Abstract
אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים התערבות ההפרש לעומת זאת. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC) כדי לקבוע את עוצמת קול. NIQPM מבוסס על מודל פשוט יותר של התפשטות גל, כינה הקירוב הפרקסיאלית, עם שלוש הנחות יסוד: תאורת צמצם מספרי נמוך (NA), פיזור חלש, וקליטה חלשה של אור על ידי הדגימה. למרבה המזל, דגימות סלולריות בלא כתם לספק את ההנחות הללו ותאורת NA נמוכה מושגת בקלות על מיקרוסקופים מסחריים. HTDIC משמש כדי להשיג מידע נפחית מדימויי דסק"ש באמצעות פוקוס תחת illumin NA הגבוהתנאי ation. תאורת NA גבוהה מאפשרת חתך משופר של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על תמונת דסק"ש ערימות משפר באופן משמעותי אלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם באמצעות מיקרוסקופים "ה-off-המדף". ישנן שתי מגבלות בסיסיות של שיטות אלה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים כיום מבטל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים מ0.2 עד 10 (NIQPM) ו20 מיקרומטר (HTDIC) בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את דינמיקת הדגימה והזמן הקשורים אליו עניין לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה. מרגש cellula, הקבוע ביותרדגימות r נחקרות בקלות עם שיטות אלה.
Introduction
השימוש במיקרוסקופ אופטי הוא בכל מקום בחקירה של אורגניזמים סלולריים עכשיו. בשל מאפייניהם נמוכים אנדוגני הספיגה ופיזור חלש על פני הספקטרום האופטי לעין, תאים אינם בתוקף להשפיע על המשרעת של גלים אופטיים חוצים אותם ובכך מופיעים שקוף למחצה כאשר צילמו עם מיקרוסקופים שדה בהיר סטנדרטיים. דגימות נייד, לעומת זאת, להאט את הגלים אופטיים נסיעה דרכם באופן שקשור באופן ליניארי לכמות צפיפות מסה המקומית באזור מסוים של מרחב שדרכו האור עובר. ניצול של הפיגור הזה הטרוגנית זמן או פרופיל "שלב" של גלים אופטיים מועברים באמצעות דגימות מיקרוסקופיות תואר לראשונה בשנת 1935 ידי פריץ Zernike 1 והבין באופן ניסיוני על ידי Zernikein 1942 2. Zernike זכה בפרס נובל ב -1953 להישג זה. Zeiss ממוסחר שיטה זו בשנת 1945 3. ב1955, סמית וNomarskהייתי להציג את עבודתם הראשונית בשימוש 4 והתאוריה 5 של התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC), שיטה המשתמשת בשיפוע המרחבי של שלב כמנגנון הניגודיות. דסק"ש היה ממוסחר על ידי Zeiss ב1965in שיתוף פעולה הדוק עם Nomarski 6. ב1981, שתי מעבדות הפגינו הדימויים הראשונים נרשמו תא חי דסק"ש עם שילוב של מצלמות וידאו לתוך רכבת האופטיקה של המיקרוסקופ דסק"ש 7, 8. העידן של הדמיה תא חי נולד.
מאז הפעם, הביצוע של שניהם בניגוד השלב ודסק"ש במיקרוסקופים מסחריים היה ללא שינוי במידה רבה. שיטות אלה מנוצלים בעיקר על ידי ביולוגים כדי להפיק תמונות של תאים למטרות איכותיות: ניטור של מורפולוגיה, מעקב של מבני subcellular, וחקירות של דינמיקת קרום 9. טכניקות אלו הן איכותיות בתצורה שלהם "ה-off-המדף" כשתי שלב וDIתמונות C הן פונקציות שרירותיות של עוצמת מקור האור, אופטיקה הגדרות תאורה, ועלייה במצלמת CCD, גמא, והגדרות חשיפה.
לגיון קטן של פיסיקאים ומהנדסים אופטיים השתדל להפוך את שיטות הדמיה מסחריות כמותית. בין המאמצים הראשונים היו שני מכתבים לטבע ב1952 ו1953 שברופא שהפך biophysicist רוברט Barer הפגין את השימוש במיקרוסקופ שלב לקביעת מסה יבשה סלולרית של תאים על ידי אומדן שלב משמרות באמצעות סוגים אלה תא באמצעות מיקרוסקופ שלב זמין מסחרי 10, 11. השדה פיתח מספר רב של טכניקות במהלך השנים שלאחר מכן התבססו סביב שלושה מנגנונים בסיסיים ללא תווית ניגוד: מיקרוסקופיה שלב 10,11, מיקרוסקופיה DIC 12-17, ושדה בהיר 18-22 כדי לקבוע אופטית נתיב באורך, שלב, מסה צפיפות, מקדם שבירה, ונפח תא.
בפסקהllel, אוסף גדול של מכשירים אופטיים מותאמים אישית יש גם פותחו מאז 1950s, והפך את מרחיקת לכת מדידות אופטיות הנעות בין יישומים בצמיחת טפיל 23, לתיעוד מחזור 24 התא לחקירת דינמיקת קרום של תאי דם אדומים 25. בפרט, בעשר השנים האחרונות ראו שפע של מיקרוסקופיה כמותית ללא תווית בצורת מיקרוסקופית שלב עקיפה 26, מיקרוסקופיה שלב טומוגרפית 27, מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית 28, מיקרוסקופיה קוהרנטיות אופטית רגישה שלב 29, מיקרוסקופיה הפרעות אור מרחבי 30, הילברט שלב 31 במיקרוסקופיה, ומיקרוסקופיה שלב הכמותי 32. למרות ההצלחות הקולקטיביות שלהם, מכשירים אלו לא היו מופצים לשדה הגדול יותר של חוקרים ביולוגיים בשל, בעיקר, למכשור המורכב שלהם ודרישות חישובית.
במסמך זה אנו דescribe השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים דסק"ש. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC), כדי לקבוע את עוצמת קול. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם. תנאי ההדמיה הנדרשים לביצוע המוצלח שלהם במסגרת פעולה הרגילה של רוב המיקרוסקופים זמינים מסחרי. בנוסף, האלגוריתמים שלאחר העיבוד הם יציבים, מהירים, וחזקים - שיושם בMATLAB באמצעות פורייה מהיר להפוך אלגוריתמים מבוססים (FFT) בכל ההזדמנות אפשרית.
NIQPM היא שיטה לשחזר שלב וצפיפות המסה המשולבת axially של celדגימות lular מדימויי שדה בהירים. סיכום של צפיפות מסה משולבת axially זה על פני השטח של הדגימה נותן תוכן המסה היבש הכולל של הדגימה. פרוטוקול NIQPM מבוסס על היסודות שהונחו על ידי הניסיוניים Paganin ו18 נוג'נט, 19 - שבו הוכיח כי פרופיל השלב של תא יכול להיות משוחזר מדימויי שדה בהיר דרך הפוקוס של המדגם - והעבודה התיאורטית של פרנק , Altmeyer, ו20 רניקה - בפתרון המודלים גל הפרקסיאלית באופן מבוסס FFT יעיל. החיבור של שלב לצפיפות המסה היבשה מבוסס על העבודה על ידי 10 Barer, 11 ופופסקו 33.
ניתן לקבל מידע נפחית מדימויי דסק"ש באמצעות פוקוס בתנאי תאורת NA גבוהים המאפשרים חתך אופטי של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על ערימות תמונת דסק"ש משפר באופן משמעותיאלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. עבודה זו מקורו בArinson et al. 34 למרות שאנחנו הצגנו שני שיטות הסינון פורייה כדי לשפר את הניגודיות ושיטת גילוי קצה מבוססת סובל לניתוח נפח אוטומטי של המדגם. גם יש לנו תוקף HTDIC בעבר בתחומי קלקר החל בגודל גבול ההשתברות עד 20 מיקרומטר בקוטר 36.
בעוד שני NIQPM וHTDIC הם מבחינה טכנולוגית נגישים בשל התפתחותם במיקרוסקופים מסחריים, השיטות מוגבלות ביסודה על ידי תצורת החומרה של המיקרוסקופים עצמם. המגבלות העיקריות של טכניקות אלה הן כפולה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים, הנובע מתרגום של שלב המדגם כולו בניגוד לסתם העדשה האובייקטיבית, כיום מגביל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר בערך 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים הנעים בגודל 0.2 עד 10 ו20 מיקרומטר בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את הדגימה ודינמיקת הזמן הקשור של ריבית חייבת לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה על מכשירים טיפוסיים "ה-off-המדף". בהתלהבות, רוב הדגימות סלולריות קבועות נחקרות בקלות עם שיטות אלה.
סקירה של NIQPM ופרוטוקולי HTDIC ניתנת באיור 1. באיור 2 אנו מדגימים הדמיה באמצעות פוקוס אופטימלי והכי מוצלחת בתנאי תאורת NA הן נמוכים וגבוהים עבור שניהם בשדה בהיר ודימויים דסק"ש. איורים 3 ו -4 להדגים את תלות הפרמטר של אלגוריתם NIQPM הדגשת מימושים מוצלחים ולא מוצלחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מפרט מיקרוסקופ
כדי לבצע את ההדמיה בצורה הנכונה את המיקרוסקופ צריך את המפרט הבא:
- יש גם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) וbrightfield ניגוד (BF).
- יש תנועת Z-ציר מבוקרת מחשב.
- יש תחנת צמצם מתכוונן להשתנות הצמצם מספרי עדשת הקבל. צמצם עם שלטון מדורג או קריאת נתונים אלקטרוניים נדרש לדעת את הערך של הצמצם המספרי. הצמצם המספרי צריך לנוע בין 0.1 לNIQPM עד 0.9 (או יותר) לHTDIC.
- מיקרוסקופ צריך מסנן צבע פס צר כדי להיות מנוצל עבור הדמיה בתחום בהירה. מסנן זה נדרש על מנת לתקן את התוספת השבירה, facture אורך גל תלוי המשמש להמרת שלב לצפיפות מסה לNIQP.
2. התערבות ההפרש לעומת זאת רכישת Z-מחסנית (DIC)
- פתח את תוכנת SlideBooknd ליצור שקופית חדשה לאוסף תמונה.
- בשלב הבא, לפתוח את חלון הפוקוס. תחת סעיף סט סינון, בחר דסק"ש. בכרטיסייה היקף, תחת סעיף הקבל, להתאים את סרגל שקופיות צמצם לעמדה הימנית הרחוקה (לפתוח את כל הדרך). זה מספק תאורת צמצם מספרית גבוהה ומשפר את חתך אופטי של הדגימה.
- פוקוס על המדגם באמצעות מטרת דסק"ש. התאם את עוצמת מנורת הלוגן עד המדגם הוא לעין בקלות. כדי להבטיח שהמצלמה לא להיות רוויה, בחר בכרטיסייה המצלמה בחלון הפוקוס ולבדוק כי היסטוגרמה של עוצמות פיקסל נמצאת בטווח הדינמי של המצלמה.
- פתח את החלון לכידת תמונה. במקטע סוג לכידת, סמן את תיבת 3D. בסעיף לכידת 3D, בחר את טווח סביב מרכז וחזור למיקום הנוכחי
- בקטע הגדר סינון של החלון לכידת תמונה, סמן את תיבת דסק"ש ולציין זמן חשיפה. במקטע פרטי תמונה, שם תמונה (אופציונלית), ובחר התחל ליזום ההדמיה.
3. שדה מואר (BF) רכישת Z-מחסנית
- ברגע מיקרוסקופ סיים איסוף Z-מחסנית דסק"ש של המדגם, פתח את חלון הפוקוס ובחר פתיחה תחת סעיף הסט המסנן. התאם את המחוון צמצם למצב הרחוק משמאל (סגר את כל הדרך) כדי לספק תאורת NA נמוכה.
- לשנות את מסנן אור נתיב מיקרוסקופ כדי ירוק. התאם את עוצמת מנורת הלוגן עד המדגם הוא גלוי לעין. להבטיח שאין רוויה של המצלמה על ידי בחירה
- פתח את החלון לכידת תמונה. ההגדרות לכידת 3D מרכישת Z-מחסנית דסק"ש יוצגו.
- בקטע הגדר סינון של החלון לכידת תמונה, סמן את התיבה הפתוחה ולציין את זמן חשיפה. במקטע פרטי תמונה, שם תמונה (אופציונלית), ובחר התחל ליזום רכישת תמונת Z-מחסנית.
4. יצוא Z-מחסנית תמונות
- פתח לכידת Z-מחסנית. לשנות את התצוגה ל100%. התאם את היסטוגרמה של ערכי פיקסל שיוצג בין 0 לבין ערך פיקסל המקסימאלי של המצלמה (4,095 ל12 מצלמות קצת, 65,535 ל16 קצת.).
- בחר סדרת תצוגה> יצוא> TIFF. זו תייצא את Z-המחסנית כסדרה של תמונות TIFF(אחד לכל מטוס Z). שמור את סדרת TIFF בתיקייה נפרדת עם שם שיש לו קו תחתון בסוף (כלומר "סטאק 1_ דסק"ש"). חזור על פעולה זו עם כל דסק"ש או BF Z-מחסנית.
5. מדידות נפח
- פתח את תכנית HTDIC MATLAB שכותרתו "JoVE_HTDIC_v1.m".
- לפי סעיף 0 של תכנית HTDIC, לעדכן את משתנה ספריית תלות. העתק והדבק את הספרייה המכילה את hilbert_transform_dic.m וקבצי sobel_edge_detect.m מExplorer (PC) שבבין הגרשיים בודדים הבאים "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 של תכנית JoVE_HTDIC_v1.m.
- בסעיף 1, עדכן את "images_directory". שוב, להעתיק ולהדביק את הספרייה המכילה את התמונות באמצעות פוקוס ב. צורת tif בין המרכאות בודדות. רק לרוץ סעיף 1 פעם אחת.
- יישור וסיבוב של תמונות להילברט להפוך הפעלת סעיף 2 לקוד. תיבת הדו שיח שכותרתו "הגדרת פרמטרי HTDIC" תופיע. חמישה numbers נדרש מהמשתמש: מספר מטוס המוקד שבו תמונת DIC של המדגם היא בפוקוס, ברזולוציה לרוחב (מיקרומטר / פיקסל בתמונה), ברזולוציה צירית (זה 0.1 לרכישת תמונה ב0.1 מיקרומטר צעדים צירי), זווית הסיבוב של תמונת דסק"ש דרושה כדי לבצע את הילברט לשנות, ערכים אופייניים הם 45 ו-135. לבסוף, להיכנס לאזור בגודל ריבית, פרמטר זה מגדיר את אורכו של הצד השני של תיבה שלאחר מכן תופיע - ערך טיפוסי הוא 400. לחץ על אישור.
- תמונה של מטוס מוקד דסק"ש צוין במספר מישור המוקד תופיע עם קופסא כחולה. מקם את התיבה על התכונה של עניין, לדוגמא: תא. התיבה לא צריכה להיות מרובעת. לאחר שהתיבה כבר ממוקמת מעל האזור הרצוי, לחץ לחיצה כפולה בתוך הקופסה.
- נתון נוסף יופיע כעת: נתון זה מכיל תמונה חתוכה ומסובבת של האזור של העניין בחר בשלב הקודם. הניגודיות של התמונה צריכה להיות כזהתכונות שכהות מופיעות בצד השמאל ואילו תכונות בהירות מופיעות בצד הימין. גרור את התיבה הכחולה מעל האזור של עניין, לעצב מחדש לפי צורך.
- סעיף 3 יוצר מסכה לקוביית Z-המחסנית. ישנם שני סוגים של מסכות זמינות: מסכה מלבנית כדי ליצור מלבן מסביב לתא ויד חופשית כלי להתוות את התא של עניין ביד.
- כדי ליצור מסכה מלבנית, קו uncomment 167 וקו התגובה 170 (הערה את קו על ידי הנחת "%" בתחילת השורה). ביצוע סעיף 3 לתכנית. לחץ בתמונה וגרור את העכבר כדי להתחיל להגדיר את המסכה מלבנית. לחץ לחיצה כפולה על התיבה כדי לקבל את זה.
- כדי ליצור מסכה המצוירת ביד, קו התגובה 167 וקו uncomment 170 ולבצע סעיף 3. לחץ ולצייר את המסכה הרצויה עם העכבר. לחץ לחיצה כפולה על המסכה לקבל אותו.
- סעיף הפעל 4to לבנות הילברט הפך ערימת תמונת DIC וערימת תמונת DIC המקבילה של השטח של עניין.המסכה שנבנתה בסעיף 3 תחול על הילברט להפוך ערימת דסק"ש וערימת דסק"ש הרגילה כאשר "maskON" מוגדרת 1 בשורה 179. הגדרה "maskON" ל0 יהיה לבנות ערימות תמונה מבלי להחיל את המסכה.
- להפעיל סעיף 5 כדי לייעל את פילוח התמונה של תמונות חתך רוחב XZ של האזור של עניין. איור 500, המיוצר על ידי התכנית, מופיע בו מוצגות שלושה סוגים שונים של ניגוד. ההצלחה של האלגוריתם כדי למצוא את הגבולות של התא היא סומך על שילוב של המסכה המשמשת ואת הערך של "סף" בשורה 229 של התכנית. תתחיל עם ערך של 0.5. התאם את הערך של סף ולהפעיל מחדש את החלק הזה של התכנית עד לגיבוש הנכון מושגת באחד העמודים.
- אם הגיבוש היה הטוב ביותר בטור 1, השתמש בסעיף 6 כדי לקבוע את עוצמת הקול באמצעות פילוח תמונת DIC. אם העמודה 2 נתנה תוצאות אופטימליות, להפעיל סעיף 7 כדי לקבוע נפח תא מדימויי דסק"ש שינו-הילברט. אם עמודת 3 גבדואר התוצאות אופטימליות, סעיף 8 להפעיל כדי לקבוע עוצמת קול באמצעות מסונן פורייה דימויי דסק"ש שינו-הילברט.
- הנפח הנמדד של המדגם, דיווח במיקרומטר מעוקב (FL) מוצג בכותרת של 600 איור, 700, או 800 המיוצרת על ידי את התכנית בהתאם למדידת נפח נבחרה.
6. מדידות מסה
- פתח את תכנית NIQPM MATLAB שכותרתו "JoVE_NIQPM_v1.m".
- לפי סעיף 0 של תכנית NIQPM, לעדכן את המיקום של שלוש ספריות הדרושות כדי להפעיל את התכנית. אלה הם "dependencies_directory", "brightfield_directory," ואת "dic_directory".
- בשלב הבא, להפעיל סעיף 1. חלק זה של קוד יוצר קוביית תמונת שדה בהירה של השדה המלא של כל הסט של תמונות. רק לרוץ סעיף 1 פעם אחת.
- בשלב הבא, להפעיל סעיף 2. תיבת הדו שיח שכותרתו "הגדרת פרמטרי NIQPM" תופיע. ארבעה מספרים נדרשים מהמשתמש: מספר מטוס המוקד שבו התמונה של השדה הבהירמדגם הוא בפוקוס, ברזולוציה לרוחב (מיקרומטר / פיקסל בתמונה), ברזולוציה צירית (זה 0.1 לרכישת תמונה ב0.1 מיקרומטר צעדים צירי), ובאזור של גודל ריבית, פרמטר זה מגדיר את אורכו של צד של תיבה שלאחר מכן תופיע - ערך טיפוסי היא 200. לחץ על אישור.
- תמונה של מטוס מוקד השדה הבהיר שצוין במספר מישור המוקד תופיע עם קופסא כחולה.
- אם התמונה לא בפוקוס, לחיצה כפולה בקופסא הכחולה וסעיף 2 בשידור חוזר, כדי להיות בטוחה כדי להתאים את מספר מטוס המוקד בתיבת הדו שיח.
- אם התמונה היא בפוקוס, גרור את התיבה הכחולה מסביב לתמונה ולשנות את גודלו על ידי בחירת צמתים של התיבה וגרירתם במידת צורך. מקם את התיבה סביב התכונה של עניין, לדוגמא: תא. התיבה לא צריכה להיות מרובעת. לחץ לחיצה כפולה בתוך הקופסה כדי לקבל את זה.
- בשלב הבא, להפעיל סעיף 3 לבניית ערימה של תמונות שדה בהירות קצוץ לאזור בterest.
- להפקת מפת השלב, תמונת DIC פסאודו, והשוואות להדמיה בתחום בהירה ותמונת DIC הנכון, להפעיל את הסעיף 4.
- עם פסאודו דסק"ש ותמונות דסק"ש אמיתיים דומות ככל האפשר את מפת צפיפות מסה, מסה כוללת, והיסטוגרמה של צפיפות התאים ניתן לקבוע על ידי הפעלת סעיף 5 א או 5 ב. סעיף 5 א מבצע את זיהוי דייר אוטומטי של שדה - "הסף" מטב בשורה 300 - ערכים אופייניים נעים בין 0.1-1. שידור חוזר סעיף זה כנדרש כדי למטב את ערכו של סף. סעיף 5 ב מבצעים נחישות המונית, וכו 'לאחר שהמשתמש מתאר את התא של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאורת מדגם נכונה במהלך רכישת תמונה באמצעות פוקוס היא קריטית ליישום המוצלח של NIQPM אלגוריתמי HTDIC nd. באיור 2 אנו מדגימים תאורת NA נמוכה וגבוהה תחת שני דסק"ש ולעומת זאת בשדה בהיר לכדור קלקר ושורת תאי אדנוקרצינומה המעי הגס האנושית SW620. איורים 2 א, 2 ג, ט 2, ו 2k להפגין הדמיה אופטימלית עבור NIQPM. איורים 2F, 2H, 2N, ו2P להפגין הדמיה אופטימלית עבור HTDIC.
איורים 3 ו 4 להדגים את תלות הפרמטר של אלגוריתם NIQPM הדגשת מימושים מוצלחים ולא מוצלחים. באיור 3 אנו לחקור את פרופיל השלב של כדור קלקר 4.8 מיקרומטר קוטר - הפרופיל הצפוי ידוע באופן תיאורטי ובכך ניתן להשוות באופן ישיר לשיקום NIQPM.
דגימות סלולריות, שלב שתכונותיו אינם ידועים מראש, ניתן לשחזר באמצעות NIQPM בשיתוף עם הליך כדי להשוות תמונה "פסאודו דסק"ש" - מחושבת מהשלב המשוחזר - לתמונה DIC בפועל, נקבעה ממדידה אופטית ישירה, של התא. יש NIQPM פרמטר אחד חינם - המטוס בערימת התמונה בהירה שדה שבחישוב הוא מרוכז. מישור מוקד מרכזי זה צריך להיות מותאם עד לפסאודו דסק"ש ותמונות דסק"ש אמיתיים נראים דומים ככל האפשר. דמויות 4E-G להפגין פסאודו מחוץ לפוקוס תמונת DIC, פסאודו אופטימלי תמונת DIC, וcorrespondin תמונה גרם דסק"ש של התא נלקח עם NA הארת 0.9. מעניין לציין, כי מפת השלב הטובה ביותר ותמונת DIC פסאודו מתאים לא בהכרח מתאימות בתמונת שדה בהיר פוקוס, דהינו. איורים 1 א ו-1B.
לבסוף, איור 5 מדגים את השלבים כרוכים באלגוריתם עיבוד התמונה HTDIC. מדימויי דסק"ש באמצעות פוקוס תחת NA = 0.9 תאורה, איורים 5A ו5D, הילברט ההמרה מתבצע preformed כדי להסיר התבליט של תמונות DIC, איורים 5 ב ו 5E. זה מגיע עם כמה טשטוש לאורך הציר האופטי שניתן להסיר מסינון פורייה גבוה לעבור, איורים 5C ו5F. תמונות סופיות אלה מפולחים בקלות כדי לקבוע את האזור בכל מטוס חתך רוחב של הדגימה כדי להסיק את הנפח הסלולרי בסך הכל.
her.within-page = "תמיד"> 
איור 1. NIQPM וHTDIC זרימת עבודה. (1.) דגימות מיקרוסקופיות כגון תאים צריכים להיות מותקנת על שקופיות מיקרוסקופ עם כיסוי זכוכית המודבקת על המדגם באמצעות Fluoromount ג (2). באמצעות פוקוס תמונות שנרכשו תחת שני דסק"ש ולעומת זאת בשדה בהיר עם תקן יוצר "ה-off-המדף" מיקרוסקופ הקלט לאלגוריתמים לעיבוד תמונה. (3). לאחר עיבוד של תמונות בMATLAB כדי לקבוע נפח תא מדסק"ש והפצה המונית סלולרית מדימויי שדה בהירים. (4.) מדדי נקודות קצה כמותי:. מפות חום וגרפים בר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
igure 2 "עבור: תוכן width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
איור 2. דרך פוקוס דסק"ש והדמיה בתחום בהירה של תחומים קלקר ושורות תאי SW620. תנאי ההדמיה אופטימליים עבור NIQPM הם ניגוד שדה בהיר עם 0.1 תאורת NA. לHTDIC דסק"ש, 0.9 תאורת NA היא אופטימלית. (A, B) En הפנים הדמיה בתחום בהיר של 4.8 נושא כדור קלקר בקוטר מיקרומטר ל0.1 NA NA ו0.9 תאורה, בהתאמה. (C, D) דימויי צלב חתך שדה בהיר של 4.8 נושא כדור קלקר בקוטר מיקרומטר ל0.1 NA NA ו0.9 תאורה, בהתאמה. (E, F) דימויי פנים En דסק"ש של 4.8 נושא כדור קלקר בקוטר מיקרומטר ל0.1 NA NA ו0.9 תאורה, בהתאמה. דימויי דסק"ש חתך רוחב של 4.8 תחום של קלקר מיקרומטר קוטר (G, H)ubject ל0.1 NA NA ו0.9 תאורה, בהתאמה. (I, j) En הפנים הדמיה בתחום בהיר של נושא קו תאי סרטן מעי גס SW620 ל0.1 ו0.9 תאורת NA, בהתאמה. (K, L) דימויי צלב חתך שדה בהיר של נושא תא SW620 ל0.1 ו0.9 תאורת NA, בהתאמה. (M, N) דימויי פנים En דסק"ש של נושא התא SW620 ל0.1 NA NA ו0.9 תאורה, בהתאמה. דימויי דסק"ש חתך רוחב של נושא התא SW620 ל0.1 NA ו0.9 תאורת NA (O, P). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. שחזורי שלב אופטימליים והכי מוצלחים:. 4.8 כדור קלקר בקוטר מיקרומטר כל שורה חוקרת את תלות מישור המוקד של en בפני עוצמת שדה בהירה (עמודה ראשונה) ופרופיל השלב המשוחזר כמישור המוקד מתחיל בנקודת האמצע באמצעות הכדור, z = 0 , והמהלכים האחרונים במישור זה 1 מיקרומטר צעדים. השוואה (A, E, I, M) E n מול עוצמת שדה בהירה, (B, F, J, N) שיקום שלב מקביל, (C, G, K, O) של פרופיל השלב המשוחזר לאורך האלכסון של השלב המפה, עיגולים כחולים, פרופיל תיאורטי שלב, באדום, וסובלנות השגיאה של היצרן, קווים שחורים, ו( D, H, L, P) אחוז (%) שגיאה של p המשוחזרhase ביחס לפרופיל השלב התיאורטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. שחזורים אופטימליים והכי מוצלחים שלב:. תא SW620 שתי עמודות להשוות מטוסי תמונת שדה בהיר הכי מוצלח ואופטימליים (A, B) מZ-המחסנית כדי למרכז את חישוב השלב. שחזורי השלב המקביל (C, D) משמשים ליצירת תמונת DIC פסאודו (E, F). אלה בהשוואה לתמונת DIC האמיתית, NA = 0.9 תאורה, ב( G). התמונה פסאודו דסק"ש הטוב ביותר התאמת תמונת DIC קובע את תמונות קלט הנכונות מהשדה הבהיר הר"יערימת ge להשתמש בשחזור שלב. לבסוף, שלב ממופה לצפיפות המסה המוקרנת (H, I). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. שיפור לעומת אופטימלי דסק"ש באמצעות HTDIC: כדורי קלקר ותא SW620. פורייה () דימויי חתך דסק"ש של כדור 4.8 קלקר, (ב) מתאים תמונת HTDIC, (C) מסונן תמונת HTDIC. הממד הצירי של תמונות כדור כבר בקנה מידה כדי להסביר את חוסר התאמת שבירת מדד של הדגימה (1.597) ותקשורת ההרכבה (1.4.) (DF) להפגין את אותם סוגי תמונה לסלולרי SW620, לעומת זאת, עם לא אני שבירהתיקון חוסר התאמת ndex בשל ניגוד המדד החלש של הדגימה. לא thresholding שבוצע על התמונות האלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באופן כללי, NIQPM היא טכניקה עקיפה מוגבל תוקף על נתיב אורכים אופטיים הנעים 0.25-44.7. אימות בוצעה על n = 1.596 תחומים קלקר הנעים בקוטר .11-9.8 מיקרומטר המושעה בFluoromount G (מידע לא מוצגים). תאים בעלי נתיב אורכים אופטיים הנעים בין כמעט 0-7.
כאשר מודד את התפלגות הצפיפות של דגימה אחת עשוי לגלות כי תמונת DIC פסאודו נראית בסדר ואילו את מפת הצפיפות בעל תרומת רקע לא רצויה. זאת בשל רעש בתמונות השדה הבהירים של המדגם המשמש כקלט לאלגוריתם NIQPM. שני שינויים אפשריים לשיטת NIQPM יכולים לשמש כדי לחסל את תרומת רקע לא רצויה: ראשית, ניתן להשתמש בזמני חשיפה ארוכים יותר כדי לשפר את אות לרעש בתמונות השדה הבהירים. זו היא קריטית במיוחד כאשר הדמיה אופטית דקות דגימות. לחלופין, ניתן להפחית את המרווח הצירי של acquisit Z-המחסניתיון .1-.05 מיקרומטר ו2-3 מטוסים ממוצע יחד לפני המזינים אותם לאלגוריתם NIQPM.
קביעת נפח מבוססת HTDIC אומתה בתחומי קלקר הנעים בקוטר 1-20 מיקרומטר וכבר-תוקף צולב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal 35. טכניקת המגזים בהערכת הנפח של אובייקטים מתחת לגבול ההשתברות של המערכת בשל השפעות עקיפה הקשורות לתפקוד נקודת ההתפשטות של אופטיקה.
פתרון בעיות בקביעת נפח HTDIC אולי נדרשת לדגימות קטנות או דקות. המקור העיקרי של שגיאה מגיע מפילוח תמונה באמצעות גילוי הקצה מבוסס סובל מובנה MATLAB משמש כדי לקבוע את הגבולות של התא בתמונות חתך הרוחב. הערך של "סף" שבסעיף 4 של תכנית HTDIC הוא קריטי בהשגת הפילוח הטוב ביותר. תוצאות נוטות להשתנות בצורה לא ליניארית - עם שינויים קטנים בdrasticall "סף"y משנה את השטח המגודר וכתוצאה מגילוי הקצה. התכנית הנוכחית מציגה את המשתמש עם אפשרויות לבצע פילוח תמונה משני Z-מחסנית דסק"ש, Z-מחסנית HTDIC, או Z-מחסנית ה-F-HTDIC.
דסק"ש לבדה הוא לעתים קרובות טוב יותר לדגימות גדולות תוך HTDIC ועבודת ה-F-HTDIC לדגימות קטנות (<5 מיקרומטר קוטר).
מסכה יכולה לשפר את היכולת של השיטה לקטע את התמונה. סעיף 2 מאפשר למשתמש לקבוע מסכה לחול על קוביית התמונה. אנו ממליצים על השימוש במסכה מלבנית שחותכת את (x-המידה) האופקי של הקובייה תוך השמירה (y-המידה) האנכית של הקובייה.
לסיכום, NIQPM וHTDIC הם שיטות הדמיה כמותיים טכנולוגיים נגישות שניתן לבצע במיקרוסקופים אופטיים "ה-off-המדף" סטנדרטיים, בניגוד לרוב השיטות קיימות. מרכז לטכניקות אלה הוא דימויים דרך הפוקוס של המדגם תחת apprתנאי opriate הדמיה: תאורת NA נמוכה עבור NIQPM, ותאורת NA גבוהה עבור HTDIC. השיטות המובאות כאן ניתן להכליל לשימוש במערכות אחרות מאלה הפגינו כאן. הקריטריונים העיקריים הנדרשים להליכים אלה הוא מיקרוסקופ שלמשתמש יש שליטה על Z-התנועה של הבמה ואת היכולת לרכוש תמונות כעמדת המוקד של עדשת המטרה היא מגוונת. השיטות שהוצגו מתאימות לתאי הדמיה קבועים או נעים באיטיות דגימות ביולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים בעבודה שהוצגה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (U54CA143906 לKGP, OJTM וR01HL101972 לOJTM) וקרן מחקר רפואית אורגון פרס חוקר מוקדם קליני (KGP). OJTM הוא חוקר של איגוד לב האמריקאי שהוקם (13EIA12630000). אנו מודים לד"ר אריק אנדרסון של אביר מכון הסרטן להכנת דגימות תאים המשמשות בעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N.
- Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W.
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S,
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A.
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S.
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G.
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
