Abstract
Cellules rétrogrades en matière d'étiquetage de la rétine ganglionnaires (CGR) peuvent isoler CGR soma de mourir sites, il est devenu l'étalon-or pour compter CGR dans la survie CGR et des expériences de régénération. De nombreuses études ont été réalisées chez les animaux mammifères à la recherche survie CGR après une blessure du nerf optique. Cependant, marquage rétrograde de RGC chez le poisson zèbre adulte n'a pas encore été signalé, bien que certaines méthodes peuvent compter le nombre de cellules en couches de cellules ganglionnaires de la rétine (RGCL). Compte tenu de la petite taille du crâne de poisson zèbre adulte et le risque élevé de décès après le forage sur le crâne, nous ouvrons le crâne à l'aide de gravure à l'acide et sceller le trou avec un lien de photopolymérisation, ce qui pourrait améliorer de manière significative le taux de survie. Après avoir absorbé les colorants pendant 5 jours, presque tous les CGR sont étiquetés. Comme cette méthode n'a pas besoin de sectionner le nerf optique, il est irremplaçable dans la recherche de la survie CGR après écrasement du nerf optique chez le poisson zèbre adulte. Ici, nous introduisonsce procédé étape par étape et de fournir des résultats représentatifs.
Introduction
Comme le poisson zèbre adulte a une forte capacité à régénérer les axones après une blessure du nerf optique 1, une méthode appropriée de compter l'ensemble CGR est essentiel d'évaluer la survie et la régénération CGR 2. Basé sur les méthodes de CGR en matière d'étiquetage rétrogrades dans les mammifères et les poissons rouges 3 - 5, nous avons construit la méthode d'étiqueter CGR du tectum chez le poisson zèbre adulte. Pour le poisson zèbre adulte, deux problèmes techniques critiques doivent être notées: le crâne de poisson zèbre adulte est très faible 6; ils vivent dans un environnement d'eau. Ici, nous traitons le crâne avec gravure qui minimise les risques associés au forage 5. Ensuite, nous fermons le trou avec liaison photopolymérisation qui améliore la survie des animaux après la chirurgie.
Auparavant, plusieurs autres techniques ont été adoptées à compter le nombre CGR de façon indirecte. Coloration HE dans les sections de la rétine étiquettes tous les types de cellules dans le RGCL 7. marquage de l'anticorps dans l'ensemble retina, comme îlot-1, peut aussi marquer les cellules amacrines 8. Bien que l'étiquette rétrograde du nerf optique peut souche étiqueter tous les CGR de la rétine, il ne peut être adopté dans le modèle de l'écrasement car elle cause un préjudice supplémentaire pour le nerf optique. Profitant de l'étiquette rétrograde du tectum, nous avons déniché survie CGR et la régénération du nerf optique dans l'écrasement. Les résultats montrent que presque tous les CGR survécu et plus de 90% des CGR régénérés au tectum lors de la première semaine dans le modèle d'écrasement 9.
Dans le but d'étiqueter correctement les CGR, Dil pâte a été choisi après comparaison avec plusieurs autres colorants commerciaux 10. Tout d'abord, il est spécialement conçu pour le marquage in vivo de tissus. D'autre part, il s'agit d'un colorant lipophile qui ne peut pas se diffuser dans l'eau. En outre, cette fluorescence peut persister pendant une longue période qui en fait un excellent candidat pour la recherche de la survie CGR.
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Protocol
1. Construire l'Appareil de chirurgie
REMARQUE: Pour assurer le poisson reste en vie pendant et après l'opération, goutte à goutte anesthésie solution éthyle méthanesulfonate 3 benzoate (MS-222, ou Tricaine) à une demi-concentration (0,015%) avec une vitesse de 1 goutte / sec par la bouche du poisson en utilisant un système de goutte à goutte homebuilt représenté sur la figure 1.
- Faire une boîte comme indiqué sur la figure 1A (longueur 28 cm, largeur 10 cm, hauteur 5 cm), mettre une éponge (longueur de 6 cm, la largeur est de 9 cm, la hauteur est de 4 cm) dans le milieu et ouvrir un écart sur elle.
- Faites une surface sphérique lisse à l'extrémité de l'aiguille avec liaison photopolymérisation (figure 1B) qui sera ensuite insérée dans la bouche du poisson. S'assurer que la surface de l'aiguille est lisse pour empêcher la bouche du poisson ne soit endommagée.
- Ajouter la concentration de la moitié de la SP-222 (chambre à gauche, la longueur est de 6 cm, la largeur est de 10 cm, la hauteur est de 8 cm) et une solution saline (chambre à droite, la longueur est de 4 cm, la largeur est de 10 cm, la hauteur est de 8 cm) pour les réservoirs comme le montre la figure 1C. Note: frais MS-222 est recommandé.
- Anesthésier les poissons dans 0,03% MS-222 pendant 2 min.
- Placer le poisson dans l'écart de l'éponge et fixer le poisson avec deux paires de broches, insérées derrière la nageoire pectorale et à côté du pore du cloaque, respectivement 11.
- Raccorder la bouche du poisson, MS-222, et de l'eau d'élevage avec un tube de type T, comme le montre la figure 1C.
- Mettez le tube relié à la MS-222.
2. CGR Label rétrogrades de la droite Tectum
REMARQUE: Avant de commencer, désinfecter tous les appareils avec 70-75% d'éthanol, veiller à ce qu'aucun éthanol reste.
- Rossing: enlever la peau légèrement sur l'ensemble du crâne avec sclerectome (vue dorsale du crâne est représenté sur les figures 2A et 2B
- Chambre de compensation: laver le crâne avec une solution saline, puis sécher avec une ampoule de lavage de l'oreille.
- Corrosion initiale: corroder le crâne avec le décapant pendant 10 sec.
- Chambre de compensation: essuyer complètement à l'écart de la gravure avec un coton-tige, puis laver la zone avec du sérum physiologique et le sécher.
- Protection: pour protéger le crâne dans d'autres domaines, sauf le droit tectum de corrosion excessive, couvrir ces zones de liaison de photopolymérisation et guérir par l'exposition à la lumière bleue avec illuminant portable.
- Corrosion complète: mettre le décapant dans la zone centrale du droit tectum nouveau pour la gravure complète pendant 2 min. Remarque: Depuis crânes de poissons plus âgés sont calcifiées, la corrosion sera plus long.
- Chambre de compensation: essuyer complètement à l'écart de la gravure avec un coton-tige, puis laver la zone avec du sérum physiologique et sécher à nouveau.
- Ouverture Crâne: retirez soigneusement le crâne Malacic (figure 2C) avec une pince pour exposer le tectum droite (figure 2D
- Chambre de compensation: essuyer le mucus et effusing de sang du trou avec des morceaux de gelfoam et le laver avec une solution saline jusqu'à ce que le saignement s'est arrêté.
- placement de Dye: mettre le colorant (pâte tissu-étiquetage) sur l'ensemble du tectum droit et le couvrir avec gelfoam.
- Séparer: couvrir le trou avec une échelle stérile du même animal.
- Étanchéité: Bond Place de photopolymérisation sur la balance et guérir avec la lumière bleue de nouveau pendant 40 secondes.
- Revival: laver la surface de la liaison et de relancer l'animal avec une solution saline.
- Soins infirmiers et de l'élevage: Gardez le poisson dans 28,5 ° C moyenne de l'embryon (ZFIN) pendant 5 jours et nourrir 2 fois / jour. Ne pas inclure les poissons dont la teinture ne parvient pas à rester dans le tectum pendant 5 jours dans l'expérience. Remarque: moyen d'embryons (EM) solution est vital pour la survie des poissons et de la température est le facteur clé pour l'étiquetage Dil.
3. Wholemounting Retina et imagerie
- Placer le poisson dans un champ sombre pendant 2 heures avant rétine quilemount.
- Anesthésier le poisson avec de l'eau glacée.
- Percer un trou dans la marge de la cornée et de faire une oeillère en supprimant la cornée avec des ciseaux venus.
- Retirez la lentille, puis rincer le centre de la rétine avec de la glace-froid 1x PBS.
- Rincer l'écart entre la rétine et la sclérotique avec glacée 1x PBS jusqu'à ce qu'aucun pigment est à gauche.
- Couper le nerf optique au niveau du disque.
- Gardez la couche RGC vers le haut et maintenez la rétine avec une cuillère en verre self-made (figures 3A et 3B). Un compte-gouttes peut également être utilisé pour transférer la rétine.
- Mettez la rétine dans une goutte de glycérine à 30% glacé sur une lame avec la couche RGC vers le haut (Figure 3C).
- Retirez la glycérine puis aplatir la rétine sur la lame de verre avant de couper rétine en quatre quadrants (figure 3D). Garder la rétine déplié avec une couche RGC hausse sera utile pour aplatir la rétine.
- Goutte à goutte glacée 50% de glycérine sur til rétine pour laver les fragments de pigment.
- Retirez la glycérine puis déposez 20 pi de glace 75% de glycérine sur la rétine.
- Couvrir l'échantillon avec 1,8 cm x 1,8 cm de lamelle carré.
- Sceller la lamelle avec du vernis à ongles. Immédiatement imagerie de la rétine est recommandée.
- Image non-entrelacé la rétine entière sous une lentille d'objectif 20X (NA = 0,70) avec DP72 CCD (chaque image est de 1360 x 1024 pixels). Chaque champ a trois axes différents.
- Étendre la profondeur de chaque champ avec l'outil de "profondeur de champ étendue" dans le logiciel.
- Monter une rétine virtuel avec la fonction de Photomerge.
- Sélectionner trois domaines de 680 x 512 pixels (surface réelle est de 350 um par 264 um, de 0,092 mm 2) dans chaque orientation de la rétine pour analyser la densité moyenne des CGR (Figure 4A).
- Obtenir la zone avec la fonction de mesures - créer un polygone dans l'imagelogiciel.
- Calculer le nombre total de CGR par l'équation «nombre CGR = x destin zone" 9.
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Representative Results
Comme les figures 4B-D spectacle, le nombre de cellules DiI + est de deux tiers des DAPI + cellules RGCL. Dans une rétine normale, une image de montage de l'ensemble de la rétine (figure 4E) montre que DiI + CGR sont répartis sur toute la rétine, mais dans une rétine régénérée (figure 4F), comme CGR dans la zone centrale n'ont pas régénéré à leur cible à la première semaine, ils ne pouvaient pas être étiquetés.
Figure 1. Appareil de chirurgie utilisé pour le marquage rétrograde de RGC. (A) Utiliser une éponge (a) de fixer le poisson. La plate-forme de fonctionnement (la longueur est de 28 cm, la largeur est de 10 cm, la hauteur est de 5 cm) et de tube de perfusion sont connectés par l'intermédiaire d'une aiguille métallique (b). L'excès d'eau est stockée dans la cavité (c). (B) Un gros plan de l'aiguille métallique. La tête de l'aiguille est enveloppé avec la photopolymérisation liaison (d). (C) Les réservoirs sont utilisés pour stocker MS-222 (e, la longueur est de 6 cm, largeur 10 cm, hauteur 8 cm) et une solution saline (f, la longueur est de 4 cm, la largeur est de 10 cm, hauteur 8 cm), respectivement. Le tube de perfusion (g) relie le réservoir et l'aiguille métallique.
Figure 2. Vue dorsale du crâne de poisson zèbre adulte. (A) le crâne intact avant Rossing. La ligne pointillée jaune marque le tectum; la ligne pointillée rouge indique le télencéphale; et la ligne pointillée verte marque le cervelet. (B) Crâne après peau enlevée. (C) Après la corrosion avec gravure, le crâne est Malacic et une zone concave est souligné par une pince (blanc *). (D) tectum droit est exposée après le crâne est enlevé. L'échelle est de 500 & #956; m.
Figure 3. Des étapes clés de wholemounting rétine. (A) cuillère de verre de fabrication artisanale pour écopant rétine, l'image du bas montre la vue entière. (B) Maintenez la rétine avec la "cuillère" (marqué par la ligne pointillée). (C) Transports de la rétine dans glacée 30% de glycérine. ( D) Couper la rétine en 4 quarts; la flèche indique l'orientation de la coupe. Barres d'échelle (A) de 1 mm; (BD) de 500 um.
F igure 4. L'échantillonnage des CGR de comptage dans la rétine virtuelle. (A) Représentation schématique de la rétine a quatre champs (N, D, V, T) et sur le terrain chacun d'eux atrois domaines qui sont présentées dans une boîte blanche. Notez que le disque optique est généralement situé à l'orientation ventrale-temporelle (point noir). (B) Dil (E) image Montage de la rétine tout étiqueté CGR. (C) DAPI noyau marqué. (D) image fusionnée de CGR et le noyau. chez le poisson zèbre normal. (F) image Montage montrant rétine régénérée après une blessure du nerf optique. La zone centrale de la rétine n'est pas marqué comme CGR n'ont pas régénéré à leurs cibles lors de la première semaine. Abréviations: N = nasale, D = dorsale, ventrale V =, T = temporelle. Barres d'échelle: 30 um (BD); 500 um (E, F).
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Discussion
Marquage rétrograde de RGC est important de rechercher la survie CGR chez les animaux mammifères, mais il n'a pas été utilisée dans le poisson-zèbre. Les méthodes alternatives, coloration HE 7 et la coloration des anticorps 8, ne sont pas des normes de référence pour compter le nombre CGR, et les lignées transgéniques avec tous les CGR marquées n'a pas encore été construit 12, 13. Dans cette vidéo, nous introduisons une méthode de rétrograder CGR d'étiquettes dans la rétine de poisson zèbre adulte. Bien que d'environ 1% des axones projeter à bulbe olfactif ou d'autres 14, cette méthode peut marquer presque tous les CGR dans la rétine.
Comme le poisson zèbre sont trop fragile pour supporter le préjudice physique, ouvrant le crâne de poisson zèbre adulte avec un scalpel incision 3 ou une perceuse 5 15 peut causer la mort. Adoucir le crâne avec gravure peut minimiser les dommages au cerveau. En scellant le trou avec un lien de photopolymérisation et fixer sous une lumière bleue,la plupart des poissons survivent après la chirurgie. Il ne faut que 12 à 15 min pour effectuer l'opération en fonctionnement compétent, ce qui est plus commode et plus efficace par rapport aux rats et d'autres animaux mammifères 5.
Dil pâte tissu-étiquetage est un colorant lipophile. Par rapport à la micro-injection des cristaux Dil ou de solutions concentrées, ce qui améliore la pénétration de la teinture dans le tissu, l'étiquetage des axones à l'intérieur et au-dessous de la surface. En outre, la fluorescence peut persister pendant une longue période de temps 10. D'autre part, ce colorant est absorbé par voie de transport passif, de sorte qu'il est nécessaire de libérer le colorant dans le tectum pendant au moins 5 jours pour le marquage complet.
Le poisson zèbre est un excellent organisme modèle de régénération visuelle. À 7 jours après l'écrasement du nerf optique, presque tous les CGR Axon régénérer le tectum, mais seulement la moitié des CGR régénèrent dans le modèle nerf coupé optique 9. Cette méthode est un moyen idéal pour la recherche RGCs la survie et la régénération après écrasement du nerf optique, ce qui pourrait éviter des blessures supplémentaires sur le nerf optique.
Nous avons présenté un protocole complet pour CGR d'étiquetage succès rétrogrades chez le poisson zèbre adulte et mesurer le nombre CGR dans une rétine wholemount. En outre, en utilisant une liaison de photopolymérisation, nous augmentons le taux de survie d'un poisson zèbre, ce qui rend cette méthode plus efficace.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
