Summary
本协议描述了一种新的识别去核红细胞正色由多光谱成像流式细胞仪，以提供红细胞去核过程的可视化的群体的方法。
Abstract
红细胞生成哺乳动物总结了眼球摘除的戏剧性过程，结果在网织红细胞的形成。眼球摘除的机制尚未完全阐明。学习去核红细胞显微镜中的关键蛋白和结构的本地化时遇到的一个常见问题是，观察细胞进行眼球摘除足够数量的难度。我们已经开发了一种新的协议分析使用流量多参数高速细胞成像（多光谱成像流式细胞仪），结合免疫荧光流式细胞仪中，为了确定有效的一个显著号码去核的事件的方法，它允许获得测量和进行统计分析。
首先，我们在这里描述，以便用于同步小鼠红细胞和增加捕获眼球摘除在日的概率两人在体外培养红细胞生成方法评估电子时间。然后，我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪过程中，研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后红细胞的染色。随着尺寸和它们用来识别正色红细胞DNA/Ter119染色，我们利用在明视场通道，辅助在识别细长细胞和“三角形的质心的XY Ter119/Draq5的小区的参数”纵横比“ “允许的细胞事件，其中TER119染色（新生网织红细胞）的中心相距甚远DRAQ5染色（细胞核进行挤压）的中心，鉴定因而指示一个即将去核细胞。的正色红细胞种群具有高增量的质心和低纵横比的子集被高度富集在去核细胞。
Introduction
在哺乳动物中红细胞系内终末分化的结论与去核的戏剧性的过程，通过该正色红细胞排出其膜包裹的核（pyrenocyte）1，产生一个网织红细胞2。这个过程的确切机制，这也是成功的限速步骤，大规模生产的红血细胞在体外 ，还没有完全阐明。去核红细胞内关键的蛋白质和结构的定位依赖于使用荧光显微镜和电子显微镜3-5。这个繁琐的过程通常会导致的眼球摘除活动数量有限的识别，并且不总是允许有意义的统计分析。扩大对红细胞鉴定麦格拉思等 6前面所述的方法，我们已经开发了一种新的由多光谱伊马确定和研究眼球摘除事件的方法更改流式细胞仪（多参数高速细胞成像中流动，它结合了荧光显微镜与流式细胞术的方法）7，它可以提供的观测足够数量以获得测量值，并执行统计分析。
在这里，我们描述了前两个在体外培养红细胞生成为了同步红细胞和增加捕获眼球摘除在评估时的概率使用的方法。然后，我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪中，研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后红细胞的染色。
样品上的成像流运行流式细胞仪和将收集的细胞的门控适当地识别正色红细胞6。正色红细胞，然后根据它们的纵横比进行分析，测得在明场图像进行更改，对他们的参数增量的质心的XY TER119-DNA，其被定义为分别染色TER119和DNA的区域中，中心之间的距离值。细胞低高宽比和高三角形质心的XY Ter119/DNA的人口是高度浓缩的去核的细胞。用野生型（WT）与红细胞与红细胞的Rac1蛋白在rac2上的Mx-Cre重组酶介导的条件缺失- / -或组合的Rac2 - / - ; RAC3 - / -遗传背景和多光谱成像流这种新型分析仪的协议，我们最近表明，眼球摘除类似于非对称细胞分裂，并通过外消旋GTP酶在调节部分的肌动球蛋白环的形成是眼球摘除进展7重要。
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Protocol
1，长期体外培养红细胞生成（ 体外红系分化培养议定书Giarratana 等。8，修改和调整鼠标电池）
这是一个三步骤的长期体外红细胞生成协议。在第一步骤（天0-4）2×10 5个细胞/ ml被放置在补充有干细胞因子（SCF），白细胞介素-3（IL-3），和促红细胞生成素（EPO）的红细胞的生长培养基。在第二步骤（天5-6），将细胞重新悬浮于2×10 5个细胞/ ml和共培养的贴壁基质细胞（MS5）在新鲜红细胞生长培养基中只用Epo的补充。在第三步骤（天7-9），细胞是在一层的MS-5细胞在新鲜红细胞生长培养基的无细胞因子高达摘除术（ 图1A）中培养。
所有动物的协议已获的机构动物护理和使用委员会（IACUC）辛辛那提儿童医院医疗中心。
- 骨骼和低密度的骨髓细胞中分离的收获
- 加入2毫升含在一个15毫升锥形管2％胎牛血清（FBS）的无菌IMDM培养，并保持在冰上。
- 安乐死2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠（连同或不带基因靶向小鼠的利息）以下机构批准的协议（ 如 CO 2吸入，颈椎脱位）。
- 隔离骨盆骨，股骨，和两条腿的胫骨用钳和手术刀，将它们添加到含IMDM +2％FBS管并保持在冰上。
- 加入1 ml IMDM 2％FBS的使用镊子和结核菌素注射器用25克X穿过骨头5/8“针。冲洗IMDM 2％FBS的几次轻轻无菌流式细胞仪管和冲洗骨（通过吸〜500微升的细胞悬浮液，并通过骨再冲洗的话），并收集骨髓细胞进入流cytometrŸ管。法拉盛是完整的骨骼时显示为白色。
- 通过在50毫升锥形管的顶部有40微米的细胞过滤设置过滤细胞悬液。用IMDM 2％FBS中，并使用相同的培养基调整细胞悬浮液的最终体积至5ml洗细胞滤网。
- 通过密度梯度离心制备的低密度的骨髓细胞（LDBM）：仔细层5毫升细胞悬液上5毫升密度梯度分离细胞的培养基1.083在15-ml管中并旋转，在750×g离心25微克/毫升分钟，在室温（RT）与不加制动/低加速度。
- 转移上清液（一切高达约2毫升标记的15-ml的试管中，以获得血沉棕黄层）到一个新的15毫升管中并持续5分钟，在执行多一个洗涤用IMDM 2％FBS中于525×g离心RT。
- 吸出上清液，并通过悬浮颗粒在3ml红细胞裂解缓冲液中5分钟，在室温下溶解任何残留的红血细胞（RBC）。如果红细胞的更大的纯度是在（ 例如用于生化研究）的最后一步需要，进一步净化LDBM细胞这一步骤林负细胞磁分离。
- 体外红系分化培养协议，从LDBM或林NEG细胞开始（ 图1A）
- 加7毫升IMDM 2％FBS中，自旋在525×g离心5分钟，在室温下，重悬沉淀的细胞在2ml红细胞生长培养基（EGM），其中包括：
一个。 STEMPRO-34培养基中，含
湾2.6％STEMPRO-34中型补充，
角20％BIT-9500，
ð。 900毫微克/毫升的硫酸亚铁，
Ë。 90纳克/毫升的硝酸铁，
f。 100单位/ ml青霉素/链霉素，2mM的L-谷氨酰胺
克10 -6 M氢化可的松
小时。而新加入的细胞因子：
I）100毫微克/毫升的SCF，
ⅱ）5毫微克/毫升IL-3，并
ⅲ）3 IU / ml的促红细胞生成素。 - 使用自动细胞计数器或手动在显微镜使用下摆细胞计数ocytometer。
- 板在6孔细胞培养板中以5×10 5细胞/孔，以2.5毫升在EGM（2×10 5 LDBM细胞/ ml）的最终体积和孵育在37℃下的浓度（这被认为是如白昼＃文化0）。
- 通过吸1.5毫升上清液，纺纱在525×g离心5分钟，在室温下，再悬浮于1.5ml含有所有3种细胞因子和天＃2加回至孔中每天新鲜培养基更换培养基，3，4，以优化增生期。在第3天，取出所有的细胞，计数和分裂成井的适当数量，以维持的〜2×10 5细胞/ ml和细胞浓度。保持文化在37℃/ 5％的CO 2。
- 在第4天，板MS5细胞（小鼠基质细胞系），以一个新的细胞培养6孔板的孔中。该MS5细胞培养基α-MEM中含有20％FBS，100单位/ ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺。
- 第5天，数数细胞（现在在红细胞显著富集）在原始培养板用自动细胞计数器或手动在使用血细胞计数显微镜各孔中。
- 解除所有细胞从每个孔中，转移到15毫升锥形管，降速在525×g离心5分钟，在室温，吸出上清液，并溶解粒或仅含有促红细胞生成素（3单位/毫升）以2×10的浓度新鲜EGM 5细胞/ ml。
- 从其中的MS-5细胞的前一天（针对70-80％汇合在共培养时）镀和添加的类红细胞在这些井在EGM仅含有促红细胞生成素的孔中吸出上清液（虽然不是他们的介质的选择MS-5细胞存活以及在股东特别大会上数天）。
- 改变介质上的一天＃6加入新鲜的EPO。
- 在一天＃7更改介质，采用临时股东大会没有添加细胞因子。第7天到第9，测试样本为眼球摘除与流量具有抗TER119和祥发，16日及P后流式细胞仪roceed到染色样品的多光谱成像流式细胞术（如第3节详述）。
注意：电镀前和第2天，4，6，和文化7，流式细胞仪通过评估表面标志CD44和TER119与尺寸（FSC）监测培养细胞为红细胞富集和分化与流动9或者CD71，TER119，和FSC也可以用10，11。
- 加7毫升IMDM 2％FBS中，自旋在525×g离心5分钟，在室温下，重悬沉淀的细胞在2ml红细胞生长培养基（EGM），其中包括：
2，快速摘除术含量，据Yoshida 等人描述的协议。12与修改（图1B）
- 应激诱导红细胞生成和间质细胞制备方法在体外培养红细胞生成
- 每麻醉IACUC准则2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠（ 如异氟醚溶液）。确保鼠标已充分通过检查无反射性反应，以温和的后腿爪子捏和麻醉在手术过程中经常呼吸。使用上的眼睛兽医眼药膏，以防止干燥时在麻醉下。
- 通过尾部出血的500微升的最终体积诱发应激红细胞生成。使用胰岛素注射器，注射生理盐水等体积腹腔注射，以保证动物的液体复苏（保持在头低脚高位动物注射前和注射于下腹部，以免损伤内脏）。
- 请勿将鼠标无人值守，直到它重新获得电机控制的动物开始走动笼，并能够站立和行走没有掉下来表示。该phlebotomized鼠标放置在笼中没有其他小鼠。
- 术后第2天，板MS-5细胞在24孔细胞培养板的孔。孵育MS-5细胞在37℃/ 5％CO 2中MS5细胞培养基（含有20％FBS的α-MEM，100单位/ ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺），其目的是为70-80 ％铺满我48小时在n板孔。
- 脾和脾细胞处理的收获
- 应力诱导红细胞生成四天（96小时）后，通过安乐死IACUC批准的协议（ 如 CO 2吸入颈椎脱位）以前流血鼠标。
- 收获脾，把它放在一个15毫升的锥形管的IMDM含2％FBS和保持在冰上。
- 早在实验室里，在无菌条件下组织培养罩，反转含脾管上40微米的细胞过滤在50毫升管的顶部设置。用5毫升的塑料注射器的柱塞挤压脾。
- 用IMDM 2％FBS冲洗细胞过滤器，并使用相同的培养基，调整细胞悬浮液的最终体积至5ml。
- 仔细层上5毫升密度梯度分离细胞的5毫升脾细胞悬浮液介质1.083克/ ml的15毫升管中，自旋，在750×g下在室温下25分钟内，没有制动/低加速度。
- 转让上清液（溶液至约2毫升标记的15-ml的试管中，以获得血沉棕黄层）到一个新的15毫升管中，并执行多一个洗涤用IMDM 2％FBS中于525×g离心5分钟，在室温。
- 吸出上清液，并裂解红血细胞悬浮的沉淀物在3ml红细胞裂解缓冲液中5分钟，在RT。
- 加7毫升IMDM 2％FBS冲洗细胞，并稀释和中和RBC裂解缓冲液和旋在525×g离心5分钟，在4℃下
- 吸出上清液，并暂停沉淀的细胞在2毫升红细胞生长培养基（EGM）的。
- 孤立的低密度脾，富含红细胞，塑料（快速体外培养红细胞生成的第一阶段）文化
- 依靠自动细胞计数器或手动血球细胞。细胞中分离每脾在这个阶段的通常数量为〜15×10 6。
- 暂停细胞进一步在EGM含有细胞因子（在fINAL浓度）：SCF 50 ng / ml的IL-3 5毫微克/毫升，并生成素2单位/毫升。
- 板1-5×10 6个细胞在24孔细胞培养板的1毫升/井（同每孔取决于细胞总数数量的细胞）的最终体积，并培育O / N在37℃/ 5％的CO 2。
- 对MS5细胞红细胞（快速体外培养红细胞生成第二阶段的文化
- 从塑料以及抽吸上清液，并加入2毫升冷的10mM EDTA的PBS中5分钟，在冰上到每个孔中抬起细胞（高度浓缩的红细胞）。
- 把细胞在新管，在股东特别大会上洗一次（无细胞因子），并悬浮在相同的。
- 板5×10 5 -1×10 6个细胞在1-2毫升的量到各MS5细胞涂于24孔板中的井。如果药理抑制剂在实验中被使用，现在加上他们在适当的浓度。
- 孵育6〜8小时（时间由导游显微镜观察未处理的野生型样品中约30％-40％去核）的。红细胞的到MS-5细胞的结合加速其摘除术。
- 通过加入2ml冷PBS +的10mM的EDTA，5分钟，在冰上从每个孔中抬起细胞。随着红细胞，MS-5细胞也将被收集，但这些可以稍后在流式细胞仪分析FSC 喜 TER119轻易排除-细胞。
- 在这个阶段中，细胞可以是固定的和染色的由多光谱成像流式细胞仪分析。
3，红细胞的染色对细胞内蛋白质或脂筏的本地化过程中摘除由多光谱成像流式细胞仪
- 在PBS中洗涤细胞，旋转525×g离心5分钟，在RT和吸出上清液。
- 通过重悬细胞沉淀中加入500μl在PBS中的3.7％甲醛15分钟，固定细胞（取决于抗固定的时间可能会发生变化根被探测），并轻轻吹打。
- 转移到1.5毫升的塑料离心管中并孵育15分钟，在RT。
- 旋转的长凳上，离心2000×g离心20秒，吸出上清液，加入500微升PBS以每管和移液轻轻地执行一个洗。
- 旋转的长凳上，离心2000×g离心20秒，吸出上清液并保持在冰上管至少15分钟。 Permeablization步骤3.6-3.9应迅速和有效地完成，并在室温下旋转/抽吸，细胞沉淀应立即放回冰，为了使细胞更好地保持其完整性。
- 取丙酮溶液从-20°C冰箱装上冰水。在500微升冰冷的50％丙酮（1:1 DH 2 O）和移液轻轻重悬首细胞沉淀通透细胞。
- 旋上板凳离心2,000 xg下在500微升20秒，吸出上清，重悬细胞沉淀60，冰冷的100％丙酮轻轻吹打。
- 旋上板凳离心2000×g离心20秒，吸出上清，重悬细胞沉淀再一次在500微升冰冷的50％丙酮轻轻吹打。
- 旋上板凳离心2000×g离心20秒，吸出上清液，轻轻吹打在寒冷的FACS缓冲液（PBS +0.5％BSA）洗细胞一次。
- 准备贴标鸡尾酒抗体或标记感兴趣的分子：0.1 U/100微升AF488-鬼笔环肽对F-肌动蛋白染色和1μl/100微升TER119-PECy7为红系细胞染色。替代的或附加的染色，也可使用AF-488-抗β-微管蛋白抗体（1:50），AF-594标记的霍乱毒素B亚单位标记脂质筏（1:200），抗pMRLC（Ser19）做对于磷酸化肌球蛋白调节轻链（1:50），其次是抗兔AF-488标记的二抗（1:400）和抗-γ-徒步鞋初级抗体林初级兔抗体（1:100），接着加入抗兔AF-555标记的二抗（1:300）。
- 下面上清吸出，重悬细胞沉淀中加入100μl标记的鸡尾酒，吸管轻轻孵育在室温30分钟。
- 制备含核染色DRAQ5 2.5微米FACS缓冲液中。
- FACS缓冲液洗涤细胞，降速板凳上的离心2000×g离心20秒，吸出上清，重悬在含有DRAQ5 60微升FACS缓冲液中。
- 在摄像运行样品流式细胞仪收集每个实验至少10,000个事件，补偿的原始数据文件如先前公布的13，和如图2分析结果，使用分析软件特有的成像流式细胞仪。
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Representative Results
首先，电池是基于他们的明场长宽比（他们的未成年子女与他们的长轴长度之比）和明场区（指示其规模大小）进行分析。具有比20一个明视场角值的情况下和高于200事件大多是碎片和细胞聚集体，分别与被排除在分析（ 图2A）。单细胞（门“R1”），然后分析了基于他们对梯度RMS参数，它表示图像的锐度值。门“R2”是创建一个包含细胞与梯度RMS值超过了50 个百分位，以选择对焦（ 图2B），以及拍摄的图像。细胞，然后根据它们的大小门作为他们的明场区测量，并依TER119荧光染色平均像素参数测量他们的积极性的红标记TER119（门“TER119阳性”， 图2C）。细胞非常低或非常高TER119，要么非红细胞系或剩余的细胞聚集体，分别与被排除在分析之外。在接下来的步骤中，细胞根据它们的DRAQ5纵横比强度（轻微的相对于它们的细胞核的长轴强度之比）和DRAQ5（ 图2D）的强度选定。 DRAQ5阴性细胞（主要是去核细胞，如网织红细胞和红细胞），以及细胞具有低DRAQ5纵横比（主要是双峰）被排除在分析之外。 DRAQ5阳性细胞（栅极“DNA阳性”，主要是红细胞在这一点上），然后进行分析的基础上他们的TER119区域，这表明细胞的大小，并且他们的TER119平均数像素/区域（TER119表达的密度），这表明该亮度TER119染色。正色红细胞（门“OrthoE”）被认定为小，TER119 喜细胞（ 图2E）。最后，orthochro的亚群马蒂奇红细胞高度富集在去核细胞的特点是低明视宽高比，这是一种测定细胞伸长的，通过在明视场通道的细胞图像M01，并且通过高德尔塔质心的XY TER119的短轴/长轴的比值计算/ DRAQ5，这是由初始TER119 +网织红细胞和DRAQ5 +核（栅极如图2F“去核细胞”）的中心的中心之间的距离限定。
随着抗体抗TER119和DNA染色DRAQ5，细胞也被染色的丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）与荧光鬼笔环肽中幼红细胞眼球摘除7来评估F-肌动蛋白的定位。值得注意的是，去核的级数可以可视化在固定的细胞，如细 胞减少的纵横比（ 即逐渐拉长的）和增加增量质心的XY Ter119/Draq5被观察到（ 图由图3）。 F-肌动蛋白是观察集中在眼球摘除在分裂沟，然后消散，一旦核被挤压。此外，共定位的肌动蛋白和肌球蛋白在初期的网织红细胞和细胞核之间的卵裂沟可以通过后流式细胞共染色WT红细胞为pMRLC（磷酸化肌球蛋白调节轻链）和F-肌动蛋白7的多光谱成像流来证明。
其它蛋白质和感兴趣的结构也可与合适的抗体或荧光标记物染色以允许去核过程中的作用成像研究。偏振光微管形成可见于WT正色红细胞之前眼球摘除但不与秋水仙素（ 图4A）处理红细胞。微管蛋白聚合的秋水仙素的抑制作用减弱细胞极化，具体表现为测量CEN之间的参数三角形质心的XY BF/Draq5之三见于明视信道，取得与DRAQ5（ 图4B）的核染色的中央细胞体。
利用野生型或外消旋-缺陷（遗传或药理操纵后）红细胞在流式细胞仪演示Rac的GTP酶的去核的作用使成像研究多光谱成像流。外消旋GTP酶调节至少部分地形成的肌动球蛋白环，以及在初期的网织红细胞和pyrenocyte 7之间的沟脂筏的汇合处。
图1：以生产为研究去核红细胞中使用的红细胞在体外协议原理演示。 A.长期体外培养红细胞生成initiat教育署从LDBM或林-细胞B.由脾细胞高度富集红细胞应激诱导红细胞在体内被放血后开始快速眼球摘除法请点击这里查看该图的放大版本。
感兴趣的人群的图2。数据使用特定的成像流分析软件流式细胞仪分析。连续浇注显示在面板自动对焦。括号中的数字表示相应的母体的近似百分比，在该实验中，R1人口A.初始浇口去除细胞团块和细胞碎片。B.栅极R2出的R1包括已经清楚地成像的细胞，不含失焦的细胞。C. TER119阳性细胞（列R2中）被选中，不含细胞的，要么是阴性的TER119或者是过于强烈，因为他们在聚集存在染色。D. DNA阳性细胞（出TER119阳性细胞）被选中，密谋宽高比强度与核染色强度后（这里DRAQ5读通道5）。E.的DNA和TER119阳性细胞是基于在TER119平均数像素与TER119区域其位置选通到嗜碱，嗜多和正色红细胞（这里读入信道3），如先前由麦格拉思等 5所示。 F的去核细胞是那些细胞出了正色红细胞，具有低纵横比（细胞elongat的测量离子在明场（BF）信道）和高三角洲质心的XY Ter119/Draq5形成TER119 +网织红细胞和核中心的中心之间（距离）。这项研究最初发表于血型：Konstantinidis的DG，Pushkaran S， 等信号，并在去核红细胞血细胞骨架的要求。 2012，119（25）:6118-6127由美国血液学会请点击这里查看该图的放大版本。
图3。去核红细胞与逐步增加三角洲质心的XY Ter119/Draq5。WT鼠标正色红细胞，沾上TER119-PECy7，鬼笔环肽-AF488，和D 代表图像raq5，按他们的纵横比和增量质心的XY Ter119/Draq5门控。细胞被固定显示在眼球摘除的不同，连续的阶段，用对应于减小的纵横比，增加三角形心的XY Ter119/Draq5（黄色栅内绿十字表示成像在右侧的单元格的位置）的级数。在细胞图像从上到下，F-肌动蛋白可以眼球摘除集中在卵裂沟，然后消散，一旦核被挤压（如显示在单元格＃4782在较低的图像）中可以观察到。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
图4。形成一个单极微管装配和极化orthochroma的抽动红细胞先摘除术。 A.极性微管形成可见在对照WT红细胞（用抗-β-微管蛋白-AlexaFluor-488和核染色DRAQ5），而β-微管蛋白被漫染在6小时孵育秋水仙素（5μM）的红细胞在快速体外去核测定。1.2多光谱成像流式细胞仪可以通过参数德尔塔质心的XY BF/Draq5，其测量细胞体的中心之间的距离的分布的分析提供了细胞极化的定量评价在明场，取得了与DRAQ5（在嵌入示意图）核染色的中心看到。秋水仙素处理后野生正色红细胞三角洲重心BF/Draq5值在统计上比对照三角洲质心BF/Draq5值（P <0.001）显著不同。这项研究最初发表在布鲁D：。Konstantinidis的DG，Pushkaran S， 等信号，并在去核红细胞细胞骨架的要求血 。 2012，119（25）:6118-6127由美国血液学会请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
近年来红细胞去核的研究已经获得了越来越多的动力，因为它是在步骤在体外红细胞生成培养物是最困难的，以实现成功的，大规模生产的红血细胞在体外有效地重现。直到最近，红细胞去核的研究主要是利用荧光显微镜和流式细胞仪的方法。荧光显微镜的方法，虽然在确定参与分子有帮助的，需要显微镜观察，以确定一个小数目正色红细胞数百个细胞固定于在特定时间点内进行眼球摘除天。流式细胞术的方法，在另一方面，是在评价眼球摘除在培养的速率，以及药物或基因操纵特定分子的这个过程的影响非常有帮助的，但不能提供对intracellul任何数据这些分子的芳定位。
多光谱成像流式细胞仪结合流式细胞术和免疫荧光显微术的优点，因为它允许快速采集两流式细胞仪和数千个细胞的形态学数据。这是一个显著的优势与传统流式细胞仪红细胞生成研究，因为红细胞分化的不同阶段（proerythroblasts，嗜碱性，嗜多染红，并正色）一直在使用形态学标准6定义。然而，多光谱成像流式细胞仪是最佳的蜂窝结构，而不是在人口数量相对定量比较的可视化。对于这样的比较，常规流式细胞术，不需要用于胞内结构的免疫所必需的透化步骤执行得更好。例如BasoE的相对百分比：主体的多：OrthoE 图2E中
成像数据可与流式细胞术数据关联使用特定的成像流式细胞仪的分析软件，使细胞与门中的特定形态特征的集合来处理。约百去核细胞可内为10,000红细胞具有在快速和有效的方式7以上所述的分析方法的人口被识别，从而允许更多有意义的观察和统计评估。
此外，图像处理变得容易与特定的成像流分析仪软件允许这样的特性作为德尔塔质心的XY定量分析， 例如细胞核的相对位置通过学习这可以被用作偏振的测量细胞质中。
协议和故障排除中的关键步骤
这是众所周知的，即使是温和移液可能导致网织红细胞和pyrenocyte 12的分离。这有可能严重地限制了成像眼球摘除事件的数目。因此，必须小心，起重红细胞结合到MS5细胞在培养时尤为如此。
固定用甲醛溶液可引起改动的下降导致特异性抗体结合和/或增加的非特异性抗体结合的表面标志物的细胞外区域。成像流程的一个优点仪是表面染色可视化，其质量可以这样进行评估。而不是统一的点缀，染色丰富的表面标志物，如TER119表示overfixation，应通过降低formalde的组合来解决海德浓度和固定持续时间较短。
下面固定，冰上保持细胞至少15分钟是至关重要的，以便在通透过程中，以防止多余的细胞破损由于温度的差异。虽然丙酮通透性保持脆弱晚期红细胞系比洗涤剂介导的透化更好，其中100％丙酮是必需的步骤会导致明显的，但不是有害的，损失的细胞。在结束时，用冷FACS缓冲液洗涤后，将细胞在室温下的抗孵育步骤。
成像流式细胞仪具有流量的设定速率（细胞/秒），这取决于所使用的透镜（速率降低的放大率增加）。以下测量之前最后一次洗涤时，建议该细胞沉淀重新悬浮于小体积（50〜60微升），以加速样品的处理。对于大量的重采样QUIRE运行时间长（超过30分钟），样品应保持在冰上。
本公司长期眼球摘除法提供了一个扩展的类红细胞的生产效益，以产生足够的细胞，它可以在眼球摘除阶段收集像免疫生化评估和下拉功能。快速摘除术测定法给出的时间，只需要2天，进行了益处，虽然鼠标需要在实验前4天进行phlebotomized。我们并没有观察到这两种方法之间眼球摘除效率有显著差异。值得注意的是，流式细胞术评价，它不需要必需的胞内结构的免疫荧光透化步骤，如7之前描述的，最适合的去核效率的定量评价。
该技术的局限性
该方法描述在这里UTIlizes诱导应力红细胞在体内和培养在含有为了扩增类红细胞群体和他们在去核的阶段同步氢化可的松在体外培养基中。这两个条件可能模仿在压力下红细胞，眼球摘除。另外，氢化可的松显著增加红细胞产量和存活率。要获得类似的收益率从起源于野生型小鼠与稳态红细胞生成和培养无氢化可的松（从而避免同步）的骨髓细胞去核的事件，我们需要培养细胞从多个鼠标和运行，并通过多处理更大量的事件光谱成像流式细胞仪。虽然多光谱成像流使用放大倍率透镜高达60倍的加速仪极大相比，免疫荧光显微镜采集的形态学数据，通过成像所获得的观察结果的比较，与经典的Z堆叠仪流动，和共聚焦显微镜图像是有价值的，得到更好的细节，因为在物镜的显微镜可以提供放大倍数高达100倍和Z堆叠图像得到的结构的三维印象，这是无法实现的通过成像流式细胞仪在同一细胞。相对高数量收集在流式细胞术实验中的多光谱成像流类似的细胞，在一个随机的方向，部分地补偿这种限制，允许从不同的视点观察。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
致谢研究流式细胞仪核心在辛辛那提儿童医院研究基金会和理查德德马科，Sherree朋友，和斯科特末底改从Amnis公司（EMD Milllipore的一部分）的专家技术支持。这项工作是由美国国立卫生研究院赞助授予K08HL088126和R01HL116352（TAK）和P30 DK090971（YZ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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