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Bioengineering

Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

Nous décrivons l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume et la densité sur des échantillons cellulaires grâce à une combinaison de champ lumineux et contraste d'interférence différentiel imagerie. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC) pour déterminer le volume. NIQPM est basé sur un modèle simplifié de propagation de l'onde, appelée l'approximation paraxiale, avec trois hypothèses sous-jacentes: faible ouverture numérique (NA), éclairage faible diffusion, et la faible absorption de la lumière par l'échantillon. Heureusement, les échantillons cellulaires non colorées répondent à ces hypothèses et un éclairage faible NA est facile à réaliser sur des microscopes commerciaux. HTDIC est utilisé pour obtenir des informations volumétrique de par-focus DIC imagerie sous haute illumin NAconditions ation. Illumination NA élevé permet une meilleure découpe de l'éprouvette le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert de traitement sur l'image DIC empile améliore considérablement les algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimen en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles du fond. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique utilisant des microscopes "off-the-shelf". Il existe deux principales limitations de ces méthodes: lente z-stack temps d'acquisition sur les étendues commerciales abroge actuellement l'enquête de phénomènes plus rapidement que 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets de 0,2 à 10 (NIQPM) et 20 (HTDIC) um de diamètre, respectivement. Par conséquent, les spécimens et son temps associé dynamique d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes. Excitant, cellula plus fixespécimens r sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Introduction

L'utilisation de la microscopie optique est désormais omniprésent dans l'enquête des organismes cellulaires. En raison de leur faible absorption et faible diffusion propriétés endogènes sur le spectre optique visible, les cellules n'affectent pas fortement l'amplitude des ondes optiques qui les traversent et donc apparaissent semi quand imagé avec des microscopes de champ lumineux standard. Échantillons cellulaires font, cependant, ralentissent ondes optiques qui transitent par eux d'une manière qui est linéairement liée à la quantité de masse volumique locale dans une région particulière de l'espace à travers lequel la lumière se déplace. L'utilisation de ce laps de temps hétérogènes ou profil "en phase" d'ondes optiques transmis à travers les échantillons microscopiques a été décrite pour la première en 1935 par Frits Zernike 1 et expérimentalement réalisée par Zernikein 1942 2. Zernike a reçu le prix Nobel en 1953 pour cette réalisation. Zeiss commercialisé cette modalité en 1945 3. En 1955, Smith et Nomarski souhaite présenter leurs travaux initiaux sur l'utilisation 4 et 5 théorie de contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, une modalité qui utilise le gradient spatial de phase en tant que mécanisme de contraste. DIC a été commercialisé par Zeiss en 1965in étroite collaboration avec Nomarski 6. En 1981, deux laboratoires ont démontré la première enregistrée cellules vivantes DIC imagerie avec l'incorporation de caméras vidéo dans le train optique du microscope DIC 7, 8. L'ère de l'imagerie des cellules vivantes est né.

Depuis ce temps, l'exécution de deux à contraste de phase et DIC sur microscopes commerciaux a été largement inchangé. Ces méthodes sont principalement utilisées par les biologistes pour produire des images de cellules à des fins qualitatives: la surveillance de la morphologie, le suivi des structures sous-cellulaires, et les enquêtes de la dynamique de la membrane 9. Ces techniques sont d'ordre qualitatif dans leur configuration "off-the-shelf" que la phase et DIC images sont des fonctions arbitraires de l'intensité de la source lumineuse, les paramètres optiques d'éclairage, et le gain de la caméra CCD, gamma, et les paramètres d'exposition.

Une petite légion de physiciens et d'ingénieurs optiques s'est efforcé de modalités d'imagerie quantitative commerciales. Parmi les premiers efforts étaient deux lettres à la nature en 1952 et 1953 où le médecin devenu biophysicien Robert Barer démontré l'utilisation de la microscopie de phase pour déterminer la masse sèche cellulaire des cellules en estimant déphasages par ces types de cellules en utilisant un microscope de phase disponible dans le commerce 10, 11. Le champ a développé une multitude de techniques au cours des années qui ont suivi articulés autour de trois mécanismes de contraste de base sans étiquette: microscopie de phase 10,11, DIC microscopie 12-17, et sur ​​le terrain lumineux 18-22 pour déterminer chemin optique de longueur, la phase, la masse densité, indice de réfraction, et le volume cellulaire.

Au paragraphellèle, une grande collection d'instruments optiques personnalisées ont également été développés depuis les années 1950, et ont consenti des mesures optiques allant des applications à la croissance du parasite 23, à la documentation du cycle cellulaire 24 d'enquêter sur la dynamique des membranes de globules rouges 25. En particulier, les dix dernières années ont vu une multitude de microscopie quantitative sans étiquette sous la forme de microscopie de phase de diffraction 26, la microscopie de phase tomographique 27, la microscopie holographique numérique 28, phase délicate microscopie par cohérence optique 29, spatiale interférence de lumière microscopie 30, Hilbert phase de microscopie 31, et la microscopie de phase quantitative 32. Malgré leurs réussites collectives, ces instruments n'ont pas été diffusés dans le domaine plus large de chercheurs biologiques en raison, principalement, de leur instrumentation complexe et les exigences de calcul.

Ici, nous Describe l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume, la densité et sur des échantillons cellulaires à travers une combinaison de champ lumineux et l'imagerie DIC. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC), pour déterminer le volume. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique. Les conditions de formation d'image nécessaire à la bonne exécution entrent dans le cadre du fonctionnement normal de la plupart des microscopes disponibles dans le commerce. En outre, les algorithmes de post-traitement sont stables, rapide et robuste - ayant été mis en œuvre dans MATLAB en utilisant la transformée algorithmes (FFT) sur la base de Fourier rapide chaque fois que possible.

NIQPM est un procédé pour reconstruire la phase et la densité de la masse axialement intégré de celspécimens lular à partir d'images de champ lumineux. Sommation de cette masse volumique axialement intégrée sur la surface de l'échantillon donne la teneur en masse sèche totale de l'éprouvette. Le protocole de NIQPM repose sur les fondations expérimentales définies par Paganin et Nugent 18, 19 - dans lequel il a été démontré que le profil de phase d'une cellule peut être reconstruit à partir traversant focalisation champ lumineux imagerie de l'échantillon - et le travail théorique de Frank , Altmeyer, et Wernicke 20 - sur la résolution des modèles de vagues parallèles à l'axe d'une manière efficace par FFT. La connexion de la phase de la densité de la masse sèche est basée sur les travaux de Barer 10, 11 et 33 Popescu.

Volumétrique informations peuvent être obtenues à partir des images de mise au point à travers DIC dans des conditions d'illumination NA élevées qui permettent sectionnement optique de l'échantillon le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert traitement sur les piles d'images DIC améliore grandementLes algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimens en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles de l'arrière-plan. Ce travail émane de Arinson et al. 34 bien que nous avons mis en place deux méthodes de filtrage de Fourier pour améliorer le contraste et d'une méthode de détection bord à base de Sobel pour l'analyse automatique volumétrique de l'échantillon. Nous avons également validé HTDIC précédemment sur ​​des sphères de polystyrène d'une taille allant de la limite de diffraction de 20 um de diamètre 36.

Bien que les deux NIQPM HTDIC et sont accessibles sur le plan technologique à cause de leur développement sur les microscopes commerciaux, les procédés sont fondamentalement limitées par la configuration matérielle des microscopes eux-mêmes. Les principales limites de ces techniques sont de deux ordres: lente z-stack temps d'acquisition sur des champs commerciaux, en raison de la traduction de l'étape de la totalité de l'échantillon plutôt que de simplement l'objectif, Limite actuellement l'étude des phénomènes plus rapidement que d'environ 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets d'une taille allant de 0,2 à 10 et 20 m de diamètre, respectivement. Ainsi, l'échantillon et de sa dynamique de temps associées d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes sur les instruments typiques "off-the-shelf". Passionnante, la plupart des spécimens cellulaires fixes sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Un aperçu de la NIQPM et protocoles HTDIC sont donnés dans la figure 1. Dans la figure 2, nous illustrons l'imagerie optimale et sous-optimale par-focus dans des conditions d'éclairage à la fois basse et haute NA pour les deux champs lumineux et imagerie DIC. Figures 3 et 4 montrent le paramètre dépendance de l'algorithme de NIQPM soulignant implémentations réussies ou non.

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Protocol

Une. Microscope Spécifications

Pour faire de l'imagerie dans le bon mode microscope devrait avoir les caractéristiques suivantes:

  1. Posséder à la fois contraste interférentiel différentiel (DIC) et fond clair (BF) contraste.
  2. Avoir un mouvement d'axe z commandé par ordinateur.
  3. Avoir un diaphragme d'ouverture réglable pour faire varier l'ouverture numérique de la lentille de condenseur. Une ouverture avec une règle graduée ou lecture électronique est nécessaire de connaître la valeur de l'ouverture numérique. L'ouverture numérique devrait se situer entre 0,1 pour NIQPM à 0,9 (ou ultérieure) pour HTDIC.
  4. Le microscope doit avoir un filtre étroit de la couleur de la bande pour être utilisé pour l'imagerie par champ lumineux. Ce filtre est nécessaire pour fixer le minimum de réfraction, une facture de longueur d'onde dépendant utilisé pour convertir la phase de la densité de masse pour PNRPI.

2. Contraste interférentiel différentiel (DIC) Acquisition Z-stack

  1. Ouvrez le logiciel SlideBook unee créer une nouvelle diapositive pour la collecte de l'image.
  2. Ensuite, ouvrez la fenêtre de mise au point. Dans la section Filtre de Set, sélectionnez DIC. Dans l'onglet Champ, dans la section condenseur, réglez la barre coulissante ouverture à la position la plus à droite (ouvrir tout le chemin). Ceci permet d'obtenir l'illumination de grande ouverture numérique et améliore sectionnement optique de l'échantillon.
  3. Focus sur l'échantillon en utilisant un objectif DIC. Réglez l'intensité de la lampe halogène jusqu'à l'échantillon est facilement visible. Pour assurer la caméra n'est pas saturé, sélectionnez l'onglet de la caméra dans la fenêtre de mise au point et vérifier que l'histogramme des intensités des pixels est dans la gamme dynamique de la caméra.
  4. Ouvrez la fenêtre de capture d'image. Dans la section Type de capture, cochez la case 3D. Dans la section de capture 3D, sélectionnez la chaîne autour du centre et de retour à l'emplacement actuel
  5. Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d'image, cochez la case DIC et spécifier la durée d'exposition. Dans la section Informations sur l'image, le nom de l'image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l'imagerie.

3. Champ lumineux (BF) Acquisition Z-stack

  1. Une fois que le microscope a terminé la collecte de la DIC Z-pile de l'échantillon, ouvrir la fenêtre Focus et sélectionnez Ouvrir dans la section Filtre de Set. Réglez le curseur d'ouverture à la position la plus à gauche (fermé tout le chemin) pour fournir un éclairage faible NA.
  2. Changer le filtre parcours de lumière microscope au vert. Réglez l'intensité de la lampe halogène jusqu'à l'échantillon est visible. Assurez-vous qu'il n'ya pas de saturation de l'appareil en sélectionnant le
  3. Ouvrez la fenêtre de capture d'image. Les paramètres de capture 3D de l'acquisition de Z-stack DIC seront affichés.
  4. Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d'image, cochez la case OPEN et indiquer la durée d'exposition. Dans la section Informations sur l'image, le nom de l'image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l'acquisition d'images Z-stack.

4. Exportation Z-stack Images

  1. Ouvrez une capture Z-stack. Modifier l'affichage à 100%. Réglez l'histogramme des valeurs de pixels à afficher entre 0 et la valeur maximale en pixels de la caméra (4095 pour 12 caméras de bits, 65535 pour 16 bits.).
  2. Sélectionnez Affichage> Exporter> Série TIFF. Cela exporter le Z-stack comme une série d'images TIFF(Une pour chaque plan de Z). Enregistrer la série TIFF dans un dossier séparé avec un nom qui a un trait de soulignement à la fin (c'est à dire "DIC Pile 1_"). Répétez cette opération avec chaque Z-stack DIC ou BF.

5. Les mesures de volume

  1. Ouvrez le programme HTDIC MATLAB intitulé «JoVE_HTDIC_v1.m".
  2. Conformément à l'article 0 du programme HTDIC, mettre à jour la variable du répertoire des dépendances. Copiez et collez le répertoire contenant le hilbert_transform_dic.m et fichiers sobel_edge_detect.m de l'explorateur (PC) entre les guillemets simples suivant "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 du programme JoVE_HTDIC_v1.m.
  3. Dans la section 1, mettre à jour le "images_directory". Encore une fois, copier et coller le répertoire contenant les images à travers au point sous forme de tif. Entre les guillemets simples. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE.
  4. Alignement et la rotation des images pour Hilbert transforment Run Section 2 du code. Une boîte de dialogue intitulée "Définir HTDIC Paramètres" apparaît. Cinq numbers sont nécessaires à l'utilisateur: le nombre de plan focal où l'image DIC de l'échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l'image), la résolution axiale (c'est 0,1 pour l'acquisition d'images de 0,1 um étapes axiales), l'angle de l'image DIC de rotation nécessaire pour effectuer la transformée de Hilbert, les valeurs typiques sont de 45 et -135. Enfin, saisissez la région de la taille de l'intérêt, ce paramètre définit la longueur d'un côté d'une boîte qui apparaîtra par la suite - valeur typique est de 400. Cliquez sur OK.
  5. Une image du plan focal DIC spécifiée par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue. Placez la boîte sur la fonction d'intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Une fois que la boîte a été placée sur la région désirée, double-cliquez à l'intérieur de la boîte.
  6. Un autre personnage apparaît maintenant: ce chiffre contient une image recadrée et tournée de la région d'intérêt sélectionnée à l'étape précédente. Le contraste de l'image doit être tellecaractéristiques que sombres apparaissent à gauche tandis que des caractéristiques lumineuses apparaissent sur la droite. Faites glisser la boîte bleue sur la région d'intérêt, remodeler si nécessaire.
  7. Section 3 génère un masque pour le cube z-stack. Il existe deux types de masques disponibles: un masque rectangulaire pour créer un rectangle autour de la cellule et un outil à main pour exposer la cellule d'intérêt à la main.
  8. Pour générer un masque rectangulaire, décommentez la ligne 167 et ligne 170 commentaire (commenter une ligne en plaçant un "%" au début de cette ligne). Exécuter la section 3 du programme. Cliquez sur l'image et faites glisser la souris pour commencer à définir le masque rectangulaire. Double-cliquez sur la case pour l'accepter.
  9. Pour générer un masque dessiné à la main, commentaire la ligne 167 et ligne 170 décommentez et exécuter la section 3. Cliquez et dessinez le masque désiré avec la souris. Double-cliquez sur le masque de l'accepter.
  10. Section Exécutez 4to construire Hilbert transformé l'image DIC pile et l'image DIC pile correspondante de la zone d'intérêt.Le masque construit dans la section 3 sera appliquée à la transformée de Hilbert DIC pile et la pile DIC régulière quand "maskON" est mis à 1 à la ligne 179. Réglage "maskON" à 0 va construire des piles d'images sans appliquer le masque.
  11. Exécuter la section 5 d'optimiser la segmentation d'image des images en coupe transversale de xz de la région d'intérêt. Figure 500, produite par le programme, l'affichage apparaît trois types de contraste différents. Le succès de l'algorithme pour trouver les bordures de la cellule est tributaire de la combinaison du masque utilisé et la valeur de «seuil» à la ligne 229 du programme. Commencez avec une valeur de 0,5. Réglez la valeur de seuil et relancer cette section du programme jusqu'à ce que le mode Plan adéquate est obtenue dans l'une des colonnes.
  12. Si le mode Plan était le meilleur dans la colonne 1, utilisez la section 6 pour déterminer le volume à l'aide DIC segmentation d'image. Si la colonne 2 a donné des résultats optimaux, exécutez la section 7 pour déterminer le volume de la cellule de l'imagerie DIC Hilbert transformée. Si la colonne 3 gave les résultats optimaux, Section 8 de fonctionner afin de déterminer le volume moyen de l'imagerie DIC Hilbert transformée de Fourier filtré.
  13. Le volume mesuré de l'échantillon, rapportée dans um cube (fl) est présenté dans le document de la figure 600, 700, 800 ou produite par le programme en fonction de la mesure du volume est choisi.

6. Mesures de masse

  1. Ouvrez le programme NIQPM MATLAB intitulé «JoVE_NIQPM_v1.m".
  2. Conformément à l'article 0 du programme NIQPM, mettre à jour l'emplacement de trois répertoires nécessaires pour exécuter le programme. Ce sont les "dependencies_directory," le "brightfield_directory," et le "dic_directory."
  3. Ensuite, exécutez la section 1. Cette section de code génère un champ lumineux cube image de la totalité du champ de l'ensemble des images. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE.
  4. Ensuite, exécutez la section 2. Une boîte de dialogue intitulée "Définir NIQPM Paramètres" apparaît. Quatre numéros sont nécessaires à l'utilisateur: le nombre de plan focal où l'image de champ lumineux de lal'échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l'image), la résolution axiale (c'est 0,1 pour l'acquisition d'images à 0,1 um étapes axiales), et la région de la taille d'intérêt, ce paramètre définit la longueur d'un côté d'un boîte qui apparaîtra par la suite - une valeur typique est de 200. Cliquez sur OK.
  5. Une image du plan focal de champ lumineux spécifié par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue.
    1. Si l'image n'est pas au point, double-cliquez dans la boîte bleue et la section reprise 2, assurez-vous de régler le nombre de plan focal dans la boîte de dialogue.
    2. Si l'image est mise au point, faites glisser la boîte bleue autour de l'image et la redimensionner en sélectionnant les nœuds de la boîte et en les déplaçant au besoin. Placez la boîte autour de la caractéristique d'intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Double-cliquez à l'intérieur de la boîte à l'accepter.
  6. Ensuite, exécutez la section 3 pour construire une pile d'images de fond clair cultivé dans la région de dansintérêt.
  7. Pour générer la carte de phase, l'image pseudo DIC, et des comparaisons avec des images lumineuses sur le terrain et la véritable image DIC, exécutez la section 4.
  8. Avec le pseudo DIC et de vraies images DIC aussi proches que possible de la carte de la densité de la masse, la masse totale, et l'histogramme de la densité de cellules peuvent être déterminées en exécutant l'article 5a ou 5b. Section 5a effectue la détection de frontière automatisé du domaine - optimiser «seuil» à la ligne 300 - valeurs typiques varient entre 0,1-1. Relancez cette section que nécessaire pour optimiser la valeur de seuil. Section 5b effectue détermination de la masse, etc après que l'utilisateur définit la cellule d'intérêt.

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Representative Results

Corriger éclairage de l'échantillon lors de l'acquisition de l'image par-focus est essentielle à la mise en œuvre réussie de la NIQPM un Algorithmes HTDIC nd. Dans la figure 2, nous illustrons éclairage basse et haute NA sous deux DIC et lumineux contraste de champ pour une sphère de polystyrène et le colorectal ligne de cellules d'adénocarcinome humain SW620. Figures 2A, 2C, 2I, et 2K démontrent imagerie optimale pour NIQPM. Figures 2F, 2H, 2N, 2P et démontrent imagerie optimale pour HTDIC.

Les figures 3 et 4 montrent le paramètre dépendance de l'algorithme de NIQPM soulignant implémentations réussies ou non. Dans la figure 3, nous explorons le profil de phase d'un 4,8 um de diamètre polystyrène sphère - le profil attendu est connu théoriquement et peut donc être comparé directement à la reconstruction de NIQPM. la figure 2L.

Échantillons cellulaires, dont les propriétés de phase ne sont pas connus a priori, peuvent être reconstruites en utilisant NIQPM en liaison avec une procédure de comparer une image «pseudo DIC" - calculé à partir de la phase reconstruite - à une image DIC réelle, déterminée à partir d'une mesure optique directe, de la cellule. NIQPM a un paramètre libre - plan dans le domaine de l'image lumineuse pile à laquelle le calcul est centré. Ce plan focal central doit être ajustée jusqu'à ce que le pseudo DIC et de vraies images DIC regardent aussi semblables que possible. Figures 4E-G démontrer une pseudo out-of-focus l'image DIC, une image DIC pseudo optimale, et la correspondinl'image g DIC de la cellule prise avec un éclairage NA de 0,9. Fait intéressant, la meilleure carte de phase et correspondant image pseudo DIC ne correspondent pas nécessairement à une image de mise au point de champ clair, à savoir. Figures 1A et 1B.

Enfin, la figure 5 illustre les étapes de l'algorithme de traitement d'image HTDIC. De la DIC par-focus imagerie sous NA = 0,9 éclairage, les figures 5A et 5D, la transformée de Hilbert est préformée pour enlever le bas-relief des images DIC, les figures 5B et 5E. Cela vient avec un peu de flou le long de l'axe optique qui peut être retiré de filtrage de Fourier passe-haut, les figures 5C et 5F. Ces images finales sont facilement segmentés pour déterminer la zone dans chaque plan en coupe transversale de l'échantillon pour en déduire le volume cellulaire total.

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Figure 1. NIQPM et HTDIC Workflow. (1.) Échantillons microscopiques tels que les cellules doivent être montés sur des lames de microscope avec couvercle en verre fixé sur l'échantillon en utilisant Fluoromount G. (2). Grâce au point des images acquises sous deux DIC et lumineux contraste de champ avec une norme "off-the-shelf" microscope former l'entrée aux algorithmes de traitement d'image. (3.) Post-traitement des images dans MATLAB pour déterminer le volume de la cellule de DIC et de la distribution de masse cellulaire à partir d'images de champ lumineux. (4.) Quantitatives indicateurs finaux:. Plans de chaleur et de graphiques à barres S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Grâce au point DIC et champ lumineux des images de sphères de polystyrène et des lignées cellulaires SW620. Les conditions d'imagerie optimales pour NIQPM sont lumineux contraste de champ avec 0,1 NA éclairage. Pour HTDIC DIC, 0,9 NA éclairage est optimal. (A, B) en Face champ lumineux des images de 4,8 um de diamètre sphère de polystyrène sous réserve de 0,1 NA NA éclairage et 0,9, respectivement. (C, D) de la Croix-coupe imagerie de champ lumineux de 4,8 um de diamètre sphère de polystyrène sous réserve de 0,1 NA NA éclairage et 0,9, respectivement. (E, F) En face DIC imagerie de 4,8 um de diamètre sphère de polystyrène sous réserve de 0,1 NA NA éclairage et 0,9, respectivement. (G, H) en coupe transversale de l'imagerie DIC de 4,8 um de diamètre polystyrène sphère sous réserve 0,1 NA NA 0,9 et éclairage, respectivement. (I, J) En face champ lumineux des images de SW620 colorectal objet de la lignée cellulaire de cancer de 0,1 et 0,9 NA éclairage, respectivement. (K, L) de section transversale des images de champ lumineux de l'objet cellulaire SW620 à 0,1 et 0,9 NA illumination, respectivement. (M, N) En face de l'imagerie DIC SW620 cellule sous réserve de 0,1 NA NA éclairage et 0,9, respectivement. (O, P) de section transversale de l'imagerie DIC de SW620 cellule sous réserve de 0,1 NA NA 0,9 et éclairage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Optimales et sous-optimales reconstructions de phase:. 4,8 um de diamètre polystyrène sphère Chaque ligne étudie la dépendance de plan focal de la salle en face lumineuse intensité du champ (première colonne) et le profil de phase reconstruit comme le plan focal commence au milieu par la sphère, z = 0 , et passe devant ce plan dans une um étapes. (A, E, I, M) E n face à l'intensité du champ lumineux, (B, F, J, N) de reconstruction de phase correspondant, (C, G, K, O) comparaison du profil de phase reconstruit le long de la diagonale de la phase carte, cercles bleus, profil théorique de phase, en rouge, et la tolérance d'erreur du fabricant, des lignes noires, et (D, H, L, P) pour cent (%) erreur de la p reconstruithase par rapport au profil de phase théorique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Optimales et sous-optimales reconstructions de phase:. Cellule SW620 Les deux colonnes comparent champ lumineux plans d'image sous-optimales et optimales (A, B) de la z-pile au centre de calcul de phase. Les reconstructions de phase correspondantes (C, D) sont utilisés pour générer une image de pseudo DIC (E, F). Ces résultats sont comparés à la véritable image DIC, NA = 0,9 éclairage, en (G). L'image de pseudo DIC correspondant mieux à l'image DIC détermine les images d'entrée corrects sur le terrain lumineux image pile à utiliser dans la reconstruction de phase. Enfin, la phase est associé à la densité de la masse projetée (H, I). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Optimal amélioration du contraste DIC utilisant HTDIC: sphères de polystyrène et les cellules SW620. L'image HTDIC (A) transversale imagerie DIC d'une sphère de 4,8 polystyrène, (B) correspondant, (C) de Fourier filtré l'image HTDIC. La dimension axiale de la sphère des images ont été mis à l'échelle pour tenir compte de l'indice de réfraction non-concordance de l'échantillon (1,597) et le support de montage (1.4). (DF) montrent le même type d'image pour une cellule SW620, cependant, sans réfraction index correction de décalage en raison de l'indice faible contraste de l'éprouvette. Aucun seuil n'a été effectué sur ces images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

En général, NIQPM est une technique de diffraction limitée validée sur le chemin optique des longueurs allant de 0,25 à 44,7. La validation a été effectuée sur n = 1,596 sphères de polystyrène de diamètre allant de 0,11 à 9,8 um en suspension dans Fluoromount G (données non présentées). Les cellules possèdent chemin longueurs optiques qui vont de près de 0-7.

Lorsque la mesure de la distribution de la densité d'un échantillon, on peut constater que l'image de pseudo DIC semble bien alors que la carte de densité possède des contributions de fond indésirables. Ceci est dû au bruit dans le domaine de l'imagerie lumineuse de l'échantillon utilisé comme entrée de l'algorithme de NIQPM. Deux modifications possibles à la méthode de NIQPM peuvent être utilisés pour éliminer les indésirables contributions de fond: d'une part, on peut utiliser de plus longs temps d'exposition pour améliorer le signal-sur-bruit dans les images en champ clair. Cela est particulièrement important lors de l'imagerie des échantillons optiquement minces. Alternativement, on peut réduire la distance axiale de la acquisit z-stackion de 0,1 à 0,05 um et 2-3 avions moyens ensemble avant de les entrer dans l'algorithme de NIQPM.

Détermination de volume à base HTDIC a été validé sur des sphères de polystyrène de diamètre allant de 1 à 20 pm et a été validé avec des contre-microscopie à fluorescence confocal 35. La technique surestime le volume des objets en dessous de la limite de diffraction du système due à des effets de diffraction associés à la fonction d'étalement de point de l'optique.

Dépannage de la détermination du volume HTDIC peut-être nécessaire pour les petites ou minces spécimens. La principale source d'erreur provient de la segmentation d'image en utilisant la détection de pointe fondée sur Sobel intégré dans MATLAB utilisée pour déterminer les frontières de la cellule dans les images en coupe transversale. La valeur de «seuil» à l'article 4 du programme HTDIC est essentiel pour obtenir le meilleur segmentation. Les résultats tendent à varier d'une manière non linéaire - avec de petits changements dans le "seuil" drastically changeant la zone fermée résultant de la détection des bords. Le programme courant présente à l'utilisateur des options pour effectuer la segmentation d'image à partir de l'une ou l'autre pile DIC-z, z-pile HTDIC, ou la pile z-F-HTDIC.

DIC seul est souvent préférable pour les grands spécimens tout HTDIC et travail F-HTDIC pour les spécimens plus petits (<5 um de diamètre).

Un masque peut améliorer l'aptitude de la méthode à segmenter l'image. Section 2 permet à l'utilisateur de déterminer un masque à appliquer à l'image cube. Nous recommandons l'utilisation d'un masque rectangulaire qui tronque l'horizontale (x-mesure) du cube tout en préservant la verticale (y-mesure) du cube.

En résumé, NIQPM et HTDIC sont les modalités d'imagerie quantitatives technologiquement accessibles qui peuvent être effectuées sur des microscopes optiques "off-the-shelf" standard, contrairement à la plupart des méthodes existantes. Au centre de ces techniques est l'imagerie par le biais de mise au point de l'échantillon sous l'apprconditions opriate d'imagerie: un éclairage faible NA pour NIQPM, et l'illumination élevée NA pour HTDIC. Les méthodes présentées ici peuvent être généralisés pour une utilisation sur des systèmes autres que celles mises en évidence ici. Les principaux critères requis pour ces procédures est un microscope pour lesquels l'utilisateur a le contrôle sur le mouvement en z de la scène et de la capacité d'acquérir des images en tant que la position focale de la lentille d'objectif est variée. Les méthodes présentées sont appropriés pour l'imagerie des cellules fixes ou se déplaçant lentement spécimens biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun intérêt financier dans le travail présenté.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de sanitaires (U54CA143906 à KGP, OJTM et R01HL101972 à OJTM) et une Fondation Oregon Medical Research Investigator Award clinique précoce (KGP). OJTM est un chercheur Créé American Heart Association (13EIA12630000). Nous remercions le Dr Eric Anderson de l'Institut du cancer de chevalier de la préparation des échantillons de cellules utilisées dans ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

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Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

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