Abstract
우리는 밝은 필드와 미분 간섭 콘트라스트 이미지의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명한다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하는 차동 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. 낮은 개구 수 (NA) 조명, 약한 산란 및 표본에 의한 빛의 약한 흡수 : NIQPM는 전파의 단순화 된 모델을 기반으로, 세 가지 기본 가정으로, 근축 근사라고합니다. 다행히, 흠없는 세포 표본은 이러한 가정을 만족하는 낮은 NA 조명 쉽게 상용 현미경에 달성된다. HTDIC 높은 NA의 illumin 아래를 통해 초점 DIC 이미지에서 체적 정보를 얻는 데 사용됩니다ATION 조건. 높은 NA 조명 광축을 따라 시험편의 향상된 절편을 가능하게한다. 힐버트 DIC 이미지를 변환 처리가 크게 스택 배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 현지화 에지 검출 알고리즘을 향상시킵니다. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 "기성품"현미경을 사용하여 자신의 기술 접근성에 누워. 상용 범위에 느린 Z-스택 획득 시간은 빨리 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 abrogates, 둘째, 회절 효과는 최대 10 0.2에서 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유용성을 제한하는 이러한 방법의 두 가지 기본 제한이 있습니다 각각 (NIQPM) 직경 20 (HTDIC) μm의. 따라서, 그 시험편과 연관된 시간 역학 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기 및 시간 제약을 충족시켜야한다. 호쾌하게, 대부분의 고정 cellula연구 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.
Introduction
광학 현미경의 사용은 이제 세포 생물의 조사에 유비 쿼터스입니다. 때문에 가시 광 스펙트럼을 통해 자신의 낮은 내생 흡수 약한 산란 특성에, 세포는 강하게을 통과하는 광 파의 진폭에 영향을 미치고, 따라서 표준 밝은 필드 현미경으로 몇 군데 때 반투명 표시되지 않습니다. 셀룰러 시험편은, 그러나, 선형 광이 이동하는 공간을 통해 특정 영역에있는 로컬 질량 밀도의 양에 관련된 방법들을 통해 여행 광파를 느리게 않는다. 이 이기종 시간 지연 또는 현미경 표본을 통해 전송 광 파도의 "단계"프로파일의 활용 먼저 프리츠 제르 니케 (1)에 의해 1935 년에 기술 된 실험적 Zernikein 1942 (2)에 의해 실현되었다. 니케는 이러한 성과에 대해 1953 년 노벨상을 수상했다. 혈구 1945 년 3이 양상을 상용화. 1955 년 스미스와 Nomarsk내가 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경, 반대로기구로서 위상의 공간 구배를 사용하는 양상의 사용 4와 5의 이론에 자신의 초기 작품을 것입니다. DIC는 노멀 스키 6 1965in 긴밀한 협력 혈구에 의해 상용화되었다. 1981 년, 두 연구소는 DIC 현미경 7, 8의 광학 기차에 비디오 카메라의 장착으로 처음으로 기록 된 살아있는 세포 DIC 이미지를 보여 주었다. 라이브 세포 이미징의 시대가 탄생했습니다.
이 시간 이후, 상업 현미경에 위상 콘트라스트 및 DIC 모두의 실행은 큰 변화가 있었다. 형태, 세포 내 구조의 추적 및 멤브레인 역학 9의 조사 모니터링 :이 방법은 주로 정성적인 목적을 위해 세포의 이미지를 생산하는 생물 학자들에 의해 사용된다. 이 기술은 위상과 DI 모두 그들의 "기성"구성에서 질적C 이미지는 임의의 광원 강도의 함수, 조명 광학계 설정 및 CCD 카메라 이득, γ, 및 노출 설정이다.
물리학 자 및 광학 엔지니어의 작은 군단 상업 영상 기법으로 정량적하기 위해 노력하고있다. 첫 번째 노력 중 의사 출신 생물 물리학 자 로버트 Barer 시중에서 위상 현미경을 사용하여 이러한 종류의 세포를 통해 위상 변화를 추정하여 세포의 세포 건조 질량을 결정하는 위상 현미경의 사용을 입증하는 1952 년 1953 년 자연에 두 글자가 있었다 10, 11. 위상 현미경 10, 11, DIC 현미경 12-17, 광학 경로 길이, 상, 질량을 결정하는 시야 18 ~ 22 : 필드는 세 가지 기본 레이블이없는 반면 메커니즘을 기반으로 다음의 몇 년 동안 기술의 다수를 개발했다 밀도, 굴절률, 및 셀룰러 볼륨.
파라의llel, 사용자 정의 광학 기기의 큰 컬렉션은 1950 년대부터 개발되었으며, 기생충의 성장 (23) 응용 프로그램에서, 적혈구 (25)의 막 역학 조사에 세포주기 (24)를 문서화에 이르기까지 광학 측정 광범위한 만들었습니다. 특히, 지난 10 년 회절 위상 현미경 (26)의 형태, 단층 위상 현미경 (27), 디지털 홀로그램 현미경 28 단계 민감한 빛 간섭 현미경 29, 공간 광 간섭 현미경 (30), 힐버트에 라벨이없는 양적 현미경의 부를 볼 수있다 위상 현미경 31, 정량적 위상 현미경 32. 그들의 집단의 성공에도 불구하고,이 악기는 복잡한 장비 및 전산 요구 사항을 대부분, 때문에 생물학적 연구의 큰 분야에 전파되지 않았습니다.
여기에서 우리는 거라고명 시야 및 DIC 이미지에서의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경의 사용을 방접원을 그리다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하기 위하여, 미분 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 자신의 기술 접근성에 누워. 성공적인 실행에 필요한 촬상 조건은 대부분 시판 현미경의 정상 작동 범위 내에있다. 또한, 포스트 - 프로세싱 알고리즘이 안정된 퀵하고 견고 - 가능한 고속 푸리에 변환 (FFT) 기반 알고리즘을 사용하여 변환 MATLAB에서 구현 된 것으로.
NIQPM 위상 및 CEL의 축 방향으로 집적 질량 밀도를 재구성하는 방법시야 이미지에서 lular 표본. 시험편의 면적 이상이 축 방향으로 집적 질량 밀도의 합산 시편의 총 건조 물질 함량을 준다. 이 셀의 위상 프로파일이 샘플을 통해 초점 시야 이미지에서 재구성 될 수 있다는 것을 입증되었던 - - NIQPM 프로토콜 Paganin 및 전트 (18, 19)에 의해 마련 실험적 토대에 기반하고 프랭크의 이론적 작품 , Altmeyer과 베르 니케 20 - 효율적인 FFT 기반 방식으로 근축 파 모델을 해결하십시오. 건조 질량 밀도상의 연결 Barer 10, 11 및 페스 쿠 (33)에 의해 워크에 기초한다.
체적 정보는 광축을 따라 시험편의 광학 절편을 활성화 높은 NA 조명 조건 하에서 관통 포커스 DIC 이미지에서 얻을 수있다. 힐버트 DIC 이미지 스택에서 변환 처리를 크게 향상배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 지역화를위한 에지 검출 알고리즘. 우리가 대조 샘플의 자동화 된 체적 분석을위한 기반 소벨 에지 검출 방법을 향상시키기 위해 두 푸리에 필터링 방법을 도입하고 있지만이 작품 Arinson 외. 34 유래. 우리는 또한 회절 한계에서 최대 직경이 36에서 20 μm의 크기에 이르기까지 폴리스티렌 분야에서 이전에 HTDIC을 확인했다.
NIQPM 및 HTDIC 모두 상용 현미경에 자신의 발전으로 인하여 기술적으로 액세스 할 수 있지만, 방법은 근본적 현미경 자체의 하드웨어 구성에 의해 제한된다. 이러한 기술의 주요 제한은 두 가지이다 : 반대로 인해 전체 시료 스테이지의 변환에, 상업용 스코프 느린 Z-스택 획득 시간 그대로 대물 렌즈를 행현재 빠른 약 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 제한하고 둘째, 회절 효과는 각각 직경 10, 20 μm의 0.2에서 크기에 이르기까지 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유틸리티를 제한합니다. 따라서 관심의 표본과 관련 시간의 역학은 일반적으로 "기성"악기에 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기와 시간 제약 조건을 충족해야합니다. 호쾌하게, 대부분의 고정 된 세포 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.
NIQPM 및 HTDIC 프로토콜의 개요를 그림 1에 나타내었다. 도 2에서 우리는 시야 및 DIC 이미징 모두 낮고 높은 두 NA 조명 조건 하에서 최적 및 차선 관통 포커스 이미징을 도시한다. 3,4 성공 및 실패의 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여 피규어.
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Protocol
1. 현미경 사양
올바른 방식으로 이미징을 수행하기 위해 현미경은 다음과 같은 사양을 가지고 있어야합니다 :
- 미분 간섭 대비 (DIC) 및 시야 (BF) 대비 모두를 가지고있다.
- 컴퓨터로 제어되는 Z 축 이동을해야합니다.
- 집광 렌즈의 개구 수를 변경하는 조절 조리개가 있습니다. 등급 판정 규칙 또는 전자 판독 가진 조리개 개구 수의 값을 알 필요가있다. 개구 NIQPM 0.1에서 HTDIC 0.9 (또는 그 이상)까지 다양합니다.
- 현미경 시야 촬상에 이용되는 협 대역 색상 필터를 가져야한다. 이 필터는 굴절 증가, NIQP에 대한 질량 밀도의 위상을 변환하는 데 사용되는 파장에 의존 골절을 해결하기 위해 필요합니다.
2. 미분 간섭 대비 (DIC) Z-스택 취득
- SlideBook 소프트웨어를 엽니 다차 이미지 컬렉션에 대한 새 슬라이드를 만들 수 있습니다.
- 다음으로, 초점 창을 엽니 다. 필터 설정 섹션에서, DIC를 선택합니다. 범위 탭에서, 콘덴서 섹션에서 멀리 오른쪽 위치 (모든 길을 열어)에 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다. 이는 높은 개구 조명을 제공하고, 시료의 광학 절편을 향상시킨다.
- DIC의 목표를 사용하여 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 샘플이 쉽게 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 카메라가 포화되지 않는 보장하기 위해, 초점 창에 카메라 탭을 선택하고 픽셀 세기의 히스토그램이 카메라의 동적 범위 내에 있는지 확인합니다.
- 이미지 캡처 창을 엽니 다. 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다. 3D 캡처 섹션에서, 센터 주변의 범위를 선택하고 현재의 위치로 돌아 가기
- 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 DIC의 상자를 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지 이름을 지정하고 영상을 시작하려면 시작을 선택합니다.
3. 시야 (BF) Z-스택 취득
- 현미경은 시료의 DIC의 Z-스택을 수집 완료되면, 초점 창을 열고 필터 설정 섹션에서 열기를 선택합니다. 낮은 NA 조명을 제공하기 위해 (모든 방법을 폐쇄) 멀리 왼쪽 위치로 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다.
- 녹색으로 현미경 빛 경로 필터를 변경합니다. 샘플이 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 선택하여 카메라의 더 채도가 없는지 확인
- 이미지 캡처 창을 엽니 다. DIC Z-스택을 수집에서 3D 캡처 설정이 표시됩니다.
- 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 열기 확인란을 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지의 이름, 및 Z-스택의 이미지 수집을 시작하려면 시작을 선택합니다.
4. Z-스택 이미지 내보내기
- Z-스택 캡처를 엽니 다. 100 %로보기를 변경합니다. 공 사이에 표시되는 화소 값의 히스토그램 및 카메라의 최대 화소 값 (4095 12 비트 카메라, 16 비트의 경우 65,535.) 조정한다.
- 보기> 내보내기> TIFF 시리즈를 선택합니다. 이 TIFF 이미지의 일련의 Z-스택을 내 보냅니다(각 Z 평면에 대해 하나). 말 (즉, "DIC 스택 1_")의 밑줄이있는 이름으로 별도의 폴더에 TIFF 시리즈를 저장합니다. 각 DIC 또는 BF Z-스택이 작업을 반복합니다.
5. 볼륨 측정
- "JoVE_HTDIC_v1.m"라는 제목의 HTDIC MATLAB 프로그램을 엽니 다.
- HTDIC 프로그램 제 0에서 종속 디렉토리 변수를 업데이트합니다. 복사 "dependencies_directory ="다음 작은 따옴표 사이에있는 탐색기에서 hilbert_transform_dic.m 및 sobel_edge_detect.m 파일 (PC)를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. JoVE_HTDIC_v1.m 프로그램의 ExecuteSection 0.
- 제 1 항에서 "images_directory"을 업데이트합니다. 다시 말하지만, 복사 따옴표 사이에. TIF 형태를 통해 초점 이미지를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다.
- 정렬 힐버트에 대한 이미지의 회전은 실행을 코드의 2 절을 변환 할 수 있습니다. "HTDIC 매개 변수 정의"라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 다섯 번호 18RS는 사용자로부터 요구된다 : 샘플의 DIC 이미지의 초점이 초점면 번호는, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축선 단계에서 영상 획득을 위해 0.1이다), DIC 화상의 회전 각도는 힐버트 변환을 수행하기 위해 필요한, 전형적인 값은 45, -135이다. 마지막으로, 그 크기의 지역을 입력,이 매개 변수를 이후에 나타납니다 상자의 측면의 길이를 정의 - 일반적인 값은 400입니다. 확인을 클릭합니다.
- 초점면 번호로 지정 DIC 초점면의 이미지는 청색 상자로 나타날 것이다. 셀 예를 들면, 그 기능에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 상자가 원하는 지역, 상자 안쪽을 두 번 클릭에 배치되면.
- 또 다른 그림은 이제 나타납니다 :이 그림은 이전 단계에서 선택한 관심 영역의 자른 및 회전 된 이미지가 포함되어 있습니다. 화상의 콘트라스트는해야밝은 기능은 오른쪽에 표시하면서 그 어두운 기능은 왼쪽에 나타납니다. 관심 영역에 파란색 상자를 드래그하여, 필요에 따라 바꿀.
- 3 장에서는 Z-스택 큐브에 대한 마스크를 생성합니다. 사각형 마스크 세포 주위에 사각형 손으로 그 셀 외곽선을 프리 핸드 툴을 만들 수 : 가능한 마스크의 두 가지 유형이 있습니다.
- 직사각형 마스크의 주석 라인 167 및 주석 행 (170) (그 줄의 시작 부분에 "%"를 배치하여 줄을 주석으로) 생성합니다. 프로그램의 제 3 항을 실행합니다. 이미지를 클릭하고 사각형 마스크 정의를 시작하기 위해 마우스를 드래그합니다. 그것을 받아들이는 상자를 두 번 클릭합니다.
- 손으로 그린 마스크, 주석 행 167과의 주석 라인 (170)을 생성하고 3 절을 실행합니다. 클릭하고 마우스로 원하는 마스크를 그립니다. 그것을 받아들이는 마스크를 두 번 클릭합니다.
- 힐버트를 구성 4to 실행 섹션 DIC 이미지 스택과 관심 영역의 해당 DIC 이미지 스택을 바꾸었다.3 장으로 구성 마스크는 DIC 스택과 "maskON는"라인 179에서 1로 설정되어 일반 DIC 스택을 변환 힐버트에 적용됩니다. 0 "maskON"을 설정하면 마스크를 적용하지 않고 이미지 스택을 구성합니다.
- 관심 영역의 XZ의 단면 이미지의 이미지 분할을 최적화하기 위해 5 절을 실행합니다. 프로그램에 의해 생성 된 그림 500, 대조의 세 가지 유형의 표시가 나타납니다. 셀의 경계를 찾는 알고리즘의 성공은 사용 마스크 및 프로그램의 라인 (229)에서 "임계"값의 조합에 의존하고있다. 0.5의 값으로 시작합니다. 임계 값을 조정하고 적절한 개요이 열 중 하나에 도달 할 때까지 프로그램의이 부분을 다시 실행하십시오.
- 개요는 1 열에서 가장 인 경우, DIC 이미지 분할을 사용하여 볼륨을 결정하기 위해 제 6를 사용합니다. 2 열은 최적의 결과를 제공 한 경우, 힐버트 변환 된 DIC 이미지에서 세포 부피를 결정하는 제 7을 실행합니다. 만약 3 열 GAV전자 최적의 결과를 실행 제 8 푸리에 필터링 힐버트 변환 된 DIC 이미지를 사용하여 볼륨을 결정합니다.
- 입방 μM (FL)에보고 된 샘플의 부피는 측정, 체적 측정이 선택에 따라 프로그램에 의해 생성 된도 600, 700, 또는 800의 표제로 표시된다.
6. 질량 측정
- "JoVE_NIQPM_v1.m"라는 제목의 NIQPM MATLAB 프로그램을 엽니 다.
- NIQPM 프로그램 제 0에서 프로그램을 실행하는 데 필요한 세 개의 디렉토리의 위치를 업데이트합니다. 이들은 "dependencies_directory," "brightfield_directory"및 아르 "dic_directory."
- 다음, 제 1 항을 실행합니다. 이 코드 부분은 이미지의 전체 세트의 전체 필드의 시야 이미지 큐브를 생성합니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다.
- 다음으로, 제 2를 실행합니다. "NIQPM 매개 변수 정의"라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 네 개의 숫자는 사용자의 필요 : 초점면 번호 위치의 시야 이미지샘플에 초점이, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축 단계로 화상 취득을 위해 0.1이다) 및 그 크기의 영역은,이 파라미터의 변의 길이를 정의 이후에 나타납니다 상자 - 일반적인 값은 200입니다. 확인을 클릭합니다.
- 초점면 번호로 지정 시야 초점 평면의 이미지는 파란색 상자로 표시됩니다.
- 이미지에 포커스가없는 경우, 파란색 상자를 다시 실행 2 절에서 두 번 클릭하여 대화 상자에서 초점면의 수를 조정해야합니다.
- 이미지의 초점이있는 경우, 이미지의 주위에 파란색 상자를 끌어 상자의 노드를 선택하고 필요에 따라 끌어 크기를 조정합니다. 셀 예를 들면, 그 기능을 주위에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 그것을 받아들이는 상자 안쪽을 두 번 클릭합니다.
- 다음으로, 실행 시야 이미지의 스택을 구성하는 제 3 절에서의 영역으로 자른의 terest.
- 위상지도, 의사 DIC 이미지, 그리고 시야의 이미지와 실제 DIC 이미지에 대한 비교를 생성하려면, 섹션 4를 실행합니다.
- 의사와 DIC와 질량 밀도지도, 전체 질량 및 세포 밀도의 히스토그램 최대한 유사 진정한 DIC 이미지 섹션 5A 또는 5B를 실행함으로써 결정될 수있다. 라인 300에 최적화 "임계 값"- - 섹션 5A 필드의 자동 보더 검출을 수행 일반적인 값은 0.1 ~ 1 사이에 다릅니다. 임계 값을 최적화하기 위해 필요에 따라이 부분을 다시 실행하십시오. 사용자가 관심있는 셀을 설명 후 절 (5b)는 등의 질량 측정을 수행한다.
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Representative Results
를 통해 초점 이미지 수집하는 동안 올바른 샘플 조명 NIQPM 차 HTDIC 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 그림 2에서 우리는 DIC와 폴리스티렌 구와 인간의 대장 선암 세포주 SW620에 대한 시야 대비 모두에서 낮은 높은 NA 조명을 보여줍니다. 2A 피규어, 2C, 2I, 그리고 2K가 NIQPM에 대한 최적의 영상을 보여줍니다. 2 층 2H 피규어, 2N 및 2P는 HTDIC에 대한 최적의 영상을 보여줍니다.
도 3 및도 4는 성공 및 실패를 모두 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여준다. 예상 프로파일이 이론적으로 알려져 있고, 따라서 NIQPM 재구성에 직접 비교 될 수있다 -도 3에서 우리는 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 위상 프로파일을 찾아.
, 직접 광학 측정에서 결정된 실제 DIC 이미지에 - 복원 단계에서 계산 - 위상이 속성 선험적으로 알 수없는 세포 표본은 "의사 DIC"이미지를 비교하는 절차와 함께 NIQPM를 사용하여 복원 할 수 있습니다 셀. 계산이 중심이되는 밝은 필드 이미지 스택에서 비행기 - NIQPM 한 무료 매개 변수가 있습니다. 이 중앙 초점면은 correspondin에게 의사 DIC 진정한 DIC 이미지. 그림 4E-G는 초점이 맞지 의사 DIC 이미지, 최적의 의사 DIC 이미지를 보여 가능한 한 유사하게 될 때까지 조정되어야한다0.9의 조명 NA로 찍은 셀의 G DIC 이미지. 흥미롭게도, 최고의 위상지도 및 해당 의사 DIC 이미지는 반드시 초점 시야 이미지, 즉.도 1A 및 1B에 해당하지 않습니다.
마지막으로,도 5는 HTDIC 화상 처리 알고리즘에 관련된 단계를 도시한다. NA에서 DIC를 통해 초점 이미지 = 0.9 조명에서, 5A 및 5D 피규어, 힐버트 변환은 DIC 이미지의 부조를 제거하기 위해 미리 형성되고, (b) 및 (e) 피규어. 이것은 일부는 하이 패스 푸리에 필터링에서 제거 할 수 있습니다 광축을 따라 블러와 함께 제공, (c) 및 5 층 피규어. 선택된 최종 이미지는 쉽게 전체 셀룰러 볼륨을 유추 시험편의 각 단면 평면 내의 영역을 결정하기 위해 분할되어있다.
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그림 1. NIQPM 및 HTDIC 워크 플로우. (1.) 등의 세포와 같은 현미경 표본 현미경에 장착되어야한다 Fluoromount G.를 사용하여 샘플에 부착 된 커버 유리와 슬라이드 (2.) DIC 및 표준 시야 대비 모두에서 인수를 통해 초점 이미지 "기성품"현미경 화상 처리 알고리즘에 대한 입력을 형성한다. (3.) MATLAB에서의 이미지 후 처리 DIC에서 세포 부피와 시야 이미지에서 세포 질량 분포를 결정합니다. (4.) 양 끝점 측정 :. 열지도 및 막대 그래프 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 스루 포커스 DIC 및 폴리스티렌 분야 및 SW620 세포 라인의 명 시야 이미지. NIQPM위한 최적의 촬상 조건은 0.1 NA의 조명 시야 대조적이다. HTDIC DIC의 경우, 0.9 NA 조명에 최적입니다. (A, B) 욕실은 각각 0.1 NA 0.9 NA 조명에 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 대상의 시야 이미지에 직면하고 있습니다. (C, D) 0.1 NA 0.9 NA 조명에 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 주제의 횡단면 시야 이미지였다. (E, F) 욕실 얼굴 DIC의 0.1 NA 0.9 NA 조명에 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 피사체의 이미지였다. (G, H) 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 영역의 교차 단면 DIC의 이미지각각 0.1 NA 0.9 NA 조명에 ubject. (I는 J) 욕실은 각각 0.1 및 0.9 NA 조명에 SW620 대장 암 세포주 제목의 시야 이미지에 직면하고 있습니다. (K, L) 각각 횡단면 0.1 SW620 세포 대상의 시야 이미지와 0.9 NA 조명. (M, N) 욕실 얼굴 DIC의 0.1 NA 0.9 NA 조명에 SW620 세포 제목의 이미지였다. (O, P) 0.1 NA 0.9 NA 조명에 SW620 세포 제목의 횡단면 DIC의 이미지는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 최적 및 차선 위상 복원 :. 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 각 행은 초점면이 구면을 통해 중간에서 시작으로 EN 밝은 전계 강도 (제 칼럼) 및 재구성 된 위상 프로필 얼굴의 초점면 의존성을 조사, Z = 0 , 1 μm의 단계에있는이 비행기 과거 이동합니다. 위상의 대각선을 따라 재구성 된 위상 프로필 (A, E, I, M) E N 시야 강도에 직면, (B, F, J, N)에 대응 위상 재건, (C, G, K, O) 비교 지도, 블루 원, 이론적 빨간색 위상 프로필, 및 제조 업체의 오류 허용 오차, 검정 선, (D, H, L, P) 백분율 (%) 재구성 P의 오류하세 이론적 위상 프로필에 대해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 최적 및 차선 위상 복원 :. SW620 세포 두 개의 열 위상 계산을 중앙에 Z-스택에서 차선의 최적의 시야 이미지 평면 (A, B)를 비교합니다. 해당 위상 재구성 (C, D)은 의사 DIC 콘텐츠 (E, F)를 생성하는 데 사용된다. 이들은 진정한 DIC 이미지에 비교, NA는 (G)에, 0.9 조명을 =. 유용한 DIC 이미지와 일치하는 의사 DIC 콘텐츠 시야 IMA로부터 올바른 입력 이미지를 결정GE의 스택 위상 재건에 사용합니다. 마지막으로, 단계가 예상 질량 밀도 (H, I)에 매핑됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. HTDIC를 사용하여 최적의 DIC의 대비 향상 : 폴리스티렌 분야 및 SW620 세포. 4.8 폴리스티렌 구 (A) 단면 DIC의 형상, (B) HTDIC 콘텐츠 대응, (C)는 푸리에 HTDIC 화상을 여과 하였다. 구 이미지의 축 방향 치수는 시편 (1.597)의 굴절률이 일치하고 설치 미디어 (1.4)을 고려하여 조정되었습니다. (DF)는 더 굴절 I로, 그러나, SW620 세포에 대한 동일한 화상 타입을 보여시편의 약한 지수 대비 때문에 nDex의 불일치 수정. 어떤 임계 값이 이미지에 실행되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
일반적으로, NIQPM는 0.25-44.7에 이르기까지 광학 경로 길이에 대한 유효성을 검사 회절 제한 기술이다. 유효성 검사가 N에서 수행 하였다 = Fluoromount G 현탁 0.11-9.8 μM에서 직경 이르는 1.596 폴리스티렌 구체 (데이터는 도시되지 않음). 세포는 거의 0-7 범위의 광학 경로 길이를 가지고있다.
시편의 밀도 분포를 측정 할 때 하나는 밀도지도 원치 않는 기여를 보유하는 동안 의사 DIC 이미지가 잘 보이는 것을 알 수 있습니다. 이것은 NIQPM 알고리즘에 대한 입력으로서 사용 시료의 시야 이미지의 노이즈에 기인한다. NIQPM 방법에 두 가지 변형이 원치 않는 기여를 제거하는 데 사용할 수 있습니다 : 첫째로, 하나는 신호 대 잡음 시야 이미지의 향상에 더 이상 노출 시간을 사용할 수 있습니다. 광학 박막 시료를 이미징 할 때 특히 중요합니다. 대안 적으로, 하나는 Z-스택 acquisit의 축 방향 간격을 감소시킬 수있다NIQPM 알고리즘에를 입력하기 전에 함께 0.1-0.05 ㎛의 평균 2 ~ 3면에서 이온.
HTDIC 기반 볼륨 결정은 1-20 μm의에서 직경까지 폴리스티렌 분야에서 검증되었으며, 공 초점 형광 현미경 (35)와 교차 검증되었습니다. 기술 인해 광학계의 점 분포 함수와 연관된 회절 효과 시스템의 회절 한계 이하 객체의 볼륨을 과대.
어쩌면 작거나 얇은 시편에 필요한 HTDIC 볼륨 결정 문제 해결. 에러의 주요 소스는 단면 영상에서 셀의 경계를 결정하는 데 사용되는 내장 MATLAB 기반 소벨 에지 검출을 사용하여 이미지 분할에서 온다. HTDIC 프로그램의 4 절에 "임계 값"의 값은 가장 세분화를 얻는 것이 중요합니다. 결과는 비선형 방식으로 변화하는 경향이 - "임계 값"drasticall의 작은 변화y는 에지 검출로 인한 동봉 된 영역을 변경. 현재 프로그램은 DIC의 Z-스택, HTDIC Z-스택, 또는 F-HTDIC Z-스택 하나에서 영상 분할을 수행 할 수있는 옵션을 사용자에게 제공합니다.
혼자 DIC 큰 시편 나은 경우가 많습니다 동안 HTDIC 작은 표본 (<직경 5 μm의)에 대한 F-HTDIC 일.
마스크 세그먼트 방법의 능력을 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 섹션 2는 사용자가 이미지 큐브에 적용 할 마스크를 결정할 수있다. 큐브의 수직 (Y-정도)를 유지하면서 우리는 큐브의 가로 (X-정도)를 절단 직사각형 마스크의 사용을 권장합니다.
요약하면, NIQPM 및 HTDIC는 대부분의 기존 방법과는 대조적으로, 표준 "기성품"광학 현미경에서 수행 될 수 기술적 접근 정량적 영상 기법이다. 이 기술의 핵심은 하거든 Appr에서 샘플을 통해 초점 이미지입니다opriate 이미징 조건 : NIQPM 낮은 NA 조명 및 HTDIC 높은 NA 조명. 여기에 제시된 방법은 여기에 설명되지 않은 다른 시스템에 사용하기 위해 일반화 될 수있다. 이러한 절차에 필요한 주요 기준은 사용자가 스테이지의 Z-이동하고, 대물 렌즈의 초점 위치가 변화되기 때문에, 화상을 취득 할 수있는 기능에 대한 제어를 보유하는 현미경이다. 제시된 방법은 고정 된 세포를 영상화 천천히 생물 표본을 이동하기에 적합하다.
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Disclosures
저자가 제시하는 일에 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (OJTM에 KGP, OJTM 및 R01HL101972에 U54CA143906)와 오레곤 의료 연구 재단 초기 임상 연구자 상 (KGP)에서 교부금에 의해 지원되었다. OJTM는 미국 심장 협회 (American Heart Association) 설립 탐정 (13EIA12630000)입니다. 우리는이 작업에 사용 된 세포 샘플을 준비하는 나이트 암 연구소의 박사 에릭 앤더슨 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
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