Summary
Den foreliggende protokoll beskriver en ny fremgangsmåte for identifisering av en populasjon av enucleating ortokromatiske erytroblaster ved multispektral avbildning flowcytometri, som gir en visualisering av erytroblast enucleation prosessen.
Abstract
Erytropoese i pattedyr avsluttes med den dramatiske prosessen enucleation som resulterer i retikulocytt-formasjon. Mekanismen enucleation har ennå ikke fullstendig klarlagt. Et vanlig problem som oppstår når man studerer lokalisering av nøkkelproteiner og strukturer innenfor enucleating erytroblaster ved mikroskopi er vanskeligheten med å overholde et tilstrekkelig antall celler som gjennomgår enucleation. Vi har utviklet en ny analyse protokollen ved hjelp av multiparameter høyhastighets celle bildebehandling i flyt (Multi-Spectral Imaging flowcytometri), en metode som kombinerer immunofluorescent mikroskopi med flowcytometri, for å identifisere effektivt et betydelig antall enucleating hendelser, som gjør det mulig å å foreta målinger og utføre statistisk analyse.
Vi først beskrive her to in vitro erytropoiese kultur metoder som brukes for å synkronisere murine erytroblaster og øke sannsynligheten for å fange enucleation på the tid for evaluering. Deretter vi beskriver i detalj farging av erytroblaster etter fiksering og permeabilization for å studere lokalisering av intracellulære proteiner eller lipid flåter under enucleation ved multispektral avbildning strømningscytometri. Sammen med størrelse og DNA/Ter119 flekker som brukes til å identifisere de ortokromatiske erytroblaster, vi utnytter de parameterne "aspect ratio" på en celle i den lyse-feltet kanal som hjelpemidler i erkjennelsen av langstrakte celler og "delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5 "som gjør det mulig å identifisere cellulære hendelser der sentrum av Ter119 farging (begynnende retikulocytt) ligger langt fra hverandre fra midten av Draq5 farging (nucleus gjennomgår ekstrudering), noe som indikerer en celle om å enucleate. Undergruppe av den ortokromatiske erytroblast befolkning med høy delta Tyngdepunktet og lav sideforhold er høyanriket i enucleating celler.
Introduction
Terminal differensiering innen erythroid avstamning i pattedyr konkluderer med den dramatiske prosessen med enucleation, gjennom hvilket ortokromatiske erytroblast expels sin membran-innkapslet nucleus (pyrenocyte) 1, genererer retikulocytter to. Den nøyaktige mekanisme for denne prosess, som også er det hastighetsbegrensende trinn i vellykket, i stor skala, produksjonen av røde blodceller in vitro, er ennå ikke helt klarlagt. Lokalisering av viktige proteiner og strukturer innenfor enucleating erytroblaster er avhengig av bruk av fluoriserende og elektronmikroskopi 3-5. Denne langtekkelig prosess vanligvis resulterer i identifisering av et begrenset antall enucleation hendelser og ikke tillater alltid menings statistisk analyse. Utvidelse på en metode for erytroblast identifikasjon beskrevet tidligere av McGrath et al. 6, har vi utviklet en ny tilnærming for å identifisere og studere enucleation hendelser av Multi-Spectral ImaGing flowcytometri (multiparameter høyhastighets celle bildebehandling i flyt, en metode som kombinerer fluorescerende mikroskopi med flowcytometri) 7, som kan gi et tilstrekkelig antall observasjoner til å foreta målinger og utføre statistisk analyse.
Her beskriver vi første to in vitro erytropoiese kultur metoder som benyttes for å synkronisere erytroblaster, og øker sannsynligheten for å fange enucleation ved tidspunktet for evaluering. Da vi beskriver i detalj farging av erytroblaster etter fiksering og permeabilization for å studere lokalisering av intracellulære proteiner eller lipid flåter under enucleation ved multispektral avbildning strømningscytometri.
Prøvene blir drevet på en bilde flowcytometer og de innsamlede cellene er gated hensiktsmessig å identifisere ortokromatiske erytroblaster seks. Ortokromatiske erytroblaster blir deretter analysert basert på deres størrelsesforhold, som målt i lysfelt imaging, mot deres verdi for parameteren delta sentroide XY Ter119-DNA, som er definert som avstanden mellom sentrene av de områdene farget for Ter119 og DNA, henholdsvis. Befolkningen i celler med lav sideforhold og høy deltaet Tyngdepunktet XY Ter119/DNA er høyanriket i enucleating celler. Ved hjelp av wild-type (WT) erytroblaster versus erytroblaster med Mx-Cre mediert betinget sletting av Rac1 på Rac2 - / - eller kombinert Rac2 - / -; Rac3 - / - genetisk bakgrunn, og denne nye analyse protokoll for multispektral avbildning flowcytometri, vi nylig demonstrert at enucleation ligner asymmetrisk cytokinese og at dannelsen av en actomyosin ring reguleres delvis av Rac GTPases er viktig for enucleation progresjon 7..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Langsiktig In vitro Erytropoese Culture (Ex vivo erythroid Differensiering Kultur Protocol etter Giarratana et al. 8, endret og tilrettelagt for Mus Cells)
Dette er en 3-trinns langsiktig in vitro erytropoese protokollen. I det første trinnet (dager 0-4) 2 x 10 5 celler / ml er plassert i erytroblast vekstmedium supplert med stamcellefaktor (SCF), interleukin-3 (IL-3), erytropoietin (EPO). I det andre trinnet (5-6 dager), blir cellene resuspendert til 2 x 10 5 celler / ml, og ko-dyrket på heftende stroma-celler (MS5) i friskt erytroblast vekstmedium supplert bare med Epo. I det tredje trinn (dager 7-9), cellene dyrkes på et lag av MS-5 cellene i friskt dyrkningsmedium uten erytroblast cytokiner inntil enucleation (figur 1A).
Alle dyre protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) avCincinnati Children Hospital Medical Center.
- Innhøsting av bein og isolering av lav tetthet benmargceller
- Tilsett 2 ml sterilt IMDM inneholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) i en 15 ml konisk rør og holde på is.
- Avlive en 2-6 måneder gamle villtype C57/BL6 mus (sammen med eller uten genetisk målrettede mus av interesse) etter institusjons godkjent protokoll (f.eks CO 2 innånding, etterfulgt ved halshugging).
- Isolere bekken bein, lårben, og tibiae av begge beina ved hjelp av pinsett og skalpell, legge dem til røret som inneholder IMDM 2% FBS og holde på is.
- Tilsett 1 ml IMDM 2% FBS i et sterilt flow-cytometri tube og strakt bein ved hjelp av pinsett og en tuberkulintest sprøyte med en 25-G x 5/8 "nål. Flush IMDM 2% FBS gjennom bein et par ganger forsiktig ( ved å aspirere ~ 500 mL fra cellen suspensjon og skylle det igjen gjennom beinet), og samle benmargceller inn i flyten-cytometry tube. Flushing er fullført når bein vises hvit.
- Filter celle-suspensjonen gjennom en 40-mikrometer celle sil sett på toppen av en 50 ml konisk rør. Vask celle sil med IMDM 2% FBS og med samme medium justere sluttvolumet av cellesuspensjonen til 5 ml.
- Forbered low-density benmargceller (LDBM) etter tettshetsgradient sentrifuge: nøye lag de fem ml av cellesuspensjonen på 5 ml tettshetsgradient celleseparering medium 1,083 g / ml i en 15-ml tube og spinn ved 750 xg for 25 min ved romtemperatur (RT) med ingen brems / lav akselerasjon.
- Transfer supernatant (alt opp til om to-ml-merket på 15-ml tube for å tilegne seg buffycoat) til en ny 15-ml tube og utføre en mer vask med IMDM 2% FBS ved 525 xg i 5 min ved RT.
- Aspirer supernatanten og lyserer de gjenværende røde blodceller (RBC) ved å suspendere pelleten i 3 ml RBC lysis buffer i 5 min ved RT. Hvis en større renhet erytroblaster erkreves ved det siste trinnet (f.eks for biokjemiske studier), rense LDBM cellene videre på dette trinnet til Lin neg celler ved magnetisk separasjon.
- Ex vivo erythroid differensiering kultur protokollen starter fra LDBM eller Lin neg celler (figur 1A)
- Legg 7 ml IMDM 2% FBS, sentrifugering ved 525 xg i 5 min ved RT og resuspender pelleterte celler i 2 ml erytroblast vekstmedium (EGM), bestående av:
en. StemPro-34 medium, som inneholder
b. 2,6% StemPro-34 medium supplement,
c. 20% BIT-9500,
d.. 900 ng / ml jern sulfat,
e. 90 ng / ml ferri-nitrat,
f. 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin
g. 10 -6 M hydrokortison
h. og nystekte lagt cytokiner:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml IL-3, og
iii) 3 IE / ml Epo. - Telle celler ved hjelp av en automatisk celleteller eller manuelt på et mikroskop ved hjelp av en hemocytometer.
- Plate i en 6-brønners celle-kulturplate i en konsentrasjon på 5 x 10 5 celler / brønn i et sluttvolum på 2,5 ml i EGM (2 x 10 5 LDBM celler / ml) og inkuberes ved 37 ° C (dette er ansett som dag # 0 av kultur).
- Skift medium ved å aspirere 1,5 ml av supernatanten, spinning ved 525 xg i 5 min ved RT, resuspendere i 1,5 ml friskt medium inneholdende alle tre cytokiner og tilsette tilbake til brønnene hver dag på dagene 2, 3, 4, for å optimalisere proliferativ fase. På dag 3, fjerne alle celler, telle og delt inn i passende antall brønner for å opprettholde brønncellekonsentrasjonen av ~ 2 x 10 5 celler / ml. Oppretthold kultur ved 37 ° C / 5% CO2.
- På dag 4, plate MS5 celler (murin stromal cellelinje) til brønner i en ny celle-kultur 6-brønns plate. Den MS5 celle-kulturmedium blir α-MEM inneholdende 20% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
- På dag fem, telle antallceller (nå vesentlig anriket på erytroblaster) i hver brønn av det opprinnelige kultur-plate ved hjelp av en automatisk celleteller, eller manuelt ved et mikroskop ved bruk av et hemocytometer.
- Løft alle cellene fra hver brønn og overført til 15 ml koniske rør, spinne ned ved 525 xg i 5 min ved RT, supernatanten aspireres og oppløse pellets med frisk EGF som bare inneholder Epo (3 IU / ml) til en konsentrasjon på 2 x 10 5 celler / ml.
- Aspirer supernatanten fra brønnene, hvor MS-5-celler ble belagt forrige dag (målrettet til 70-80% konfluens ved ko-kultur) og legge erytroide celler i disse brønnene i EGM som bare inneholder Epo (men ikke deres mediet valg, MS-5 celler overlever godt i EGM i flere dager).
- Endre medium legge nytt EPO på dag nr. 6.
- Endre medium på dag nr. 7, ved hjelp av EGM uten tilsatt cytokiner. På dager 7 til 9, testprøver for enucleation med flowcytometri etter farging med anti-Ter119 og Syto-16 daglig og proceed Flekk prøver for Multi-Spectral Imaging flowcytometri (som beskrevet i kapittel 3).
Merk:. Før plating og på dag 2, 4, 6, og 7 av kultur, overvåke dyrkede celler for erytroblast berikelse og differensiering med flowcytometri ved å vurdere overflate markører CD44 og Ter119 vs størrelse (FSC) 9 Alternativt CD71, Ter119, og FSC kan også brukes 10, 11.
- Legg 7 ml IMDM 2% FBS, sentrifugering ved 525 xg i 5 min ved RT og resuspender pelleterte celler i 2 ml erytroblast vekstmedium (EGM), bestående av:
2. Fast Enukleasjon analysen, ifølge protokollen Beskrevet av Yoshida et al. 12 med modifikasjoner (Figur 1B)
- Stress erythropoiesis induksjon og stroma celleforberedelsen for in vitro erythropoiesis kultur
- Anesthetize en 2-6 måneder gamle villtype C57/BL6 mus per IACUC retningslinjer (f.eks med isofluran løsning). Sørg for at musen er tilstrekkelig bedøvet ved å sjekke for fravær av refleksive responser på en skånsom hind-labben klype og forvanlige respirations under prosedyren. Bruk dyrlege ophthalmic salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Forårsake stress erythropoiesis via halen blødning til et sluttvolum på 500 mL. Ved hjelp av en insulinsprøyte, injisere tilsvarende volum av fysiologisk saltvann intraperitonealt å sikre væske gjenoppliving av dyret (hold dyret i Trendelenburg posisjon før sprøytebruk og i nedre del av magen for ikke å skade indre organer).
- Ikke la musen ubetjent før det har gjenvunnet motorisk kontroll som indikert av dyret begynner å bevege seg rundt i buret og være i stand til å stå og gå uten å falle. Den phlebotomized mus blir plassert i et bur uten andre mus.
- Etter 2 dager, plate MS-5 celler i brønner på en 24-brønners celle-kulturplaten. Inkuber MS-5-celler ved 37 ° C / 5% CO2 i MS5 cellemedium (a-MEM inneholdende 20% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, og 2 mM L-glutamin) som med målet være 70-80 % konfluent jegn plate brønner etter 48 hr.
- Høsting av milt og behandling av splenocytter
- Fire dager (96 timer) etter at stresset erythropoiesis induksjon, avlive tidligere blødd musen gjennom IACUC-godkjent protokoll (f.eks CO 2 innånding fulgt ved halshugging).
- Innhøstingen milt og legg den i en 15-ml konisk rør som inneholder IMDM 2% FBS og holde på is.
- Tilbake i laboratoriet, i vevskultur hetten under sterile betingelser, inverterer milt-inneholdende rør på en 40-mikrometer celle sil satt på toppen av en 50 ml-rør. Knus milt ved hjelp av stempelet i en 5 ml plastsprøyte.
- Vask celle sil med IMDM 2% FBS og med samme medium, justere det endelige volum av cellesuspensjon til 5 ml.
- Lag forsiktig 5 ml splenocytt suspensjon på 5 ml tettshetsgradient celleseparering medium 1,083 g / ml i en 15-ml tube og spinn ved 750 xg i 25 min ved RT uten brems / lav akselerasjon.
- Transfersupernatanten (løsning ned til om to-ml merket av 15-ml tube for å tilegne seg buffycoat) til en ny 15-ml tube og utføre en mer vask med IMDM 2% FBS ved 525 xg i 5 min ved RT .
- Aspirer supernatanten og lyse røde blodceller ved å suspendere pelleten i 3 ml RBC lysis buffer i 5 min ved RT.
- Legg 7 ml IMDM 2% FBS for å vaske cellene og for å fortynne og nøytralisere RBC lysis buffer og sentrifugering ved 525 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten og suspen pelleted celler i 2 ml av erytroblast vekstmedium (EGM).
- Kultur av de isolerte lav tetthet splenocytes, beriket i erytroblaster, på plast (første stadium av rask in vitro erythropoiesis kultur)
- Telle celler på en automatisert celleteller eller manuelt av en hemocytometer. Vanlig antall celler isolert per milt på dette stadiet er ~ 15 x 10 6.
- Suspendere cellene videre i EGM inneholder cytokiner (på fINAL konsentrasjoner): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, og Epo 2 U / ml.
- Plate 1-5 x 10 6 celler i et sluttvolum på 1 ml / brønn (samme antall celler per brønn, avhengig av totalt antall celler) i en 24-brønners celle-kulturplaten og inkuber O / N ved 37 ° C / 5% CO 2.
- Culture of erytroblaster på MS5 celler (andre fase av rask in vitro erythropoiesis kultur
- Aspirer supernatant fra plasten godt og løfte celler (høyanriket i erytroblaster) ved å tilsette 2 ml kald 10 mM EDTA i PBS i 5 minutter, på is i hver brønn.
- Sett celler i friske rør, vaske en gang i EGM (uten cytokiner) og resuspender i det samme.
- Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 celler i et volum på 1-2 ml til hver MS5 celle-belagt brønn av en 24-brønns plate. Ved farmakologiske inhibitorer blir brukt i forsøket, legge dem i passende konsentrasjoner nå.
- Inkuber i 6-8 timer (tid styrt avmikroskopisk observasjon av ca 30% -40% enucleation i ubehandlet WT utvalget). Bindingen av erytroblaster til MS-5 celler akselererer deres enucleation.
- Løft cellene fra hver brønn ved å tilsette 2 ml kald PBS + 10 mM EDTA, i 5 minutter, på is. Sammen med de erytroblaster, vil MS-5 celler også bli samlet inn, men disse kan senere være lett ekskludert under flowcytometrisk analyse som FSC hi Ter119 - celler.
- På dette stadiet, kan cellene være fast og farget for analyse av Multi-Spectral Imaging flowcytometri.
Tre. Farging av erytroblaster for lokalisering av intracellulære proteiner eller lipid flåter Under Enukleasjon av Multi-spektral Imaging flowcytometrisystemer
- Vask cellene i PBS, spinne 525 xg i 5 min ved RT og aspirer supernatant.
- Fiks celler ved resuspendering av cellen pellets i 500 mL av 3,7% formaldehyd i PBS i 15 min (fiksering Tiden kan variere avhengig av antigen som probes) og pipettering forsiktig.
- Overføring til 1,5 ml plast sentrifugerør og inkuberes i 15 min ved RT.
- Spin på en benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og utføre en vask ved å legge til 500 mL PBS til hvert rør og pipettering forsiktig.
- Spinne på en benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og holde rørene på is i minst 15 min. Permeablization trinn 03.06 til 03.09 bør gjøres raskt og effektivt, og følgende spinne / aspirasjon ved RT, bør celle pellets umiddelbart settes tilbake på isen, for at cellene å bedre beholde sin integritet.
- Ta acetonoppløsninger ut fra -20 ° C fryseren og satt på is. Permeabilize celler ved å oppslemme cellepelletene først i 500 ul iskald 50% aceton (01:01 med dH 2 O) og forsiktig pipettering.
- Spin på benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og resuspender celle pellets i 500 mL60; iskald 100% aceton ved å pipettere forsiktig.
- Spin på benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og resuspender celle pellets en gang mer i 500 mL iskald 50% aceton ved å pipettere forsiktig.
- Spin på benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og vask cellene en gang i kaldt FACS buffer (PBS + 0,5% BSA) ved å pipettere forsiktig.
- Forbered merking cocktail med antistoffer eller markører for molekyler av interesse: 0,1 U/100 mL AF488-phalloidin for F-aktin flekker og en μl/100 mL Ter119-PECy7 for erythroid cellefarging. Alternative eller ytterligere flekker kan også gjøres ved hjelp av AF-488-anti-β-tubulin antistoff (01:50), AF-594-konjugert koleratoksin subenhet B å merke lipid flåter (1:200), anti-pMRLC (Ser19) primære antistoff for fosforylert myosin lett kjede regulerings (01:50), etterfulgt av anti-kanin AF-488-konjugert sekundært antistoff (1:400), og anti-γ-tubulin primært kanin-antistoff (1:100) etterfulgt av kanin anti-AF-555-konjugert sekundært antistoff (1:300).
- Etter aspirasjon supernatanten, resuspender cellepelletene i 100 pl av den markør cocktail, pipetteres forsiktig og inkuber i 30 min ved RT.
- Forbered FACS buffer som inneholder 2,5 mikrometer av atom flekken Draq5.
- Vask cellene i FACS buffer, spinne ned på benk mikro 2000 xg for 20 sek, aspirer supernatanten og resuspender i 60 mL FACS buffer som inneholder Draq5.
- Kjøre prøvene på bilde strømningscytometer for å samle minst 10.000 hendelser per eksperiment, kompenserer de rå datafiler som tidligere publisert 13, og analysere resultatene som vist i figur 2, ved hjelp av analyse-programvare er spesifikk for avbildning flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først blir cellene analysert basert på deres Lysfelt sideforhold (forholdet mellom lengden av deres mindre versus sin hovedakse) og deres Lysfelt området (som indikerer størrelsen). Hendelser med en Lysfelt Area-verdi lavere enn 20 og høyere enn 200 er det meste rusk og celleaggregater, henholdsvis, og er ekskludert fra analysen (Figur 2A). Enkeltceller (gate "R1") er deretter analysert basert på deres verdi for Gradient RMS parameter, noe som indikerer skarphet i bildet. Gate "R2" er opprettet som inneholder celler med Gradient RMS verdi mer enn de 50 persentilen for å velge bildene tatt godt i fokus (figur 2B). Celler blir deretter gated basert på deres størrelse som målt ved deres Lysfelt område, og deres positivitet for erythroid markør Ter119 målt ved Ter119 fluorescerende flekk-Mean Pixel parameter (gate "Ter119 positive", Figur 2C). Celler svært lave eller svært høye for Ter119, er enten ikke-erythroids eller gjenværende celle aggregater, henholdsvis, og er ekskludert fra analysen. I det neste trinnet, er celler valgt basert på deres Draq5 sideforhold Intensitet (forholdet mellom den mindre versus den store aksen intensiteten av sin kjerne), og intensiteten av Draq5 (figur 2D). Draq5 negative celler (for det meste utskrapte celler, for eksempel retikulocytter og RBC), og celler med en lav Draq5 Aspect Ratio (for det meste dubletter) er ekskludert fra analysen. Draq5 positive celler (gate "DNA-positive", for det meste erytroblaster på dette tidspunkt) blir deretter analysert basert på deres Ter119 område, noe som indikerer størrelsen av cellen, og deres Ter119 Mean Pixel / området (densitet Ter119 uttrykk), noe som indikerer lysstyrken Ter119 farging. Ortokromatiske erytroblaster (gate "OrthoE") er anerkjent som små, Ter119 hi celler (Figur 2E). Til slutt, en undergruppe av orthochromatic erytroblaster høyanriket i enucleating celler er preget av lav Lysfelt Aspect Ratio, som er en måling av celleforlengelse, beregnet ved forholdet mellom akse / hovedakse av cellen bildet i Lysfelt kanalen M01, og ved høy Delta Tyngdepunktet XY Ter119 / Draq5, som er definert ved avstanden mellom midten av det begynnende Ter119 +-retikulocytt og sentrum av den Draq5 +-kjerne (gate "enucleating celler" i figur 2F).
Sammen med antistoff mot Ter119 og DNA-flekken Draq5, har cellene også blitt farget for trådformede aktin (F-aktin) med fluorescerende phalloidin å evaluere lokalisering av F-aktin under erytroblast enucleation 7.. Av notatet, kan en progresjon av enucleation bli visualisert i faste celler, som celler med en fallende sideforhold (dvs. stadig mer langstrakt) og øke delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5 er observert (figure 3). F-aktin er observert til å konsentrere seg ved spalting fure under enucleation og deretter forsvinne når kjernen ekstruderes. Videre kan samlokalisering av aktin og myosin på cleavage fure mellom begynnende retikulocytter og nucleus bli demonstrert av multi-spektral avbildning flowcytometri etter co-farging av WT erytroblaster for pMRLC (fosforylert myosin regulatoriske lett kjede) og F-aktin 7.
Andre proteiner og strukturer av interesse kan også være farget med aktuelle antistoffer eller fluorescerende markører for å tillate imaging studier av deres rolle under enucleation. Polarisert microtubule formasjonen er synlig i WT ortokromatiske erytroblaster før enucleation men ikke i erytroblaster behandlet med kolkisin (Figur 4A). Inhibering av tubulin polymerisering av kolkisin avtar cellepolarisering, som demonstrert ved måling av parameteren delta sentroide XY BF/Draq5 mellom center av cellekroppen sett i Lysfelt kanal og midten av nukleær farging som oppnås med Draq5 (figur 4B).
Utnytte WT eller Rac-mangelfull (etter genetisk eller farmakologisk manipulasjon) erytroblaster i multi-spektral avbildning flowcytometri tillatt imaging studier som viser hvilken rolle Rac GTPases i enucleation. Rac GTPases regulere minst delvis dannelsen av en actomyosin ring samt samløpet av lipid flåter i furen mellom begynnende retikulocytter og pyrenocyte 7.
Figur 1. Skjematisk demonstrasjon av erytropoiese in vitro protokollene som brukes for å produsere enucleating erytroblaster for studier. A. Long-term in vitro erythropoiesis kultur initiated fra LDBM eller Lin -.. celler B. Rask enucleation analysen initiert av splenocytes høyanriket i erytroblaster etter stresset erythropoiesis induksjon in vivo ved blodprøvetaking Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Analyse av data utnytte analyse programvare spesifikt for bildebehandling flowcytometer. Følgende gating av bestandene av renter vises i paneler AF. Tallet i parentes indikerer den omtrentlige prosent av den tilsvarende moder befolkning, i dette eksperimentet. A. Innledende gating av R1 populasjon fjerner celleaggregaterog celle-debris. B. Gate R2 av R1 omfatter celler som har blitt fotografert klart, unntatt ute av fokus celler. C. Ter119-positive celler (av R2) er valgt, med unntak av celler som enten er negative for Ter119 eller er for intenst farget på grunn av deres tilstedeværelse i aggregater. er D. DNA-positive celler (av Ter119-positive celler) valgt, etter plotting for Aspect Ratio Intensitet versus intensitet av den kjernefysiske flekken (her Draq5 lese i kanal 5). E. DNA-og Ter119-positive cellene er gated inn basofilt, polychromatophilic og ortokromatiske erytroblaster basert på deres plassering i Ter119 Mean Pixel versus Ter119 området (her lest i kanal 3), som vist tidligere av McGrath et al fem. F. enucleating celler er disse cellene ut av ortokromatiske erytroblaster, som har lavt sideforhold (en måling av celle avlangeion i lysfelt (BF) kanal) og høy Delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5 (avstand mellom senter av forming Ter119 +-retikulocytter og sentrum av kjernen). Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Blood: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al signale og cytoskeletal krav i erytroblast enucleation Blood... 2012;. 119 (25) :6118-6127 av American Society of Hematology Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative bilder av enucleating erytroblaster med gradvis økende Delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5. WT mus ortokromatiske erytroblaster, farget med Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, og Draq5, er gated per deres sideforhold og delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5. Cellene er vist festet på forskjellige, suksessive stadier av enucleation, med en progresjon som korresponderer med avtagende sideforhold og øker delta sentroide XY Ter119/Draq5 (grønn-kors i det gule porten viser plasseringen av cellen avbildes på høyre side). I cellebilder fra topp til bunn, kan F-aktin observeres under enucleation å konsentrere seg på cleavage fure og deretter forsvinne når kjernen er ekstrudert (som vist i celle # 4782 på nedre bilde). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Dannelse av en unipolar microtubule montering og polarisering av orthochromatic erytroblaster forut enucleation. A. Polarisert microtubule formasjonen er synlig i kontroll WT erytroblaster (farget med anti-b-tubulin-AlexaFluor-488 og den kjernefysiske flekken Draq5), mens b-tubulin er diffust beiset i erytroblaster ruges med kolkisin (5 mm) for 6-timers i den raske in vitro assay enucleation B. Multi spektral avbildning flowcytometri kan gi en kvantitativ evaluering av cellepolarisering ved analyse av distribusjonen av para Delta Tyngdepunktet XY BF/Draq5, som måler avstanden mellom sentrum av cellelegemet. som sett i lys-feltet, og sentrum av nukleær farging som oppnås med Draq5 (skjematisk fremstilling i innfelt). Delta Tyngdepunktet BF/Draq5 verdier av kolkisin-behandlet WT ortokromatiske erytroblaster er statistisk signifikant forskjellig enn kontrollgruppen Delta Tyngdepunktet BF/Draq5 verdier (p <0,001). Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Blood:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al signale og cytoskeletal krav i erytroblast enucleation Blood. 2012;. 119 (25) :6118-6127 av American Society of Hematology Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år studiet av erytroblast enucleation har fått økende moment siden det er trinnet i in vitro erytropoiese kulturer som er mest vanskelig å reprodusere en effektiv måte for å oppnå vellykket, stor-skala produksjon av røde blodceller ex vivo. Inntil nylig studiet av erytroblast enucleation utnyttes hovedsakelig fluorescens mikroskopi og flowcytometri metoder. Fluorescensmikroskopi metoder, enskjønt nyttig for å identifisere molekyler som deltar, krever dager med mikroskopisk observasjon for å identifisere et lite antall ortokromatiske erytroblaster som gjennomgår enucleation i hundrevis av celler fast på et bestemt tidspunkt. Strømningscytometri fremgangsmåter, på den annen side, er svært nyttig for å evaluere graden av enucleation i en kultur, i tillegg til effekten av farmakologisk eller genetisk manipulasjon av spesielle molekyler i denne prosessen, men gir ikke noen data på intracellular lokalisering av disse molekylene.
Multi-spektral avbildning flowcytometri kombinerer fordelene av flowcytometri og immunfluorescens mikros siden den tillater raske oppkjøp av både flowcytometrisk og morfologiske data om flere tusen celler. Dette er en betydelig fordel versus klassisk flowcytometri i erytropoiese studier, siden de forskjellige stadier av erytroblast differensiering (proerythroblasts, basofilt, polychromatophilic, og ortokromatiske) er definert ved hjelp av morfologiske kriterier seks. Imidlertid er multispektrale avbildning flowcytometri optimal for visualisering av cellulære strukturer heller enn relative kvantiteringsstandarder sammenligninger i befolkningen tall. For slike sammenligninger, rutine flow-cytometri som ikke krever permeabilization skritt nødvendig for immunfluorescens av intracellulære strukturer utfører bedre. For eksempel den relative prosentandel av BasoE: Polye: OrthoE i figur 2E
De bildedata kan bli behandlet i forbindelse med strømningscytometri ved å bruke dataanalyseprogramvare spesifikk for avbildning flowcytometer, slik at samlingen av celler med visse morfologiske egenskaper innenfor portene. Omtrent ett hundre enucleating celler kan bli identifisert innenfor en befolkning på 10 000 erytroblaster med den analysemetode som er beskrevet ovenfor på en rask og effektiv måte, 7, slik at mer meningsmålinger og statistisk evaluering.
Videre er bildeprosessering lettes med analyse-programvare er spesifikk for avbildning flowcytometer som tillater kvantitativ analyse av slike egenskaper som Delta Tyngdepunktet XY for å studere eksempel den relative stilling av kjernen for åcytoplasma som kan brukes som et mål for polarisering.
Kritiske trinnene i protokollen og feilsøking
Det er velkjent at selv mild pipettering kan resultere i separasjon av retikulocytter og pyrenocyte 12.. Dette har potensial til å sterkt begrense antallet enucleation hendelser avbildes. Som et resultat, må man være forsiktig, spesielt når du løfter erytroblaster bundet til MS5 celler i kultur.
Fiksering med formaldehyd-løsning kan føre til endringer i ekstracellulære regioner av overflatemarkører som resulterer i redusert spesifikk antistoffbinding, og / eller økt ikke-spesifikk antistoffbinding. En fordel med avbildnings strømningscytometer er at overflatefarging visualisert og dens kvalitet kan således evalueres. Prikket, i stedet for uniform, farging for rikelig overflate markører som Ter119 indikerer overfixation og bør håndteres gjennom en blanding av lavere formaldenydhyde konsentrasjon og kortere varighet av fiksering.
Etter fiksering, å holde cellene på is i minst 15 minutter er nødvendig for å hindre for stort cellebrudd under permeabilization prosess på grunn av temperaturforskjeller. Selv om aceton-permeabilization opprettholder de skjøre sene erythroids bedre enn vaskemiddel-mediert permeabilization, vil trinnet hvor 100% aceton kreves resultere i en merkbar, men ikke virke inn på, tap av celler. Ved slutten, etter en vask med kaldt FACS-buffer, blir cellene tillatt ved romtemperatur i de antistoff-ruge trinn.
Den bilde flowcytometer har et sett vannføring (celler / sek) avhengig av hvilket objektiv som brukes (rate er redusert som forstørrelsen øker). Etter siste vask før måling, er det anbefalt at cellepelletene resuspendert i et lite volum (50-60 pl), for å akselerere behandlingen av prøven. For et stort antall prøver som rekoret lang varighet av løp (over 30 min), bør prøvene holdes på is.
Den langsiktige enucleation analysen gir en fordel ved en utvidet erythroid celleproduksjon for å produsere nok celler som kan samles på enucleation scenen for biokjemisk evaluering som immunoblotting og pull-downs. Den raske enucleation analysen gir fordelen av tid som krever bare 2 dager for å utføre, selv om mus som må phlebotomized 4 dager før eksperimentet. Vi har ikke observert en signifikant forskjell i enucleation effektivitet mellom de to metodene. Til opplysning, flowcytometri evaluering, som ikke krever permeabilization trinn som er nødvendig for immunfluorescens av intracellulære strukturer, som beskrevet før 7, som er mest hensiktsmessig for kvantitativ evaluering av enucleation effektivitet.
Begrensninger av teknikken
Metoden som beskrives her utilizes indusert stresset erythropoiesis in vivo og kultur i medium som inneholder hydrokortison in vitro for å forsterke erythroide populasjoner og synkronisere dem på scenen for enucleation. Begge disse forholdene trolig imitere erytroblast-enucleation under stress. I tillegg, hydrokortison signifikant øker erythroid utbytte og overlevelse. For å få tilsvarende utbytte av enucleation hendelser fra benmargceller som stammer fra villtype mus med steady-state erythropoiesis og kultivert uten hydrokortison (derfor unngår synkronisering), ville vi trenger å dyrke celler fra flere mus og kjøre og behandle mange flere arrangementer gjennom Multi -Spectral Imaging flowcytometri. Selv om multi-spektral avbildning flowcytometri akselererer samling av morfologiske data umåtelig i forhold til immunfluorescens mikroskopi ved hjelp av forstørrelsesglass opp til 60x, sammenligning av observasjoner innhentet av bildebehandling flowcytometer med klassisk, Z-stack,og konfokalmikroskopi bilder er verdifullt for å oppnå bedre detalj, da objektivlinsen i et mikroskop kan gi forstørrelse opptil 100x og Z-stack-bilder gi et 3-dimensjonalt bilde av strukturer, som ikke er oppnåelig ved å tenke seg strømningscytometer i samme celle. Den relativt høye antall av lignende celler som samles i et multi-spektral avbildning flowcytometri eksperiment, ved en tilfeldig orientering, delvis kompenserer for denne begrensningen slik at observasjonene fra et annet syn-punkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Forsknings flowcytometrisystemer Kjerne ved Cincinnati Children Hospital Research Foundation og Richard Demarco, Sherree venn, og Scott Mordekai fra Amnis Corporation (del av EMD Milllipore) for ekspert teknisk support. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir K08HL088126 og R01HL116352 (TAK) og P30 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
