Neuroblast migration er et afgørende skridt i postnatal neurogenesis. Protokollen beskrevet her kan bruges til at undersøge, hvilken rolle af kandidat regulatorer af neuroblast migration ved at ansætte DNA / lille hårnål RNA (shRNA) nucleofection og en 3D migration assay med neuroblasts isoleret fra gnaver postnatal rostral vandrende stream.
Den subventricular zone (SVZ) placeret i den laterale væg af de laterale ventrikler spiller en fundamental rolle i voksen neurogenesis. I denne begrænsede område af hjernen, neurale stamceller proliferere og genererer løbende neuroblaster, der vandrer tangentialt kæder langs rostralt vandrende strøm (RMS) for at nå lugtekolben (OB). Når i OB neuroblaster skifte til radial migration og differentierer til modne neuroner i stand til at inkorporere det forud eksisterende neuronale netværk. Korrekt neuroblast migration er et grundlæggende skridt i neurogenesis, sikre korrekt funktionelle modning af nyfødte neuroner. Grund af mulighederne i SVZ-afledte neuroblasts at målrette sårede områder i hjernen, undersøge de intracellulære mekanismer bag deres motilitet vil ikke blot øge forståelsen af neurogenese, men kan også fremme udviklingen af neuroregenerative strategier.
Dette håndskrift beskriver en detaljeretprotokol for transfektion af primær gnaver RMS postnatal neuroblasts samt analyse af deres motilitet hjælp af en 3D in vitro migration assay opridset deres tilstand af migration observeret in vivo. Både rotter og mus neuroblasts kan hurtigt og effektivt transficeret være via nucleofection med enten plasmid-DNA, lille hårnål (sh) RNA eller kort forstyrrende (si) RNA oligos rettet gener af interesse. At analysere migration, er nucleofected celler reaggregated i 'hængende dråber' og efterfølgende indlejret i en tre-dimensionel matrix. Nucleofection per se ikke væsentligt forringer migration af neuroblasts. Farmakologisk behandling af nucleofected og reaggregated neuroblaster kan også udføres for at undersøge den rolle, signalveje, der er involveret i neuroblast migration.
I den postnatale pattedyrhjernen generering af nye neuroner (neurogenese) sker gennem hele livet og er begrænset til to neurogene nicher: den subventrikulære zone (SVZ) af de laterale ventrikler og subgranular zone af gyrus dentatus i hippocampus 1. Adskillige nyere undersøgelser har vist den vigtige rolle, voksen neurogenese lette indlæring og hukommelse opgaver 2,3. Desuden beviser for spredning og rekruttering af neurale stamfædre efter hjerneskade 4-7 nævner muligheden for farmakologisk aktivering af neurogenese i neurale reparation.
Fødselsdepression neurogenese er strengt reguleret i alle dets faser, som omfatter neurale stamfader proliferation, migration, differentiering, overlevelse, og endelig synaptisk integration af nyfødte neuroner 8. Neurale progenitorer (neuroblasts) afledt af stamceller i SVZ migrere over en stor afstand gennem rostral vandrendestrøm (RMS) mod lugtekolben (OB), hvor de modnes i funktionelle neuroner 9. Vandrende neuroblasts er overvejende unipolar, med et aflangt cellen kroppen udvide en enkelt ledende proces. Disse celler bevæger sig i kæder i en kollektiv måde, glider over hinanden 10. Migration er et afgørende skridt for den efterfølgende modning af SVZ-afledte stamfædre i funktionelle neuroner 11 og er kontrolleret af flere faktorer og vejledning molekyler herunder: polysialylated neural celleadhæsionsmolekyle (PSA-NCAM) 12, Ephriner 13, integriner 14, slidser 15, vækstfaktorer 16 og neurotransmittere 17, men de molekylære mekanismer, der ligger denne proces er ikke fuldt forstået. Undersøge de intracellulære signalveje regulerer neuroblast migration vil ikke kun give en bedre forståelse af voksen neurogenese, men vil også bidrage til udviklingen af det nye terapeutisketilgange til at fremme hjernens reparation.
Dette håndskrift beskrives en detaljeret protokol til at undersøge den rolle, kandidat regulatorer af neuroblast migration in vitro ved anvendelse nucleofection og en 3D migration assay. Nucleofection er en celle transfektion teknik baseret på en forbedret fremgangsmåde til elektroporation. Celletypespecifik af elektrisk strøm og nucleofection løsning tillader overførsel af polyanioniske makromolekyler, såsom DNA-og shRNA vektorer og siRNA oligonukleotider direkte ind i cellekernen og tillade transfektion langsomt dividere eller mitotisk inaktive celler som embryonale og pattedyrs neuroner 18. Denne metode er hurtig, forholdsvis let at udføre og resulterer i meget reproducerbar transfektion af en bred vifte af celletyper, herunder primære neuroblasts og neuroner 19-21.
Dissociation RMS væv tillader isolering af vandrende neuroblaster, som med held kan nucleofected med DNA / SHRNA vektorer eller siRNA oligoer målretning gener af interesse. Efter nucleofection er neuroblasts reaggregated i hængende dråber og efterfølgende indlejret i en tre-dimensionel Matrigel matrix. Disse betingelser tillader neuroblasts at migrere ud af cellen aggregater opridset migration tilstanden observeres in vivo, hvilket giver en fremragende model system til at undersøge signalveje involveret i neuroblast migration og at vurdere indflydelsen af farmakologiske behandlinger på motilitet af disse celler.
Migrationen af neuroblasts langs RMS til den endelige placering i OB er et grundlæggende skridt i postnatal neurogenesis. Men de molekylære mekanismer, der styrer denne komplekse proces er langt fra at være fuldt forstået.
Den eksperimentelle procedure, der er beskrevet her tillader undersøgelse af neuroblast migration in vitro. Vi har tilpasset en tidligere offentliggjort protokol til isolering RMS neuroblasts fra tidlig postnatal mus eller rotte 25. For at opnå optimale resultater er det vigtigt at beherske dissektion trin, da det er afgørende at holde tidsintervallet mellem dissektion og nucleofection til et minimum. Efter nucleofection kan neuroblaster blive reaggregated, indlejret i en tredimensional matrix og efterladt til at migrere over en 24 timers periode. Alternativt til andre formål end migration (fx immunfluorescens eller western blot analyse) formål, celler kan umiddelbart forgyldt efter nucleofection på polyornithine/laminin-overtrukne dækglas, hvor de overlever op til 4-5 dage. Mus og rotter neuroblasts migrere i Matrigel et tilsvarende omfang dog museceller synes at have en stærkere tendens til at migrere i lænker end rotteceller.
Afhængigt af formålet med undersøgelsen kan neuroblaster blive nucleofected med forskellige plasmider, der koder for fluorescerende proteiner eller vildtype / mutant proteiner af interesse. For at opnå optimale protein ekspressionsplasmider med CAG promotor (β-actin-promotoren med CMV-enhanceren og β-globin-poly-A-hale) 26 er stærkt anbefales. Desuden kan siRNA oligoer eller shRNA plasmider nucleofected at Knockdown mål af interesse. Effektiv protein udtømning kan visualiseres ved immunofluorescens eller ved Western blot (normalt lysering indlejrede aggregater fra en rotteunge med 50 pi standard lysis buffer).
Nucleofection er en forholdsvis enkel metode til at transficere primære neuroblaster, giver en lettere og hurtigere alternativ til viral vektor-medieret transfektion, og kan opnå høj (~ 70-80%) transfektionseffektivitet. Det er vigtigt at arbejde hurtigt under nucleofection procedure, da forlader neuroblasts i nucleofection løsning for en længere tid drastisk reducerer cellernes levedygtighed.
Den gennemsnitlige celleudbytte fra RMS dissektion er relativt lav for P7-mus (~ 5 x 10 5 celler / hjerne) i forhold til P7 rotter (~ 1 x 10 6 celler / hjerne) og mindst 3 x 10 6 celler pr nucleofection kræves at opnå transfektion med ~ 50% effektivitet. Desuden rotte neuroblaster synes at modstå bedre at nucleofection forhold til mus neuroblasts. Derfor kan tidlig postnatal (P6-P7) rotteunger repræsentere en bekvem neuroblast kilde, overvejer også at organiseringen af rotter og mus RMS er bemærkelsesværdigt similar 27 og at omfanget af rotter og mus neuroblast migration in vitro er også sammenlignelige. Det er tilrådeligt ikke at holde reaggregated klynger af nucleofected neuroblasts i suspension i længere tid end 48 timer for at undgå unormale virkninger på celle morfologi og migration (vores upublicerede observationer).
3D-assay beskrevet her kan anvendes til at kvantificere neuroblast migration på et fast tidspunkt efter indlejring i matrixen (f.eks. 24. time). Aggregater af forskellige størrelser kan anvendes i analysen, da der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem størrelsen af aggregater og migration afstand (vores upublicerede observationer). At visualisere og yderligere at undersøge dynamikken i neuroblast migration, kan time-lapse billeddannelse anvendes. Det anbefales at udføre analysen migration inden for en 24 timers interval efter indlejring, da hastigheden af neuroblasts synes at drastisk nedsætte ved længere tidspunkter (vores upublicerede observationer) <./ P>
Der er nogle begrænsninger i denne protokol. For det første kan nucleofection hidtil anvendes for tidlige postnatale gnaver neuroblaster, mens infektion med virale vektorer er fortsat den mest effektive metode til transfektion voksne neuroblaster 28. For det andet, har in vitro-migration assay ikke helt gengive den komplekse arkitektur RMS observeret in vivo. Selv om neuroblaster opretholde evnen til at migrere på en lignende måde til deres in vivo modstykker i forsøgsopstillingen beskrives her de mangler interaktioner med andre RMS komponenter såsom astrocytter og blodkar, som også bidrager til at regulere deres motilitet 9,29, 30.. Dette problem kan løses i fremtiden ved optimering af tre-dimensionelle cokultur modelsystemer.
Konklusionen er, at kombinere nucleofection med et 3D-migration assay udgør et værdifuldt redskab til bedre at forstå de molekylære mekanismer, der liggerneuroblast migration. Denne eksperimentelle procedure giver en indledende, hurtig og relativt enkel metode til at evaluere rollen af kandidat regulatorer af neuroblast migration, som yderligere kan valideres af andre metoder som in vivo postnatal elektroporation og time-lapse billeddannelse af hjernen skivekulturer 28,31,32 .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af en Wellcome Trust Project Grant tildelt PD og GL (089236/Z/09/Z). SG blev understøttet af en bioteknologi og biologiske Sciences Research Council Ph.d. studentship. Vi takker Matthieu Vermeren for den slags gave shRNA vektor og Jennifer Shieh for værdifuld rådgivning om neuroblast nucleofection.
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
Sucrose | BDH | 102745C | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
Nucleofector II | Lonza |