемых клеток. В этих исследованиях, жирные кислоты часто добавляют в культуры для содействия синтез нейтральных липидов и, следовательно, роста капель. Это в отличие от работы здесь, где липидные капли образуются при нативных условиях в плацентарной ткани.
В чистоты липида фракций капель определяются с использованием органелл маркерные антитела, с помощью анализа вестерн-блоттинга. Эти два протокола даст липидов капель фракций, которые подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Критические шаги в рамках этого протокола
Убедитесь, чтобы быть совместимыми с сред и плотности клеток в процессе роста культивируемых клеток. Клеточные капли липидов являются уникальными в том, что их соответствующие белки сильно зависит от сред?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Американская Ассоциация Сердца награждения 13SDG14500046 к PD, устойчивое энергетическое образования и исследовательского центра Award (Университет Теннесси) с БП, и Врачей медицинского образования и исследований Фонда (Университет Теннесси) награда JM The Авторы выражают благодарность Caroline Leplante (Йельский университет) для протокола для преобразования деления дрожжей сферопластов; Эрик Т. Boder (Университет Теннесси) за использование дрожащими инкубаторов, настольной центрифуге и аналитического оборудования иммуноблота; и Центр Экологическая биотехнология (Университет Теннесси) для использования их ультра-центрифуги; Гюнтер Даум для дрожжевых антител (Грац ун-т технологии, Австрия.); личный состав кафедры акушерства и гинекологии (Университет Теннесси Medical Center) для оказания технической помощи .
PROTOCOL #1: | |||
1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
1 liter glass bottle | |||
250 ml flask | |||
2.8 liter flasks | |||
2. Yeast lipid droplet isolation | |||
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
PROTOCOL #2 | |||
1. Placental villous cells isolation | |||
Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
KCl | Fisher Scientific | P333 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
500 ml Erlenmeyer flasks | |||
250 ml beakers | |||
15 ml centrifuge tubes | |||
10 ml serological pipettes | |||
50 ml centrifuge tubes | |||
DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
Waterbath | Fisher Scientific | ||
Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
Western blot | |||
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |