Abstract
由于逆行标记视网膜神经节细胞（RGC的）可以从死亡地点隔离视网膜神经节细胞胞体，它已成为黄金标准的视网膜神经节细胞的存活和再生的实验计数视网膜神经节细胞。许多研究在哺乳动物进行了视神经损伤后视网膜神经节细胞研究生存。然而，视网膜神经节细胞在成年斑马鱼的逆行标记尚未报道，尽管一些替代的方法可以在视网膜神经节细胞层（RGCL）计数细胞数。考虑到成年斑马鱼头骨的小尺寸和死亡的钻探头骨后，高风险，我们打开头骨与酸蚀刻的帮助和密封孔与光固化债券，这可能会显著提高患者的生存率。吸收染料5天之后，几乎所有的视网膜神经节细胞被标记。由于这种方法不需要横切视神经，它是不可替代的视网膜神经节细胞存活的研究在成年斑马鱼视神经损伤后。在这里，我们介绍一步该方法步骤，并提供有代表性的成果。
Introduction
由于成年斑马鱼有很强的能力视神经损伤1后再生轴突，一个适当的方法来计算整个视网膜神经节细胞是必不可少的，以评估视网膜神经节细胞的存活和再生2。基于逆行标记视网膜神经节细胞在哺乳动物和金鱼3的方法- 5，我们构建了从成年斑马鱼的顶盖标记视网膜神经节细胞的方法。对于成年斑马鱼，两个关键技术问题应该注意：成年斑马鱼的头骨是非常小的6;他们生活在一个水环境。在这里，我们把头骨与腐蚀剂，最大限度地减少与钻5相关的危险。然后，我们封孔与光固化粘结手术后从而提高动物的生存。
此前，其他一些技术被采用来计算间接的方式视网膜神经节细胞数量。 HE染色的视网膜切片标签的所有类型的细胞中的RGCL 7。在整个Ř抗体标记etina，如胰岛-1，也可以标记无长突细胞8。虽然从视神经残端逆行标记可以标记在视网膜上所有的RGC，它不能被采用在挤压模型，因为它会造成额外损伤视神经。以逆行标签的优势从顶盖，我们已经研究视网膜神经节细胞的存活和再生的视神经损伤。结果表明，几乎所有的视网膜神经节细胞存活和视网膜神经节细胞的90％以上再生的顶盖在第一周的美眉模型9。
为了成功地标记所有视网膜神经节细胞，DiI荧光贴与其他几个商业染料10比较后选择。首先，它是专为在体内组织标记而设计的。其次，它是亲脂性染料，它不能扩散在水中。此外，这种荧光可以持续很长的时间，这使得它非常适合进行视网膜神经节细胞存活的研究。
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Protocol
1，构建外科器械
注：为了确保鱼的过程中和运行后，滴麻醉液乙基3 - 氨基苯甲酸酯（MS-222，或三卡因）在半浓度（0.015％）与1滴/秒的过鱼的嘴的速度仍然活着使用图1中所示的自制滴灌系统。
- 使一个框， 如图1A（长度为28厘米，宽为10厘米，高度为5厘米），把一个海绵（长度为6厘米，宽度为9厘米，高度为4厘米）的中间，并打开一个差距就可以了。
- 就光固化粘结（ 图1B），那么这将被插入到鱼口针的末端平滑的球形表面。确保该针的表面是光滑的，以防止鱼的口中被损坏。
- 添加MS-222（左腔，长度为6厘米的半集中，宽度为10℃米，高度为8厘米）和盐水（右室中，长为4厘米，宽为10厘米，高度为8厘米）到水库， 如图1C所示。注：新鲜的MS-222推荐。
- 在0.03％的MS-222，持续2分钟麻醉鱼。
- 将鱼在海绵的间隙，并与两对销钉，插入后面的胸鳍和泄殖腔孔，分别为11旁修复的鱼。
- 连接鱼的口中，MS-222，和饲养用水和T型管， 如图1C所示 。
- 打开连接到MS-222的管中。
2，从右键顶盖逆行标记视网膜神经节细胞
注：在开始之前，用消毒70-75％乙醇所有设备，确保没有乙醇仍然存在。
- 罗辛：稍微去除皮肤在整个头骨sclerectome（颅骨背视图显示在图2A和2B
- 清除：用生理盐水冲洗头骨，然后用洗耳球吹干。
- 最初的腐蚀：腐蚀颅骨与蚀刻剂，持续10秒。
- 结算：彻底擦干，用棉签蚀刻剂，然后用生理盐水冲洗干净并擦干。
- 保护：为了保护头骨在其他领域，除了从多余的腐蚀右侧顶盖，覆盖这些领域与光固化粘结，然后暴露于蓝光便携式光源治愈它。
- 完整的腐蚀：把蚀刻剂在正确的顶盖中心区再次为完整的蚀刻2分钟。注：由于旧鱼头骨钙化，腐蚀会需要更长的时间。
- 结算：彻底擦干，用棉签蚀刻剂，然后用生理盐水冲洗干净，再擦干。
- 骷髅开口道：小心地用钳子，露出右顶盖（ 图2D取出malacic颅骨（ 图2C）
- 结算：从擦拭用明胶海绵块孔粘液和血液涌出，并用生理盐水冲洗，直到出血停止。
- 染料放置：把染料（组织标签粘贴）对整个右侧顶盖和明胶海绵覆盖。
- 分离：覆盖从同一动物的无菌尺度的孔中。
- 密封：将光固化粘结到秤上，然后再次治愈它与蓝色光，持续40秒。
- 复兴：洗债券的表面和振兴动物用生理盐水。
- 护理和繁殖：保持鱼在28.5°C胚胎培养基（ZFIN）5天喂2次/日。不包括鱼，其染料不能留在顶盖5天的实验。注：胚胎培养基（EM）解决方案是对鱼的生存至关重要，温度是DiI荧光标记的关键因素。
3，Wholemounting视网膜和成像
- 视网膜之前将鱼在暗场2小时谁lemount。
- 用冰水麻醉的鱼。
- 穿刺在角膜缘的孔，并通过与金星剪刀去除角膜做眼罩。
- 取出透镜并随后把视网膜的中心用冰冷的1×PBS。
- 冲洗视网膜和巩膜用冰冷的1×PBS之间的间隙，直到没有色素残留。
- 切断视神经的光盘。
- 保持RGC层上方并保持视网膜与自制玻璃勺（ 图3A和3B）。甲滴管也可用于传输在视网膜上。
- 把视网膜中一滴冰冷的30％甘油的上一个与RGC层向上（ 图3C）的幻灯片。
- 除去甘油，然后压平视网膜上切割视网膜成四个象限（ 图3D）之前的载玻片上。保持视网膜展开与RGC层向上将是展平视网膜有帮助的。
- 滴冰冷的50％甘油在T他视网膜洗去色素的片段。
- 去除甘油，然后下降20微升冰冷的75％甘油在视网膜上。
- 覆盖样品与1.8厘米×1.8厘米见方的盖玻片。
- 密封盖玻片指甲油。建议在视网膜的直接成像。
- 非隔行扫描图像中的20X物镜下整个视网膜（NA = 0.70）与DP72 CCD（每个图像是1360×1024像素）。每个字段有三个不同的侧重点。
- 延伸的每个字段的深度与在软件“扩展景深”的工具。
- 组装一台虚拟视网膜Photomerge的照片的功能。
- 选择680×512象素的三个字段（实际面积为350微米的264微米，0.092毫米2）在视网膜上的每个方位，以分析视网膜神经节细胞的平均密度（ 图4A）。
- 获得与测量的功能区域 - 在图像中创建一个多边形要素软件。
- 通过公式计算视网膜神经节细胞的总数量“视网膜神经节细胞数量=命运X面积”9。
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Representative Results
如图4B-D显示，DiI荧光阳性细胞的数目是三分之二DAPI +细胞RGCL的。在正常视网膜中，整个视网膜（ 图4E）的一个蒙太奇图像显示的DiI +视网膜神经节细胞分布在整个视网膜上，但在再生的视网膜（ 图4F），如在中心区域的RGC没有再生到其目标在第一个星期，他们不能被标记。
图1：用于研究资助局的逆行标记的手术设备。 （一）用海绵（一）以固定的鱼。操作平台（长度为28厘米，宽度为10厘米，高度为5厘米）和输液管通过一个金属针（B）连接。多余的水被储存在所述空腔（C）（B）特写的金属针。针的头部被包裹着的光固化键（D）（C）储层用于存储MS-222（E，长度为6厘米，宽为10厘米，高度为8厘米）和盐水（F，长度为4厘米，宽为10厘米，高度为8公分），分别为。输液管（克）连接所述容器和所述金属针。
图2。成年斑马鱼的头骨背视图。罗辛前（A）完整的头骨。黄色虚线标示的顶盖;红色虚线标示端脑;和皮去掉后，绿色虚线标记小脑（B）骷髅（C）腐蚀与蚀刻剂后，头骨malacic和凹区域被指出钳（白*）（D）右顶盖暴露后颅骨被删除。规模是500＆＃956;米。
图3。wholemounting视网膜的关键步骤。 （一）自制的玻璃勺子舀为视网膜，底部图像显示整个视图（B）保持与“勺子”（标虚线）的视网膜。（c）运输视网膜上成冰冷的30％甘油。（ D）切视网膜上成4个季度;箭头指示的切割方向。比例尺（A）1毫米; （BD）500微米。
F IGURE 4。视网膜神经节细胞在视网膜上的虚拟计算的采样（A）的视网膜示意图有四个字段（N，D，V，T场）和他们每个人都有其中三个都显示在一个白色框字段。请注意视盘通常位于腹侧颞方向（黑点）。（B）DiI标记视网膜神经节细胞。视网膜神经节细胞和细胞核（三）DAPI标记的细胞核。（D）合并后的图片。整个视网膜（E）蒙太奇图像在正常斑马鱼（F）的蒙太奇图像显示视神经损伤后再生的视网膜。视网膜的中心区没有标记为视网膜神经节细胞没有再生自己的目标，在第一个星期。缩写：N =鼻，D =背，V =腹，T =时间。比例尺：30微米（BD）; 500微米（E，F）。
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Discussion
视网膜神经节细胞逆行标记是重要的研究视网膜神经节细胞存活的哺乳动物，但它并没有在斑马鱼中使用。替代的方法，HE染色7和抗体染色8，是不是金标准，用于计数视网膜神经节细胞数，和转基因品系与标记的RGC的所有还没有被构造12,13。在这段视频中，我们介绍一种方法逆行标记视网膜神经节细胞在成年斑马鱼视网膜。虽然大约1％的轴突投射到嗅球或其它区域14中 ，该方法能够在视网膜标签几乎所有的RGC。
由于斑马鱼太脆弱，无法承受的物理伤害，与手术刀切开3或钻5，15开成年斑马鱼的头骨可能导致死亡。软化头骨与蚀刻剂可以到大脑的损害最小化。通过密封孔与光固化债券和在蓝光下修复它，大多数鱼手术后存活下来。只需要12-15分钟，根据熟练操作进行手术，与大鼠和其他哺乳动物5相比哪个更方便和高效。
DiI荧光组织标记膏是一种亲脂性染料。相比的DiI晶体或浓溶液的显微注射，这提高了染料的渗透进入组织，无论在表面下标记的轴突。此外，该荧光可以持续相当长的时间周期10。另一方面，这种染料是由被动转运途径吸收，因此有必要离开染料在顶盖为完整的标签至少5天。
斑马鱼是视觉再生一个很好的模式生物。在视神经损伤后7天，几乎所有的视网膜神经节细胞轴突再生的顶盖，但只有一半视网膜神经节细胞再生的视神经切模式9。这种方法是研究资助局的理想方式视神经挫伤，这可能避免对视神经额外损伤后的生存和再生。
我们已经提出了一个完整协议，成功地逆行标记视网膜神经节细胞在成年斑马鱼和测量在平片视网膜视网膜神经节细胞数量。另外，通过使用光固化型粘结，我们提高斑马鱼的存活率，这使得该方法更有效。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
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