Neuroblast migrasjon er et viktig skritt i postnatal neurogenesis. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å undersøke hvilken rolle kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon ved å bruke DNA / liten hårnål RNA (shRNA) nucleofection og en 3D migrasjon analysen med neuroblasts isolert fra gnager postnatal rostral migrasjonsstrømmen.
Subventricular sone (SVZ) ligger i den laterale vegg av sideventriklene spiller en fundamental rolle i voksen neurogenesis. I dette begrensede området av hjernen, nevrale stamceller spre seg og stadig generere neuroblasts som vandrer tangentielt i kjettinger langs rostral migrasjonsstrømmen (RMS) for å nå luktelappen (OB). En gang i OB, neuroblasts bytte til radial migrasjon og deretter skille seg til modne nerveceller i stand til å innlemme i den allerede eksisterende nevronale nettverk. Riktig neuroblast migrasjon er et fundamentalt skritt i neurogenesis, sikrer riktig funksjonelle modning av nyfødte nerveceller. Gitt evne SVZ-avledet neuroblasts å målrette skadede områder i hjernen, gransker intracellulære mekanismene bak deres motilitet ikke bare vil øke forståelsen av neurogenesis, men kan også bidra til utvikling av neuroregenerative strategier.
Dette manuskriptet beskriver en detaljertprotokoll for transfeksjon av primær gnager RMS postnatal neuroblasts og analyse av deres motilitet ved hjelp av en 3D in vitro migrasjon analysen rekapitulere sin modus av migrasjon observert in vivo. Både rotte-og muse neuroblasts kan raskt og effektivt via nucleofection transfektert enten med plasmid-DNA, liten hårnål (sh) RNA eller kort interfererende (si) RNA oligos rettet gener som er av interesse. Å analysere migrasjon, er nucleofected celler reaggregated i 'hengende dråper' og senere innebygd i en tredimensjonal matrise. Nucleofection per se ikke vesentlig svekker migrasjon av neuroblasts. Medikamentell behandling av nucleofected og reaggregated neuroblasts kan også utføres for å studere rollen til signalveier involvert i neuroblast migrasjon.
I den postnatal hjernen hos pattedyr, generering av nye nerveceller (neurogenesis) skjer gjennom hele livet, og er begrenset til to nevrogene nisjer: subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene og subgranular sone av dentate gyrus av hippocampus en. Flere nyere studier har vist den viktige rollen som voksen neurogenesis i å tilrettelegge læring og hukommelse oppgaver 2,3. Videre bevis på spredning og rekruttering av nevrale stamceller følgende hjerneskade 4-7 øker muligheten for farmakologiske aktivering av neurogenesis i nevrale reparasjon.
Postnatal neurogenesis er strengt regulert i alle dens faser, som inkluderer nevrale stamceller spredning, migrasjon, differensiering, overlevelse, og endelig synaptiske integrering av nyfødte nerveceller åtte. Nevrale stamceller (neuroblasts) avledet fra stamceller i SVZ migrere over en stor avstand gjennom rostral vandrendestream (RMS) mot luktelappen (OB) hvor de modnes til funksjonelle nerveceller ni. Trekkende neuroblasts er overveiende unipolar, med en langstrakt cellekroppen strekker en enkelt ledende prosess. Disse cellene beveger seg i kjeder i en kollektiv måte, glir over hverandre 10. Migrasjon er et viktig skritt for den påfølgende modning av SVZ-avledet stamceller inn i funksjonelle nerveceller 11 og styres av flere faktorer og veiledning molekyler inkludert: polysialylated nevrale celleadhesjonsmolekylet (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, inte 14, Slits 15, vekstfaktorer 16 og nevrotransmitterne 17, men de molekylære mekanismene bak denne prosessen ikke er fullt ut forstått. Gransker de intracellulære signalveier som regulerer neuroblast migrasjon vil ikke bare gi en bedre forståelse av voksen neurogenesis, men vil også bidra til utvikling av nye terapeutisketilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å studere rollen til kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon in vitro ved hjelp nucleofection og en 3D migrasjon analysen. Nucleofection er en celle transfeksjon teknikk basert på en forbedret fremgangsmåte for elektroporering. Cell-type spesifikke elektrisk strøm og nucleofection løsning tillate overføring av polyanionisk makromolekyler som DNA og shRNA vektorer og siRNA oligonukleotider direkte inn i cellekjernen og tillatelse transfeksjon av sakte å dele eller mitotisk inaktive celler som embryonale og pattedyr nevroner 18. Denne metoden er rask, relativt enkel å utføre og resultater i svært reproduserbare transfeksjon av et bredt spekter av celletyper, inkludert primær neuroblasts og nevroner 19-21.
Dissosiasjon av RMS vev tillater isolering av trekk neuroblasts, noe som kan med hell nucleofected med DNA / SHRNA vektorer eller siRNA oligos målretting gener av interesse. Etter nucleofection, er neuroblasts reaggregated i hengende dråper og senere innebygd i en tredimensjonal Matrigel matrise. Disse betingelsene tillater neuroblasts til å migrere ut av celleaggregater rekapitulere migreringsmodus observert in vivo, og dermed gi en utmerket modellsystem for å undersøke signalveier som er involvert i neuroblast migrering og å vurdere påvirkning av farmakologiske behandlinger på motilitet av disse cellene.
Migrasjon av neuroblasts langs RMS til den endelige plasseringen i OB er et fundamentalt skritt i postnatal neurogenesis. Men de molekylære mekanismer som styrer denne komplekse prosessen er langt fra å bli fullt ut forstått.
Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her gjør det mulig å studere neuroblast migrering in vitro. Vi har tilpasset en tidligere utgitt protokoll for å isolere RMS neuroblasts fra tidlig postnatal mus eller rotte 25. For å oppnå optimale resultater er det viktig å mestre disseksjon trinnet, siden det er viktig å holde tidsintervallet mellom disseksjon og nucleofection til et minimum. Etter nucleofection, kan neuroblasts bli reaggregated, forankret i en tredimensjonal matrise og venstre for å migrere over en 24 timers periode. Alternativt, for andre enn migrasjon (f.eks immunfluorescens eller western blot analyse) formål, celler kan umiddelbart belagt etter nucleofection på polyornithine/laminin-belagt dekkglass, der de overlever opptil 4-5 dager. Mus og rotter neuroblasts migrere i Matrigel i en lignende grad, men museceller ser ut til å ha en sterkere tendens til å migrere i kjeder enn rotteceller.
Avhengig av formålet med studien, kan neuroblasts bli nucleofected med ulike plasmider som koder fluorescerende proteiner eller villtype / mutant proteiner av interesse. For optimal protein ekspresjonsplasmider med CAG promoter (β-aktin promoter med CMV Enhancer og β-globin poly-A hale) 26 er sterkt anbefalt. Videre kan siRNA oligos eller shRNA plasmider bli nucleofected til knockdown mål av interesse. Effektiv protein uttømming kan visualiseres ved immunofluorescens eller ved western blot (vanligvis lysering innvevde tilslag fra en rotteunge med 50 pl standard lysis buffer).
Nucleofection er en relativt enkel metode for å transfektere primære neuroblasts, tilbyr en enklere og raskere alternativ til VIral vektor-formidlet transfeksjon, og kan oppnå høy (~ 70-80%) transfeksjon effektivitet. Det er viktig å arbeide raskt under nucleofection prosedyren, siden forlate neuroblasts i nucleofection løsning i et lengre tidsrom drastisk reduserer cellenes levedyktighet.
Den gjennomsnittlige celle utbytte fra RMS disseksjon er relativt lav for P7 mus (~ 5 x 10 5 celler / hjerne) i forhold til P7 rotter (~ 1 x 10 6 celler / hjerne) og minst 3 x 10 6 celler pr nucleofection kreves for å oppnå transfeksjon med ~ 50% effektivitet. Videre rotte neuroblasts synes å motstå bedre å nucleofection forhold til muse neuroblasts. Derfor kan tidlig postnatal (P6-P7) rotteunger representerer en praktisk neuroblast kilde, også med tanke på at organiseringen av rotter og mus RMS er bemerkelsesverdig simiLar 27 og at graden av rotter og mus neuroblast migrering in vitro er også sammenlignbare. Det er ikke tilrådelig å holde reaggregated klynger av nucleofected neuroblasts i suspensjon i mer enn 48 timer for å unngå unormale effekter på celle morfologi og migrasjon (våre upubliserte observasjoner).
3D-analysen beskrevet her kan brukes til å kvantifisere neuroblast migrasjon på et fast tidspunkt etter innstøping i matrise (f.eks. 24 timer). Aggregater av forskjellige størrelser kan anvendes i analysen, siden det er ingen signifikant korrelasjon mellom størrelsen på aggregatene og migrering avstand (våre upubliserte observasjoner). For å visualisere og videre undersøke dynamikken i neuroblast migrasjon, kan time-lapse bildebehandling brukes. Det anbefales migreringsanalyse til å utføre i løpet av en 24 timers intervall etter innstøping, ettersom hastigheten til neuroblasts ser ut til å bli drastisk redusert ved lengre tidspunkter (våre upubliserte observasjoner). </ P>
Det er noen begrensninger i denne protokollen. Først kan nucleofection så langt brukes for tidlig postnatal gnager neuroblasts, mens infeksjon med virale vektorer er fortsatt den mest effektive transfeksjon metoden for voksne neuroblasts 28. For det andre tillater den in vitro assay migrasjon ikke fullt ut gjenskape kompleks arkitektur av RMS observert in vivo. Faktisk, selv om neuroblasts opprettholde evnen til å migrere på en lignende måte til deres in vivo-motstykker, i det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet her de mangler interaksjoner med andre komponenter slik som RMS-astrocytter og blodkar, noe som også bidrar til å regulere deres motilitet 9,29, 30. Dette problemet kan bli løst i fremtiden ved optimalisering av tredimensjonale coculture modellsystemer.
I konklusjonen, kombinerer nucleofection med en 3D migrasjon analysen representerer et verdifullt verktøy for å bedre forstå de molekylære mekanismene bakneuroblast migrasjon. Dette eksperimentelle prosedyren gir en innledende, rask og relativt enkel metode for å vurdere betydningen av kandidat regulatorer av neuroblast migrasjon, som kan bli ytterligere validert av andre tilnærminger som in vivo postnatal elektroporering og time-lapse avbildning av hjernen skive kulturer 28,31,32 .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome Trust Prosjekt Grant tildelt PD og GL (089236/Z/09/Z). SG ble støttet av en Bioteknologi og Biological Sciences Research Council PhD student. Vi takker Matthieu Vermeren for den type gave shRNA vektor og Jennifer Shieh for verdifulle råd om neuroblast nucleofection.
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
Sucrose | BDH | 102745C | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
Nucleofector II | Lonza |