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Bioengineering

मात्रात्मक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी: सेलुलर की biophysical के मापन के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ सुविधाएँ

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

हम उज्ज्वल क्षेत्र और अंतर हस्तक्षेप विपरीत कल्पना का एक संयोजन के माध्यम से बड़े पैमाने पर, मात्रा, और सेलुलर नमूनों पर घनत्व के मात्रात्मक माप प्रदर्शन करने के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के उपयोग का वर्णन. दो प्राथमिक दृष्टिकोण प्रस्तुत कर रहे हैं: noninterferometric मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (NIQPM), कुल सेल द्रव्यमान और subcellular घनत्व वितरण के माप प्रदर्शन करने के लिए, और हिल्बर्ट मात्रा निर्धारित करने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (HTDIC) बदलना. कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) रोशनी, कमजोर बिखरने, और नमूना द्वारा प्रकाश की कमजोर अवशोषण: NIQPM लहर प्रसार का एक सरल मॉडल पर आधारित है, तीन अंतर्निहित मान्यताओं के साथ, paraxial सन्निकटन करार दिया. सौभाग्य से, बेदाग सेलुलर नमूनों इन मान्यताओं को संतुष्ट और कम NA रोशनी आसानी से वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर हासिल की है. HTDIC उच्च एनए illumin तहत के माध्यम से फोकस डीआईसी कल्पना से बड़ा जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता हैव्यावहारिक स्थितियों. उच्च एनए रोशनी ऑप्टिकल अक्ष के साथ नमूना की बढ़ी सेक्शनिंग सक्षम बनाता है. हिल्बर्ट डीआईसी छवि पर प्रोसेसिंग बदलना बहुत ढेर पृष्ठभूमि के उन लोगों से नमूना तीव्रता के ग्रे मूल्यों को अलग करके तीन आयामों में नमूना सीमाओं का स्थानीयकरण के लिए बढ़त का पता लगाने एल्गोरिदम को बढ़ाता है. NIQPM और HTDIC का प्राथमिक लाभ "बंद-the-शेल्फ" माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अपने तकनीकी पहुँच में निहित है. वाणिज्यिक scopes पर धीमी z ढेर अधिग्रहण के समय वर्तमान में तेजी से 1 फ्रेम / मिनट से भी घटना की जांच abrogates, और दूसरी बात, विवर्तन प्रभाव 10 से ऊपर 0.2 से वस्तुओं को NIQPM और HTDIC की उपयोगिता को प्रतिबंधित: इन तरीकों में से दो बुनियादी सीमाएं हैं क्रमशः (NIQPM) और व्यास में 20 (HTDIC) माइक्रोन,. इसलिए, ब्याज का नमूना और उसके संबंधित समय गतिशीलता इन तरीकों के उपयोग को सक्षम करने के लिए निश्चित आकार और अस्थायी कमी को पूरा करना होगा. Excitingly, सबसे तय सूक्ष्मकोशिकाआर नमूनों आसानी से इन तरीकों के साथ जांच कर रहे हैं.

Introduction

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग अब सेलुलर जीव की जांच में सर्वव्यापी है. कारण दिखाई ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम पर उनके कम अंतर्जात absorbance और कमजोर बिखरने गुण के लिए, कोशिकाओं दृढ़ता से उन्हें गुजर ऑप्टिकल तरंगों के आयाम को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ imaged जब अर्द्धपारदर्शी नहीं दिखाई देते. सेलुलर नमूनों, तथापि, रैखिक प्रकाश, जिसमें यात्रा के माध्यम से अंतरिक्ष की एक विशेष क्षेत्र में स्थानीय जन घनत्व की राशि से संबंधित है जो उन्हें एक तरह के माध्यम से यात्रा ऑप्टिकल तरंगों को धीमा है. इस विषम समय अंतराल या सूक्ष्म नमूनों के माध्यम से प्रेषित ऑप्टिकल लहरों की "चरण" प्रोफाइल की उपयोगिता पहले Frits Zernike 1 द्वारा 1935 में वर्णित है और प्रयोगात्मक Zernikein 1942 2 द्वारा महसूस किया गया. Zernike इस उपलब्धि के लिए 1953 में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया. जीस 1945 3 में इस साधन का वाणिज्यीकरण किया. 1955 में, स्मिथ और Nomarskमैं अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एक विपरीत तंत्र के रूप में चरण के स्थानिक ढाल का उपयोग करता है कि एक साधन के उपयोग के 4 और सिद्धांत 5 पर उनकी प्रारंभिक काम प्रस्तुत करेंगे. डीआईसी Nomarski 6 साथ 1965in निकट सहयोग में Zeiss द्वारा commercialized था. 1981 में, दो प्रयोगशालाओं डीआईसी खुर्दबीन 7, 8 के प्रकाशिकी ट्रेन में वीडियो कैमरों के समावेश के साथ पहले रिकॉर्ड किया गया लाइव सेल डीआईसी कल्पना का प्रदर्शन किया. लाइव सेल इमेजिंग के युग का जन्म हुआ.

इस समय के बाद, वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर चरण विपरीत और डीआईसी दोनों का निष्पादन बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित रही है. आकृति विज्ञान, subcellular संरचनाओं की ट्रैकिंग, और झिल्ली गतिशीलता 9 की जांच की निगरानी: इन विधियों मुख्य गुणात्मक प्रयोजनों के लिए कोशिकाओं की छवियों का उत्पादन करने के लिए जीव के द्वारा उपयोग किया जाता है. इन तकनीकों में चरण और डि दोनों के रूप में उनकी "बंद-the-शेल्फ" विन्यास में गुणात्मक हैंसी छवियों मनमाना प्रकाश स्रोत तीव्रता का काम करता है, रोशनी प्रकाशिकी सेटिंग्स, और सीसीडी कैमरा लाभ, गामा, और प्रदर्शन सेटिंग्स हैं.

भौतिकविदों और ऑप्टिकल इंजीनियरों की एक छोटी सेना वाणिज्यिक इमेजिंग रूपात्मकता मात्रात्मक बनाने का प्रयास किया है. पहला प्रयासों के अलावा चिकित्सक बने जीवभौतिकीवेत्ता रॉबर्ट बार्स एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चरण माइक्रोस्कोप का उपयोग इन प्रकार की कोशिकाओं के माध्यम से चरण बदलाव का आकलन करके कोशिकाओं के सेलुलर शुष्क जन निर्धारित करने के लिए चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रदर्शन किया जिसमें 1952 और 1953 में प्रकृति को दो पत्र थे 10, 11. चरण माइक्रोस्कोपी 10,11, डीआईसी माइक्रोस्कोपी 12-17, और ऑप्टिकल पथ लंबाई, चरण, जन निर्धारित करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र 18-22: क्षेत्र के तीन बुनियादी लेबल से मुक्त विपरीत तंत्र के आसपास आधारित आगामी वर्षों में तकनीक की एक भीड़ विकसित की है घनत्व, अपवर्तनांक, और सेलुलर मात्रा.

पैरा मेंllel, कस्टम ऑप्टिकल उपकरणों का एक बड़ा संग्रह भी 1950 के दशक के बाद से विकसित किया गया है, और परजीवी वृद्धि 23 आवेदन पत्र में से, लाल रक्त कोशिकाओं को 25 साल की झिल्ली गतिशीलता की जांच करने के लिए सेल चक्र 24 दस्तावेजीकरण को लेकर ऑप्टिकल माप दूरगामी बना दिया है. विशेष रूप से, पिछले दस वर्षों विवर्तन चरण माइक्रोस्कोपी 26 के फार्म, tomographic चरण माइक्रोस्कोपी 27, डिजिटल holographic माइक्रोस्कोपी 28, चरण संवेदनशील ऑप्टिकल जुटना माइक्रोस्कोपी 29, स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी 30, हिल्बर्ट में लेबल से मुक्त मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी का खजाना देखा गया है चरण माइक्रोस्कोपी 31, और मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी 32. उनके सामूहिक सफलताओं के बावजूद, इन उपकरणों को अपने जटिल इंस्ट्रूमेंटेशन और कम्प्यूटेशनल जरूरतों के लिए, ज्यादातर के कारण जैविक शोधकर्ताओं के बड़े क्षेत्र को प्रचारित नहीं किया गया है.

इस के साथ साथ हम घउज्ज्वल क्षेत्र और डीआईसी कल्पना का एक संयोजन के माध्यम से बड़े पैमाने पर, मात्रा, और सेलुलर नमूनों पर घनत्व के मात्रात्मक माप प्रदर्शन करने के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग खींचाना. दो प्राथमिक दृष्टिकोण प्रस्तुत कर रहे हैं: noninterferometric मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (NIQPM), कुल सेल द्रव्यमान और subcellular घनत्व वितरण के माप प्रदर्शन करने के लिए, और हिल्बर्ट मात्रा निर्धारित करने के लिए, अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (HTDIC) बदलना. NIQPM और HTDIC का प्राथमिक लाभ उनके तकनीकी पहुँच में निहित है. उनके सफल क्रियान्वयन के लिए आवश्यक इमेजिंग की स्थिति सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी की सामान्य ऑपरेशन के दायरे के भीतर हैं. साथ ही, बाद के प्रसंस्करण एल्गोरिदम, स्थिर, जल्दी, और मजबूत कर रहे हैं - जब भी संभव तेजी से फूरियर (FFT) आधारित एल्गोरिदम को बदलने का उपयोग कर MATLAB में लागू किया गया है.

NIQPM चरण और सीईएल के अक्षीय रूप से एकीकृत जन घनत्व के पुनर्निर्माण के लिए एक विधि हैउज्ज्वल क्षेत्र कल्पना से lular नमूनों. नमूना के क्षेत्र पर इस अक्षीय रूप से एकीकृत जन घनत्व के संकलन नमूना की कुल शुष्क जन सामग्री देता है. यह एक सेल के चरण प्रोफाइल नमूना के माध्यम से फोकस उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना से खंगाला जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया, जिसमें - - NIQPM प्रोटोकॉल Paganin और Nugent 18, 19 से रखी प्रयोगात्मक नींव पर आधारित है और फ्रैंक की सैद्धांतिक काम , Altmeyer, और वेर्निक 20 - एक कुशल FFT आधारित ढंग से paraxial लहर मॉडल को सुलझाने पर. शुष्क जन घनत्व चरण के कनेक्शन बार्स 10, 11 और पॉपेस्कु 33 से काम पर आधारित है.

बड़ा जानकारी ऑप्टिकल अक्ष के साथ नमूना के ऑप्टिकल सेक्शनिंग कि सक्षम उच्च एनए रोशनी परिस्थितियों में के माध्यम से फोकस डीआईसी कल्पना से प्राप्त किया जा सकता है. हिल्बर्ट डीआईसी छवि के ढेर पर प्रोसेसिंग बदलना बहुत बढ़ाता हैपृष्ठभूमि के उन लोगों से नमूना तीव्रता के ग्रे मूल्यों को अलग करके तीन आयामों में नमूना सीमाओं का स्थानीयकरण के लिए बढ़त का पता लगाने एल्गोरिदम. हम इसके विपरीत है और नमूना की स्वचालित बड़ा विश्लेषण के लिए एक सोबेल आधारित बढ़त का पता लगाने पद्धति को बढ़ाने के लिए दोनों फूरियर छानने के तरीकों को पेश किया है, हालांकि यह काम Arinson एट अल. 34 से निकलती है. हम भी विवर्तन सीमा से ऊपर व्यास 36 में 20 माइक्रोन के आकार में लेकर polystyrene क्षेत्रों पर पहले से HTDIC पुष्टि की है.

NIQPM और HTDIC दोनों वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर उनके विकास के कारण तकनीकी रूप से सुलभ हैं, वहीं तरीकों मौलिक सूक्ष्मदर्शी स्वयं की हार्डवेयर विन्यास द्वारा सीमित हैं. इन तकनीकों के प्राथमिक सीमाओं दो गुना कर रहे हैं: के रूप में विरोध के कारण पूरे नमूना मंच का अनुवाद करने के लिए, वाणिज्यिक scopes पर धीमी z ढेर अधिग्रहण के समय बस उद्देश्य लेंस के लिएवर्तमान में तेजी से लगभग 1 फ्रेम / मिनट से भी घटना की जांच की सीमा, और दूसरी बात, विवर्तन प्रभाव क्रमशः, व्यास में 10 और 20 माइक्रोन अप करने के लिए 0.2 से आकार में लेकर वस्तुओं को NIQPM और HTDIC की उपयोगिता सीमित. इसलिए, ब्याज का नमूना और उसके संबंधित समय गतिशीलता ठेठ "बंद-the-शेल्फ" उपकरणों पर इन तरीकों के उपयोग को सक्षम करने के लिए निश्चित आकार और अस्थायी कमी को पूरा करना होगा. Excitingly, सबसे निश्चित सेलुलर नमूनों आसानी से इन तरीकों के साथ जांच कर रहे हैं.

NIQPM और HTDIC प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1 में दिया जाता है. चित्रा 2 में हम उज्ज्वल क्षेत्र और डीआईसी कल्पना दोनों के लिए कम और उच्च दोनों NA रोशनी परिस्थितियों में इष्टतम और suboptimal के माध्यम से फोकस इमेजिंग वर्णन. 3 और 4 सफल और असफल implementations पर प्रकाश डाला NIQPM एल्गोरिथ्म के पैरामीटर निर्भरता का प्रदर्शन आंकड़े.

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Protocol

1. माइक्रोस्कोप निर्दिष्टीकरण

सही फैशन में इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए माइक्रोस्कोप निम्नलिखित विनिर्देशों होना चाहिए:

  1. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और brightfield (बीएफ) के विपरीत दोनों के पास है.
  2. कंप्यूटर नियंत्रित Z-अक्ष आंदोलन है.
  3. कंडेनसर लेंस संख्यात्मक एपर्चर भिन्न करने के लिए एक समायोज्य एपर्चर बंद है. एक वर्गीकृत नियम या इलेक्ट्रॉनिक readout के साथ एक छेद संख्यात्मक एपर्चर की कीमत पता करने के लिए आवश्यक है. संख्यात्मक एपर्चर NIQPM के लिए 0.1 से HTDIC के लिए 0.9 (या अधिक) तक सीमा चाहिए.
  4. खुर्दबीन उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा करने के लिए एक संकीर्ण बैंड रंग फिल्टर करना चाहिए था. इस फिल्टर अपवर्तक वेतन वृद्धि, NIQP के लिए जन घनत्व के चरण में परिवर्तित किया जाता है एक तरंग दैर्ध्य पर निर्भर facture तय करने के लिए आवश्यक है.

2. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) Z-ढेर अधिग्रहण

  1. Slidebook सॉफ्टवेयर एक खोलेंएन डी छवि संग्रह के लिए एक नई स्लाइड बनाने.
  2. अगला, फोकस विंडो खोलें. फ़िल्टर सेट अनुभाग के तहत, जिला उद्योग केंद्र का चयन करें. स्कोप टैब पर, कंडेनसर खंड के अंतर्गत, दूर सही स्थिति (सभी रास्ते खोलने के लिए) के लिए एपर्चर स्लाइड पट्टी को समायोजित. इस उच्च संख्यात्मक एपर्चर रोशनी प्रदान करता है और नमूना के ऑप्टिकल सेक्शनिंग को बढ़ाता है.
  3. एक डीआईसी उद्देश्य का उपयोग नमूना पर ध्यान दें. नमूना आसानी से दिखाई देता है जब तक हलोजन दीपक तीव्रता को समायोजित. कैमरा संतृप्त नहीं किया जा रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए, फोकस विंडो में कैमरा टैब का चयन करें और पिक्सेल तीव्रता के हिस्टोग्राम कैमरे के गतिशील सीमा के भीतर है कि जांच ले.
  4. छवि कैद विंडो खोलें. कैप्चर प्रकार अनुभाग में, 3 डी बॉक्स की जाँच करें. 3 डी कैद अनुभाग में, केंद्र के आसपास रेंज चयन और मौजूदा स्थान पर लौटें
  5. छवि कैद खिड़की के फिल्टर सेट अनुभाग में, डीआईसी चेक बॉक्स और जोखिम समय निर्दिष्ट करें. छवि जानकारी अनुभाग में, (वैकल्पिक) छवि के नाम, और इमेजिंग आरंभ करने के लिए प्रारंभ का चयन करें.

3. उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) Z-ढेर अधिग्रहण

  1. माइक्रोस्कोप नमूना की डीआईसी Z-ढेर एकत्रित पूरा होने के बाद, फोकस विंडो खोलें और फिल्टर सेट खंड के तहत ओपन का चयन करें. कम NA रोशनी प्रदान करने के लिए (सभी रास्ते बंद) दूर बाईं स्थिति को एपर्चर स्लाइड पट्टी को समायोजित करें.
  2. हरे रंग के लिए माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ फिल्टर बदलें. नमूना दिख रहा है जब तक हलोजन दीपक तीव्रता को समायोजित. चयन करके कैमरे का कोई संतृप्ति है सुनिश्चित करें
  3. छवि कैद विंडो खोलें. डीआईसी Z-ढेर अधिग्रहण से 3 डी कब्जा सेटिंग्स प्रदर्शित किया जाएगा.
  4. छवि कैद खिड़की के फिल्टर सेट अनुभाग में, खोलें चेक बॉक्स और जोखिम समय निर्दिष्ट करें. छवि जानकारी अनुभाग में, (वैकल्पिक) छवि के नाम, और Z-ढेर छवि अधिग्रहण आरंभ करने के लिए प्रारंभ का चयन करें.

4. जेड ढेर छवियों निर्यात

  1. एक Z-ढेर कब्जा खोलें. 100% करने के लिए दृश्य बदलें. 0 के बीच प्रदर्शित करने के लिए पिक्सेल मूल्यों की हिस्टोग्राम और कैमरे की अधिकतम पिक्सेल मूल्य (4,095 12 के लिए बिट कैमरा, 16 बिट के लिए 65,535.) को समायोजित करें.
  2. देखें> निर्यात> झगड़ा श्रृंखला का चयन. यह झगड़ा छवियों की एक श्रृंखला के रूप में जेड ढेर निर्यात करेगा(प्रत्येक जेड विमान के लिए एक). अंत (यानी "डीआईसी ढेर 1_") पर एक जांच है कि एक नाम के साथ एक अलग फ़ोल्डर में झगड़ा श्रृंखला बचाओ. प्रत्येक जिला उद्योग केंद्र या बीएफ Z-ढेर के साथ इस दोहराएँ.

5. मात्रा माप

  1. "JoVE_HTDIC_v1.m" हकदार HTDIC MATLAB प्रोग्राम खोलें.
  2. HTDIC कार्यक्रम की धारा 0 के तहत, निर्भरता निर्देशिका चर का अद्यतन करें. कॉपी और "dependencies_directory =" निम्नलिखित एक उद्धरण के बीच में एक्सप्लोरर से hilbert_transform_dic.m और sobel_edge_detect.m फ़ाइलें (पीसी) युक्त निर्देशिका पेस्ट करें. JoVE_HTDIC_v1.m कार्यक्रम के ExecuteSection 0.
  3. धारा 1 में, "images_directory" अद्यतन करें. फिर, कॉपी और एक उद्धरण के बीच में. TIF रूप में के माध्यम से ध्यान केंद्रित छवियों से युक्त निर्देशिका पेस्ट करें. केवल एक बार धारा 1 रन.
  4. संरेखण और हिल्बर्ट के लिए छवियों के रोटेशन भागो संहिता की धारा 2 बदलना. "HTDIC मानकों को परिभाषित" शीर्षक से एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा. पांच कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ारुपए उपयोगकर्ता से आवश्यक हैं: नमूना की डीआईसी छवि को ध्यान में है जहां फोकल हवाई जहाज़ संख्या, पार्श्व संकल्प (छवि में माइक्रोन / पिक्सेल), अक्षीय संकल्प (इस 0.1 माइक्रोन अक्षीय चरणों में छवि अधिग्रहण के लिए 0.1 है), डीआईसी छवि के रोटेशन कोण हिल्बर्ट परिणत करने की जरूरत, विशिष्ट मूल्यों 45 और -135 रहे हैं. अन्त में, ब्याज आकार के क्षेत्र में प्रवेश, इस पैरामीटर बाद में दिखाई देगा कि एक बॉक्स के एक पक्ष की लंबाई को परिभाषित करता है - विशिष्ट मूल्य 400 है. ठीक क्लिक करें.
  5. फोकल हवाई जहाज़ संख्या से निर्दिष्ट डीआईसी फोकल हवाई जहाज़ की एक छवि एक नीले बॉक्स के साथ दिखाई देंगे. एक सेल जैसे, ब्याज की सुविधा पर बॉक्स रखें. बॉक्स वर्ग की जरूरत नहीं है. बॉक्स वांछित क्षेत्र, बॉक्स के अंदर डबल क्लिक पर तैनात किया गया है.
  6. एक और आंकड़ा अब दिखाई देगा: यह आंकड़ा पिछले चरण में चयनित हित के क्षेत्र के एक फसली और घुमाया छवि शामिल हैं. छवि के विपरीत इस तरह होना चाहिएउज्ज्वल सुविधाओं सही पर दिखाई देते हैं, जबकि उस अंधेरे सुविधाओं बाईं तरफ दिखाई देते हैं. हित के क्षेत्र के ऊपर नीले बॉक्स खींचें, आवश्यक के रूप में नयी आकृति प्रदान करना.
  7. धारा 3 z ढेर घन के लिए एक मुखौटा उत्पन्न करता है. एक आयताकार मुखौटा सेल के चारों ओर एक आयत और हाथ से ब्याज की सेल की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक मुक्त हाथ उपकरण बनाने के लिए: उपलब्ध मास्क की दो प्रकार के होते हैं.
  8. एक आयताकार मुखौटा, Uncomment लाइन 167 और टिप्पणी लाइन 170 (कि रेखा की शुरुआत में एक "%" रखकर एक पंक्ति बाहर टिप्पणी) उत्पन्न करने के लिए. कार्यक्रम की धारा 3 निष्पादित करें. छवि में क्लिक करें और आयताकार मुखौटा परिभाषित शुरू करने के लिए माउस खींचें. यह स्वीकार करने के लिए बॉक्स पर डबल क्लिक करें.
  9. एक हाथ से तैयार मुखौटा, टिप्पणी लाइन 167 और Uncomment लाइन 170 उत्पन्न करने और धारा 3 पर अमल करने के लिए. क्लिक करें और माउस के साथ वांछित मुखौटा आकर्षित. यह स्वीकार करने के लिए मुखौटा पर डबल क्लिक करें.
  10. हिल्बर्ट निर्माण 4to भागो धारा डीआईसी छवि ढेर और हित के क्षेत्र के लिए इसी डीआईसी छवि ढेर में बदल दिया.धारा 3 में निर्माण मुखौटा डीआईसी ढेर और "maskON" रेखा 179 पर 1 पर सेट है जब नियमित रूप से जिला उद्योग केंद्र पर ढेर बदलना हिल्बर्ट को लागू किया जाएगा. 0 करने के लिए "maskON" सेटिंग मुखौटा लगाने के बिना छवि के ढेर का निर्माण होगा.
  11. हित के क्षेत्र के xz पार अनुभागीय छवियों की छवि विभाजन का अनुकूलन करने के लिए धारा 5 चलाएँ. इस कार्यक्रम के द्वारा उत्पादित चित्रा 500,, इसके विपरीत के तीन अलग अलग प्रकार प्रदर्शित प्रकट होता है. सेल की सीमाओं को खोजने के लिए कलन विधि की सफलता का इस्तेमाल मुखौटा और कार्यक्रम की लाइन 229 पर "सीमा" के मूल्य का एक संयोजन पर निर्भर है. 0.5 का एक मूल्य के साथ शुरू करो. सीमा के मूल्य को समायोजित करें और उचित रूपरेखा स्तंभों में से एक में हासिल की है जब तक कार्यक्रम के इस भाग को फिर से चलाएँ.
  12. बाह्य रेखांकन स्तंभ 1 में सबसे अच्छा था, डीआईसी छवि विभाजन का उपयोग मात्रा निर्धारित करने के लिए धारा 6 का उपयोग करें. स्तंभ 2 इष्टतम परिणाम दे दी है, हिल्बर्ट तब्दील डीआईसी कल्पना से सेल की मात्रा निर्धारित करने के लिए धारा 7 चला रहे हैं. यदि स्तंभ 3 Gavई इष्टतम परिणाम, चलाने के धारा 8 फूरियर फ़िल्टर हिल्बर्ट तब्दील डीआईसी इमेजरी का उपयोग मात्रा निर्धारित करने के लिए.
  13. घन मीटर (FL) की रिपोर्ट में नमूना की मापी मात्रा मात्रा माप चुना है जिस पर निर्भर करता है इस कार्यक्रम के द्वारा उत्पादित चित्रा 600, 700, या 800 के शीर्षक में प्रस्तुत किया है.

6. मास माप

  1. "JoVE_NIQPM_v1.m" हकदार NIQPM MATLAB प्रोग्राम खोलें.
  2. NIQPM कार्यक्रम की धारा 0 के तहत, कार्यक्रम चलाने के लिए आवश्यक तीन निर्देशिकाओं के स्थान का अद्यतन करें. ये "dependencies_directory," "brightfield_directory," और "dic_directory."
  3. अगला, धारा 1 चलाते हैं. कोड का यह खंड छवियों के पूरे सेट का पूरा क्षेत्र की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि घन उत्पन्न करता है. केवल एक बार धारा 1 रन.
  4. अगला, धारा 2 चला रहे हैं. "NIQPM मानकों को परिभाषित" शीर्षक से एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा. चार नंबर उपयोगकर्ता से आवश्यक हैं: फोकल हवाई जहाज़ संख्या जहां के उज्ज्वल क्षेत्र छविनमूना ध्यान में है, पार्श्व संकल्प (छवि में माइक्रोन / पिक्सेल), अक्षीय संकल्प (इस 0.1 माइक्रोन अक्षीय चरणों में छवि अधिग्रहण के लिए 0.1 है), और ब्याज आकार का क्षेत्र, इस पैरामीटर का एक पक्ष की लंबाई को परिभाषित करता है बाद में दिखाई देगा कि बॉक्स - एक विशिष्ट मूल्य 200 है. ठीक क्लिक करें.
  5. फोकल हवाई जहाज़ संख्या से निर्दिष्ट उज्ज्वल क्षेत्र फोकल हवाई जहाज़ की एक छवि एक नीले बॉक्स के साथ दिखाई देंगे.
    1. छवि को ध्यान में नहीं है, तो नीले बॉक्स और फिर से दौड़ना धारा 2 में डबल क्लिक करें, संवाद बॉक्स में फोकल हवाई जहाज़ संख्या को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें.
    2. छवि को ध्यान में है, तो छवि के चारों ओर नीले बॉक्स खींचें और बॉक्स के नोड्स का चयन और आवश्यक के रूप में उन्हें खींचकर इसे आकार. एक सेल जैसे, ब्याज की सुविधा के आसपास बॉक्स रखें. बॉक्स वर्ग की जरूरत नहीं है. यह स्वीकार करने के लिए बॉक्स के अंदर डबल क्लिक करें.
  6. अगला, चलाने के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का एक ढेर का निर्माण करने की धारा 3 में से इस क्षेत्र के लिए फसलीब्याज.
  7. चरण का नक्शा, छद्म डीआईसी छवि, और उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना और सच डीआईसी छवि से तुलना उत्पन्न करने के लिए, धारा 4 चलाते हैं.
  8. छद्म के साथ डीआईसी और जन घनत्व का नक्शा, कुल द्रव्यमान, और सेल घनत्व के हिस्टोग्राम यथासंभव समान सच डीआईसी छवियों धारा 5 ए या 5 ब चल द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. लाइन 300 पर अनुकूलन "दहलीज" - - धारा 5 ए क्षेत्र के स्वचालित आवासी पता लगाने के बाहर किया जाता है ठेठ मूल्यों 0.1-1 के बीच बदलती हैं. सीमा के मूल्य का अनुकूलन करने के लिए जरूरत के रूप में इस खंड फिर से चलाएँ. उपयोगकर्ता ब्याज की सेल की रूपरेखा के बाद धारा 5 ब आदि जन दृढ़ संकल्प, बाहर किया जाता है.

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Representative Results

के माध्यम से ध्यान केंद्रित छवि अधिग्रहण के दौरान सही नमूना रोशनी NIQPM एक एन डी HTDIC एल्गोरिदम के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 2 में हम डीआईसी और एक polystyrene क्षेत्र और मानव कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन SW620 के लिए उज्ज्वल क्षेत्र विपरीत दोनों के तहत कम और उच्च एनए रोशनी वर्णन. 2A आंकड़े, -2 सी, 2I, और 2k NIQPM के लिए इष्टतम इमेजिंग प्रदर्शित करता है. 2 एफ, 2H आंकड़े, 2N, और 2P HTDIC के लिए इष्टतम इमेजिंग प्रदर्शित करता है.

आंकड़े 3 और 4 सफल और असफल दोनों implementations पर प्रकाश डाला NIQPM एल्गोरिथ्म के पैरामीटर निर्भरता प्रदर्शित करता है. उम्मीद प्रोफाइल सैद्धांतिक रूप से जाना जाता है और इस प्रकार NIQPM पुनर्निर्माण के लिए सीधे तुलना में किया जा सकता है - चित्रा 3 में हम एक 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र के चरण प्रोफाइल का पता लगाएं. चित्रा 2L की एक% त्रुटि के साथ NIQPM के साथ लिया जा सकता है.

एक प्रत्यक्ष ऑप्टिकल माप से निर्धारित एक वास्तविक डीआईसी छवि, को - खंगाला चरण से गणना - जिसका चरण गुण एक प्राथमिकताओं नहीं जाना जाता सेलुलर नमूनों, एक 'छद्म डीआईसी "छवि की तुलना करने की एक प्रक्रिया के साथ संयोजन के रूप में NIQPM का उपयोग खंगाला जा सकता है सेल की. गणना केंद्रित है, जिस पर उज्ज्वल क्षेत्र छवि ढेर में विमान - NIQPM एक मुक्त पैरामीटर है. यह केंद्रीय फोकल हवाई जहाज़ correspondin छद्म डीआईसी और सच डीआईसी छवियों. आंकड़े 4E जी एक बाहर का ध्यान केंद्रित छद्म डीआईसी छवि, एक इष्टतम छद्म डीआईसी छवि का प्रदर्शन संभव के रूप में इसी तरह लग रहे जब तक समायोजित किया जाना चाहिए, और0.9 की एक रोशनी एनए के साथ लिया सेल के ग्राम डीआईसी छवि. दिलचस्प है, सबसे अच्छा चरण का नक्शा और इसी छद्म डीआईसी छवि जरूरी एक फोकस उज्ज्वल छवि क्षेत्र में, अर्थात्. आंकड़े 1 ए और 1 बी के अनुरूप नहीं है.

अन्त में, चित्रा 5 HTDIC छवि प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म में शामिल कदम दिखाता है. एनए के तहत जिला उद्योग केंद्र के माध्यम से फोकस कल्पना = 0.9 रोशनी से, 5 ए और 5D आंकड़े, हिल्बर्ट को बदलने डीआईसी छवियों की बस राहत दूर करने के लिए preformed है, 5 ब और 5E रु. यह कुछ उच्च मार्ग फूरियर छानने से हटाया जा सकता है कि ऑप्टिकल अक्ष के साथ धुंधला के साथ आता है, 5C और 5F रु. इन अंतिम छवियों को आसानी से कुल सेलुलर मात्रा का अनुमान लगाने के लिए नमूना का प्रत्येक पार अनुभागीय विमान में क्षेत्र निर्धारित करने के लिए खंडित कर रहे हैं.

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चित्रा 1. NIQPM और HTDIC कार्यप्रवाह. (1.) ऐसी कोशिकाओं के रूप में सूक्ष्म नमूनों माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की जानी चाहिए Fluoromount जी का उपयोग नमूना पर चिपका कवर गिलास के साथ स्लाइड्स (2.) डीआईसी और एक मानक के साथ उज्ज्वल क्षेत्र विपरीत दोनों में अधिग्रहित माध्यम से ध्यान केंद्रित छवियों "बंद-the-शेल्फ" माइक्रोस्कोप छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के लिए इनपुट के रूप में. (3.) MATLAB में छवियों के बाद के प्रसंस्करण डीआईसी से सेल मात्रा और उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना से सेलुलर जन वितरण निर्धारित करने के लिए. (4.) मात्रात्मक समापन बिंदु मेट्रिक्स:. गर्मी नक्शे और बार रेखांकन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 2. के माध्यम से फोकस डीआईसी और polystyrene क्षेत्रों और SW620 सेल लाइनों के उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना. NIQPM के लिए इष्टतम इमेजिंग शर्तों 0.1 एनए रोशनी के साथ उज्ज्वल क्षेत्र विपरीत हैं. HTDIC डीआईसी के लिए, 0.9 एनए रोशनी इष्टतम है. (ए, बी) एन क्रमश: 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी करने के लिए 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र विषय के उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना का सामना. (सी, डी) 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी करने के लिए 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र विषय के पार अनुभागीय उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना, क्रमशः. (ई, एफ) एन चेहरे डीआईसी 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी करने के लिए 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र विषय की कल्पना, क्रमशः. (जी, एच) 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र है के पार अनुभागीय डीआईसी कल्पनाक्रमशः, 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी को ubject. (I, j) एन क्रमश: 0.1 और 0.9 एनए रोशनी को SW620 कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइन विषय के उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना का सामना. (कश्मीर, एल) क्रमशः क्रॉस अनुभागीय 0.1 SW620 सेल विषय के उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना और 0.9 एनए रोशनी,. (एम, एन) एन चेहरे डीआईसी 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी को SW620 सेल विषय की कल्पना, क्रमशः. (हे, पी) 0.1 एनए और 0.9 एनए रोशनी को SW620 सेल विषय के पार अनुभागीय डीआईसी कल्पना. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. इष्टतम और suboptimal चरण पुनर्निर्माण:. 4.8 माइक्रोन व्यास polystyrene क्षेत्र प्रत्येक पंक्ति विमान फोकल क्षेत्र के माध्यम से मध्य में शुरू होता है के रूप में एन उज्ज्वल क्षेत्र तीव्रता (प्रथम स्तंभ) और खंगाला चरण प्रोफाइल चेहरे के फोकल हवाई जहाज़ निर्भरता की जांच, जेड = 0 , और 1 माइक्रोन चरणों में यह विमान अतीत में जाता है. चरण के विकर्ण के साथ खंगाला चरण प्रोफ़ाइल के (ए, ई, मैं, एम) ई एन उज्ज्वल क्षेत्र तीव्रता का सामना, (बी, एफ, जे, एन) इसी चरण पुनर्निर्माण, (सी, जी, कश्मीर, हे) तुलना नक्शे, नीले हलकों, सैद्धांतिक लाल में चरण प्रोफाइल, और निर्माता की त्रुटि सहिष्णुता, काले लाइनों, और (डी, एच, एल, पी) प्रतिशत (%) खंगाला पी की त्रुटिHASE सैद्धांतिक चरण प्रोफाइल के संबंध में. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. इष्टतम और suboptimal चरण पुनर्निर्माण:. SW620 सेल दो स्तंभों चरण गणना केंद्र के लिए z ढेर से suboptimal और इष्टतम उज्ज्वल क्षेत्र छवि विमानों (ए, बी) की तुलना करें. इसी चरण पुनर्निर्माण (सी, डी) एक छद्म डीआईसी छवि (ई, एफ) उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये सच डीआईसी छवि की तुलना कर रहे हैं, एनए (जी) में 0.9 रोशनी =. सबसे अच्छा डीआईसी छवि से मेल खाते छद्म डीआईसी छवि उज्ज्वल क्षेत्र आईएमए से सही इनपुट छवियों को निर्धारित करता हैजीई ढेर चरण पुनर्निर्माण में उपयोग करने के लिए. अंत में, चरण का अनुमान जन घनत्व (एच, आई) के लिए मैप किया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. HTDIC का उपयोग इष्टतम डीआईसी विपरीत वृद्धि: polystyrene क्षेत्रों और SW620 सेल. एक 4.8 polystyrene क्षेत्र (ए) क्रॉस अनुभागीय डीआईसी कल्पना, (बी) HTDIC छवि, इसी (सी) फूरियर HTDIC छवि फ़िल्टर्ड. क्षेत्र छवियों का अक्षीय आयाम नमूना (1.597) का अपवर्तनांक बेमेल और बढ़ते मीडिया (1.4) के लिए खाते में करने के लिए बढ़ाया गया है. (डीएफ) कोई अपवर्तक मैं के साथ, तथापि, एक SW620 सेल के लिए एक ही छवि प्रकार का प्रदर्शननमूना के कमजोर सूचकांक विपरीत के कारण ndex बेमेल सुधार. कोई thresholding इन छवियों पर प्रदर्शन किया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सामान्य में, NIQPM .25-44.7 लेकर ऑप्टिकल पथ लंबाई पर मान्य एक विवर्तन सीमित तकनीक है. मान्यकरण n पर प्रदर्शन किया गया था = Fluoromount जी में निलंबित 0.11-9.8 माइक्रोन से व्यास में लेकर 1.596 polystyrene क्षेत्रों (नहीं दिखाया डेटा). कोशिकाओं लगभग 0-7 कि सीमा से ऑप्टिकल पथ लंबाई के पास है.

एक नमूना का घनत्व वितरण को मापने जब एक घनत्व नक्शा अवांछित पृष्ठभूमि योगदान के पास है, जबकि छद्म डीआईसी छवि ठीक लग रहा है कि मिल सकता है. इस NIQPM कलन विधि को इनपुट के रूप में इस्तेमाल नमूना के उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना में शोर की वजह से है. NIQPM विधि के लिए दो संभावित संशोधनों अवांछित पृष्ठभूमि योगदान को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: सबसे पहले, एक संकेत करने वाली शोर उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना में बढ़ाने के लिए लंबे समय तक जोखिम बार प्रयोग कर सकते हैं. ऑप्टिकली पतली नमूनों इमेजिंग जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से, एक z ढेर acquisit का अक्षीय रिक्ति को कम कर सकतेNIQPM एल्गोरिथ्म में उन्हें inputting से पहले एक साथ 0.1-0.05 माइक्रोन और औसत 2-3 विमानों से आयन.

HTDIC आधारित मात्रा निर्धारण 1-20 माइक्रोन से व्यास में लेकर polystyrene क्षेत्रों पर मान्य किया गया है और confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 35 के साथ पार मान्य किया गया है. तकनीक की वजह प्रकाशिकी की बात फैल समारोह के साथ जुड़े विवर्तन प्रभाव के लिए प्रणाली का विवर्तन सीमा से नीचे वस्तुओं की मात्रा overestimates.

शायद छोटी या पतली नमूनों के लिए आवश्यक HTDIC मात्रा निर्धारण समस्या निवारण. त्रुटि का प्राथमिक स्रोत पार अनुभागीय छवियों में सेल की सीमाओं का निर्धारण किया जाता है निर्मित में matlab सोबेल आधारित बढ़त का पता लगाने का उपयोग कर छवि विभाजन से आता है. HTDIC कार्यक्रम की धारा 4 में "सीमा" का मूल्य सबसे अच्छा विभाजन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है. परिणाम एक nonlinear तरह से भिन्न हैं - "दहलीज" drasticall में छोटे परिवर्तन के साथY बढ़त का पता लगाने से उत्पन्न संलग्न क्षेत्र बदल रहा है. मौजूदा कार्यक्रम डीआईसी z ढेर, HTDIC z ढेर, या एफ HTDIC z ढेर से या तो छवि विभाजन प्रदर्शन करने के विकल्प के साथ उपयोगकर्ता प्रस्तुत करता है.

अकेले डीआईसी बड़े नमूनों के लिए अक्सर बेहतर है, जबकि HTDIC और छोटे नमूनों (<व्यास में 5 माइक्रोन) के लिए F-HTDIC काम.

एक मुखौटा खंड के लिए विधि की क्षमता छवि में वृद्धि कर सकते हैं. धारा 2 उपयोगकर्ता छवि क्यूब को लागू करने के लिए एक मुखौटा निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. क्यूब के ऊर्ध्वाधर (Y-हद तक) के संरक्षण, जबकि हम घन की क्षैतिज (एक्स हद तक) truncates कि एक आयताकार मुखौटा के उपयोग की सलाह देते हैं.

संक्षेप में, NIQPM और HTDIC सबसे मौजूदा तरीकों के विपरीत, मानक "बंद-the-शेल्फ" ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि तकनीकी रूप से सुलभ मात्रात्मक इमेजिंग रूपात्मकता हैं. इन तकनीकों को सेंट्रल appr के तहत नमूने के माध्यम से फोकस कल्पना हैopriate इमेजिंग की स्थिति: NIQPM के लिए कम NA रोशनी, और HTDIC के लिए उच्च एनए रोशनी. यहाँ प्रस्तुत तरीकों का प्रदर्शन यहां उन लोगों की तुलना में अन्य प्रणालियों पर उपयोग के लिए सामान्यीकरण नहीं किया जा सकता है. इन प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक प्राथमिक मापदंड उपयोगकर्ता चरण की जेड आंदोलन और उद्देश्य लेंस के फोकल स्थिति विविध है के रूप में छवियों को प्राप्त करने की क्षमता पर नियंत्रण है, जिसके लिए एक माइक्रोस्कोप है. प्रस्तुत तरीकों तय कोशिकाओं इमेजिंग या धीरे धीरे जैविक नमूनों में जाने के लिए उपयुक्त हैं.

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Disclosures

लेखकों प्रस्तुत काम में कोई वित्तीय हित है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (OJTM को KGP, OJTM और R01HL101972 को U54CA143906) और एक ओरेगन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन प्रारंभिक नैदानिक ​​अन्वेषक पुरस्कार (KGP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. OJTM एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन की स्थापना अन्वेषक (13EIA12630000) है. हम इस काम में इस्तेमाल सेल के नमूने तैयार करने के लिए नाइट कैंसर संस्थान के डॉ. एरिक एंडरसन धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

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