Summary
Drosophila larver er en attraktiv model for billeddannelse på grund af deres gennemskinnelige neglebånd og kraftfulde genetik. Denne protokol beskriver, hvordan at udnytte en enkelt-lags PDMS-enhed, kaldet 'larve chip' for levende billeddannelse af cellulære processer indenfor neuroner i 3. stadie Drosophila larver.
Abstract
Live-billeddannelse er en vigtig teknik for at studere celle biologiske processer, men det kan være udfordrende i levende dyr. Den gennemskinnelige neglebånd af Drosophila larve gør det til en attraktiv model organisme til levende billeddiagnostiske undersøgelser. En vigtig udfordring for levende billeddiagnostiske teknikker er imidlertid at noninvasively immobilisere og placere et dyr på mikroskopet. Denne protokol udgør en enkel og nem at bruge metoden til at immobilisere og billeddannelse Drosophila larver på en polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid enhed, som vi kalder den "larve chip". Larven chip består af en tætsiddende PDMS mikrokammer der er knyttet til en tynd dækglas, der ved anvendelse af et vakuum via en sprøjte, immoboliserer dyret og bringer ventrale strukturer såsom nerve ledning, segmenter nerver og krop væg muskler, inden for tæt på dækglasset. Dette giver mulighed for høj opløsning billeddannelse, og vigtigere, undgår anvendelsen af anesthetics og kemikalier, hvilket letter undersøgelse af en bred vifte af fysiologiske processer. Da larver let komme immobiliseringen, kan de let underkastes flere billedoptagelse. Dette giver mulighed for longitudinelle studier over tid kurser lige fra timer til dage. Denne protokol beskriver trin-for-trin, hvordan du forbereder chip og hvordan man udnytter chippen for levende billeddannelse af neuronale begivenheder i 3. instar larver. Disse hændelser omfatter den hurtige transport af organeller i axoner, calcium svar til skade, og time-lapse undersøgelser af handel med foto-konvertibelt proteiner over lange afstande og tidshorisonter. En anden anvendelse af chip er at studere regenerative og degenerative reaktioner på axonal skade, så den anden del af denne protokol beskriver en ny og enkel procedure for at skade axoner inden perifere nerver ved en segmental nerve crush.
Introduction
Bananfluen, Drosophila melanogaster, er blevet udnyttet som en model organisme i over 100 år, og har vist sig medvirkende til at definere grundlæggende signalering og udviklingsmæssige veje, der er bevaret fra hvirvelløse dyr til menneske. Live-billeddannelse er en vigtig tilgang til at studere cellulære mekanismer, og den simple krop plan og gennemskinnelige neglebånd af Drosophila larve gør det til et attraktivt system til billeddannelse, især da der er mange genetiske værktøjer til rådighed for at udtrykke fluorescens mærkede proteiner i bestemte celletyper.
En vigtig udfordring for levende billeddiagnostiske teknikker er at noninvasively immobilisere og placere et dyr til mikroskopi. Konventionelle immobilisering tilgange omfatter dissektion 1,2 eller anvendelse af chloroform som begge dræbe dyret. Anæstetika ether 4 og isofluoran 5-8 er også blevet anvendt. Mens bedøvelsesmidler giver mange fordeleDe inhiberer også neurale aktivitet og vigtig fysiologi (herunder hjerteslag) 9-11, kan derfor påvirke processen undersøgt og skaber stress på dyret. Der er også menneskelige sikkerhedsmæssige bekymringer for at arbejde med ether og isofluoran.
Vi har udviklet en stoffri metode til at immobilisere Drosophila larver i et enkelt lag PDMS mikrofluid enhed, som vi kalder den "larve chip '12. Denne protokol vil beskrive, hvordan opnå eller gøre larven chip, og hvordan du udnytter det for levende billeddannelse i tidlig iscenesat 3. instar larver. Chippen består af en tætsiddende mikrokammer, der ved anvendelse af et vakuum via en sprøjte, immoboliserer dyret via blid mekanisk kraft. Immobiliseringsprocessen metode bringer ventrale strukturer såsom nerve ledning, segmenter nerver, og krop væg muskler, inden for tæt på et dækglas. Dette giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af sådanne strukturer med høj numerisk apertidige (høj forstørrelse) mål.
Fordele ved larve chip i forhold til andre konventionelle teknikker omfatter følgende: (i) Anvendelse af larve chip erstatter brugen af kemikalier, der giver mulighed for in vivo billeddannelse af unanesthetized dyr. (Ii) Larver inddrive straks efter frigivelse fra chippen (i modsætning til en 2 timers restitutionsperiode for isofluoran 8,13). Dette giver mulighed for billedbehandling i brede tidsskalaer, der spænder fra millisekunder til minutter, timer og dage. (Iii) anvendelse af PDMS, som er et gaspermeabelt materiale, gør det muligt for kontinuerlig diffusion af oxygen / luft fra omgivelserne ind i larve kroppen. (Iv) Chippen er nem og sikker at bruge, og (v) det er genbruges, og kan fremstilles til en minimal pris.
Ud over instruktioner til brug af larve-chip, vil denne protokol giver flere eksempler på dens anvendelse til at studere neuronale begivenheder i 3. instar larver. Disse omfatter levende billeddannelse af Axonal transport, calcium svar til skade, og time-lapse undersøgelser af handel med foto-konvertibelt proteiner over lange afstande og tidshorisonter.
En anden anvendelse af chippen er at studere neuronale reaktioner på axonal skade. Til dette en yderligere procedure er beskrevet (i del 3) for skade axoner inden perifere nerver ved en segmental nerve crush. Denne enkle Assayet kan udføres både hurtigt og reproducerbart under en standard dissektion stereomikroskop, som giver mulighed for mange dyr, der skal behandles på samme tid. Cellulære reaktioner på skaden kan studeres ved billeddannelse i larve chip.
Protocol
1.. Gøre PDMS Chip
For at gøre en PDMS chip fra SU-8 skimmel, følg trin 1,1-1,7. Hvis en chip er ved hånden, men har brug for at samles til brug, skal du springe til trin 1.8.
- Bland 45 g PDMS base og 4,5 g hærder (10:1) fra en PDMS kit i en lille plastikbeholder til engangsbrug og bland dem grundigt med en plastik røre pind.
- Beholderen anbringes i et vakuum beholder (fx en ekssikkator) i 10 minutter for at fjerne eventuelle bobler.
- Placer SU-8 skimmel i bunden af en 150 mm i diameter plast skål og hældes langsomt PDMS blandingen på formen. Pas på ikke at generere bobler, mens hælde PDMS.
- Cure PDMS i en ovn (eller inkubator) ved 650 ° C i 4 timer.
- Fjern den hærdede PDMS/SU-8 formen fra ovnen og lad den afkøle i et par minutter.
- Ved hjælp af et barberblad, skæres de hærdede PDMS langs kanten af SU-8 mug og frigøre den fra SU-8 skimmel.
- Opdel PDMS pladei individuelle PDMS chips ved hjælp af et barberblad.
- Ved hjælp af en 21 G dispensering nål, stikke hul i sugehovedet (afbildet i figur 1A), i PDMS chip.
- Tag en 23 G dispenseringskanylen og sno nålespidsen fra sin base et par gange for at bryde nålespidsen væk fra låsen hub.
- Sæt 23 G nål ind i et lille stykke af polyethylenrør således at slangen omfatter mindst en millimeter af nålen. Derefter bruge et barberblad til at skære det overskydende rør væk fra nålen. Dette skaber en plast ring omkring den ene ende af nålen, som vil skabe en tætning, når indsat i vakuum indsugningsåbningen.
- Til anvendelse med et omvendt mikroskop (figur 1B og 2A-B): indsæt 23 G nål ind i hullet på sugehovedet. Til brug med en opretstående mikroskop (figur 1C og 2C-D): stikke et andet hul på siden af PDMS chip med en 21 G dispensing nålen; vil dette hul giver adgang til det første hul fra siden. Derefter sættes 23 g nålespidsen med slange ring i siden hullet. Anbring et stykke dobbeltklæbende tape over toppen af PDMS-chip til at forsegle det øverste hul (figur 1C).
- Tag et stykke polyethylenrør, der er cirka 20 cm i længden. Forbind den ene side af slangen til nålespidsen, der indsættes i sugehovedet.
- Slut den anden side af slangen til en af havnene i en 3-vejs ventil (se '3-vejs stophane 'i listen over materialer)
- Vedhæft en 20 ml sprøjte ind i en af to resterende porte. Den sidste port er åben for miljøet.
2. Brug af Larver Chip til Live Imaging
- Rengør PDMS chip med gennemsigtig tape. Vedhæft et stykke tape til bunden af chippen. Sørg for, at båndet rører hele PDMS overfladen, og derefter fjernes tapen.
- Gentag ovenstående trin 2-3x at sikre, at derer ingen partikler eller olie (overtaget fra tidligere eksperimenter) på overfladen af PDMS chip. Da PDMS chip er genbruges, er det meget vigtigt at fjerne olierester da det kan påvirke adhæsionen af PDMS til glas og resultere i utilstrækkelig forsegling.
- Overfør tidligt (dvs. fouragering) 3. stadiums larver til en petriskål indeholdende vand. (Den fouragering 3. stadiums stadie larver er i den mad, snarere end hætteglassets side kultur). Bade larver i vand for at fjerne kulturmediet.
- Tag en ren dækglas og placere en lille dråbe Halocarbon 700 olie i centrum.
- Brug pincet, forsigtigt afhente en ren, tidlig iscenesat 3. instar larve fra vandet (larve skulle være ~ 3,5-4 mm i længden). Placer dyret kortvarigt på en let tørre eller køkkenrulle for at fjerne overskydende vand, og derefter placere den på olie dråbe. Faldet skal være lille nok til, at luftrøret larverne ikke er overtrukne. Lad larve stay på olie drop for 10 sek.
- Fjern larve fra olien drop og derefter placere den på en ren dækglas.
- Overfør larve til en anden ren dækglas. Dette trin fjerner overskydende olie.
- Vær opmærksom på larve orientering. Til billeddannelse de neurale ledningen og segmentale nerver, bør den ventrale side af larve sidde på dækglasset. Dens dorsalsiden, kendetegnet ved to langsgående Trakealtuber, skal vende opad. Bemærk: dette er den orientering larven foretrækker naturligt.
- Anbring forsigtigt PDMS chip på toppen af larve. Larven bør tilpasses til centrum midt på mikrokammer, med halen orienteret mod vakuum port. Pas på, at larven ikke rører ved kanten af kammeret. Dette er især vigtigt for de forreste og bageste tracheale terminaler. Bemærk: dette trin gøres bedst under et stereomikroskop.
- Skub PDMS chip mod dækglas for at opnå en god tætning. Sørg for, at larven er heltomsluttet af mikrokammer når PDMS chippen rører dækglas.
- Switch 3-vejs ventil, således at sprøjten kan trække luft fra PDMS mikrokammer (gennem røret) for at skabe et vakuum.
- Med den ene hånd holdes PDMS chip / dækglas fast. Brug den anden hånd til at trække sprøjtestemplet. Udtag 2-2,5 ml luft, indtil der mærkes modstand i sprøjten håndtaget, for at skabe vakuum. Vakuum producerer en tæt forsegling mellem PDMS chip, olie og dækglas grænseflader og begrænser mobiliteten af larve.
- Sluk ventilen fra, således at PDMS chippen er isoleret fra sprøjten og fra miljøet. Som et resultat, er et relativt stabilt vakuumniveau opretholdes i mikrokammer uden behov for at holde sprøjten stemplet.
- Kontroller larve under Stereoskopet at sikre, at hele dyret krop er placeret inde i mikrokammer, og at dyret er immobile. Luftrøret skal være synlig. Resten afPDMS chip skal være i kontakt med dækglasset. Bemærk: Se figur 2E og 2F for eksempler på dyr korrekt immobiliseret i chippen. Nogle forkerte orientering er vist i figur 2G og 2H.
- Placer larve chip (PDMS chip + dækglas) på mikroskopet. Larven chip, slangen og sprøjten skal håndteres omhyggeligt for at undgå frigørelse af PDMS chip fra dækglasset. For en opretstående mikroskop, løse »top« side af chip til mikroskopbordet med dobbeltklæbende tape (figur 1C).
- Brug en høj forstørrelse målsætning (olieimmersionsobjektiv anbefales 40-63X) for at finde dyrets struktur (r) af interesse og udfører billeddannelse. I nogle tilfælde kan en lavere forstørrelse være nødvendig for at identificere det ønskede område til billeddannelse før der skiftes til højere forstørrelse.
- Når billeddannelse er færdig, slipper tomrum ved at skifte ventilen til positionender er åben for miljøet.
- Frigør PDMS chip fra dækglasset. Larven bør straks motile.
- Brug pincet til at fjerne larve fra mikrokammer og forsigtigt placere larve på en drue-juice agarplade til nyttiggørelse.
3. Inducerer en Nerve knusningsskade larvernes Segmentregnskab Nerver
- Følg trin 2.3 ovenfor for at isolere tidligt iscenesat 3. stadiums larver af den ønskede genotype. Som beskrevet i trin 2.3 bade larver i vand for at fjerne mad.
- Brug et standard flue CO 2 bedøvelse station, med CO 2 pad holdt under en dissektion stereomikroskop, at kue larverne. Larverne bør blive immotile efter placering på CO 2-pad til 1-2 min.
- Nu placere et enkelt bedøvede larve på et druesaft agarplade under stereomikroskop. Vend dyret ventrale side op at visualisere den ventrale nerve ledning og segmentær nerverne gennem neglebånd (
- Brug Dumostar nummer-5 pincet, knivspids de segmenter nerver stramt gennem neglebånd i 5-10 sek. Når dette er gjort korrekt, neglebånd forbliver intakt og kroppen væggen er ikke gennemboret. Bemærk: Skaden kan udføres ved forskellige positioner langs anterior-posterior kroppens akse, så længe den ventrale nerve ledning, spytkirtler, og tarme ikke er beskadigede. Den mest effektive placering skade mod slutningen af den 3. abdominal segment, som vist i figur 3D. Skade på dette sted skader flest nerver og er den nemmeste at gengive uden at dræbe dyret.
- Efter skaden, drej dyret, så dens ventrale nedad drue plade. Det bør være i stand til at bevæge hovedet og spise. Hvis skaden var en succes, så den bageste halvdel af larve vil blive lammet.
- Hold tilskadekomne dyr på druesaft agarplade ved 25 &# 176; C for den ønskede tid i henhold til den eksperimentelle mål. For motoneuroner, den proksimale stump begynder at spire inden 8-10 hr af skade 14, og den distale stump begynder at degenerere indenfor 6-8 hr 15. For klasse IV da sensoriske neuroner, den proksimale stump begynder at spire inden 4-6 timer, og den distale stump starten at degenerere indenfor 3-4 timer efter skaden. Bemærk: med passende Gal4 drivere og fluorescerende reportere, kan observeres spiringen og degeneration i larve chip (se for eksempel figur 6).
Representative Results
Larve chip består af et enkelt lag PDMS blok (en PDMS chip) hvis konstruktion er beskrevet i skematisk i figur 1.. (Se også supplerende DXF-fil for at designe din egen mug). Larven mikrokammer, vakuum-port, og perimeter-kanaler (figur 1a) er 140 um fordybninger i PDMS chip. Chippen er placeret på toppen af en tidlig trinvis 3. stadiums larver, som hviler på toppen af et dækglas med olie (figur 1B og 1 C). Olien glas grænseflade mellem dækglasset og PDMS chip giver mulighed for en sæl, der skal oprettes ved anvendelse af en mild vakuum. Denne sæl fælder larverne i kammeret, og siden begyndelsen iscenesat 3. instar larve er lidt tykkere end kammeret, forsegling kammeret skaber nogle fysiske konstriktion på dyret, effektivt immobilisere og begrænse dens bevægelse. I denne immobiliserede tilstand visse ventralekropsstrukturer, såsom ventrale nerve ledning og segmental skubbes tæt på dækglasset. Det er en fordel for billeddannelse, da der i den immobiliserede tilstand disse strukturer kan ligge inden for arbejdsområdet afstand 40X og 63X mål. Når vakuummet er frigivet, kan larven let fjernes fra mikrokammer, så yderligere forsøg, der skal udføres. Dette rent mekanisk immobilisering tilgang kan beholde 90% af larver i live efter kontinuerlig immobilisering perioder på op til 1 time 12.
Det tomrum er skabt af en simpel 20 ml sprøjte, og dermed hele enheden er let at transportere fra et stereomikroskop, hvor positionering i kammeret er udført, til en konfokal eller epifluorescensmikroskop, hvor levende billeddannelse udføres. Sprøjten er forbundet med sugehovedet via polyethylenrør og 23 G doseringsnål (med lås hubs fjernet), som beskrevet i trin fra 1,6 til 1,14. For omvendte mikroskoper, slangenog sprøjten er forbundet via toppen af chip (figur 1B, 2A og 2 B). For opretstående mikroskoper, er de forbundet via en port på siden af den chip (figur 1C, 2C, og 2 D). Konfigurationen for omvendte mikroskoper er noget lettere at anvende. Sprøjten er trukket for at skabe en blid vakuum (omtrent 10 psi), som binder olie-glas-PDMS-grænsefladen til dannelse af en tæt forsegling mellem dækglasset og PDMS-enhed, indfangning og immobilisering larve i kammeret.
Placeringen af larve i mikrokammer (trin 2,7-2,10 i protokollen) er afgørende for effektiv immobilisering og overlevelse (figur 2E-H). Hvis dyret er for stort til kammeret, (figur 2G), eller hvis dets hoved eller luftrør blive fanget mellem kanten af kammeret og dækslernelæbe (figur 1H), så er det usandsynligt at overleve proceduren.
Følgende er adskillige eksempler på anvendelsen af larvestadiet chip at studere forskellige cellulære responser i neuroner (fig. 4-7, Film S1 og Film S2).
Billeddannelse af hurtig axonal transport: Larven chip blev brugt til billede kinesin-medieret transport af synaptiske vesikler i de enkelte perifere axoner (Figur 4 og Movie S1) Den anterograd (~ 1,0 mM / sek) og retrograd (~ 0,8 mM / sek. ) flytning af disse vesikler kan let studeres fra film, der er indsamlet på en roterende disk konfokal mikroskop.
Positionering dyret til laser mikrokirurgi:. En sensorisk neuron dendritceller blev gennemskåret ved hjælp af en pulseret UV-dye laser (figur 5 og Movie S2) Protokoller for anvendelse af thans metode til mikrokirurgi kan findes andre steder 16,17. Den effektive immobilisering teknik giver mulighed for hurtig tid-skala ændringer i den skadede neuron, såsom ændringer i intracellulært calcium (registreres af genetisk kodet Ca 2 + indikator GCamp3.0 18), at blive opdaget og måles (figur 5).
Undersøgelse af regenerative og degenerative svar til skade: Hvis dyret får lov til at hvile mellem billeddiagnostiske sessioner, larve chip derefter bruges til at studere cellulære hændelser, der opstår i løbet af en lang række tidsskalaer. For eksempel har både 'regenerativ' og degenerative reaktioner på axonal skade, som finder sted over en tidsskala på 15 timer, kan afbildes i larve chip (figur 6). I dette eksempel blev axoner octopaminergic motoneurons såret via segmental nerveknusning (figur 3), der er beskrevet i del 3 i protokollen. Den proksimale Axon stump,som undergår ny spiring, og de distale axoner, der danner varicosities og derefter blive fragmenteret gennem processen med Wallerian degeneration, kan filmede og studerede på forskellige tidsintervaller efter skaden.
Sporing photoconvertible fluorescerende proteiner over tid in vivo: Udviklingen af photoconvertible fluorescerende proteiner, hvis fluorescens ændrer uigenkaldeligt ved udsættelse for UV-lys), gør det muligt at specifikt mærke en delmængde af proteiner i en celle, og spore skæbne af de mærkede proteiner over tid 19 20. Denne teknik er mest almindeligt udføres i cellekultur, men med larve-chip kan man spore genetisk indkodede photoconvertible proteiner inden for definerede celler in vivo. Som et eksempel, viser vi, at Denda2-α-tubulin fusionsprotein udtrykt i klasse IV da sensoriske neuroner, kan photoconverted i celle organer (7A og
Alle de beskrevne eksempler (figur 4-7 og film S1 og S2) blev afbildet ved hjælp af en roterende skive konfokalt, bestående af en Nipkow CSU10 scanner og en C9100-50 EMCCD kamera, der er monteret på en Axio Observer med 63X (1,5 NA) objektiv olie, og drevet ved hjælp Volocity erhvervelse software.
Figur 1. Skematiske tegnefilm for brug af larve chip.
(A) Larven chip består af PDMS-chip, der er angivet i lyseblåt, klæbet til en dækglas. Chippen indeholder 140 um tykke mikrofluidkanaler, angivet i hvidt. Den centrale mikrokammer er designet til at passe stramt en tidlig iscenesat 3. instar Drosophila larve (cartooned i lys grøn). En DXF fil, der indeholder nøjagtige dimensioner, der kan anvendes til at udforme formen som supplerende data. Skala bar = 1,5 mm. (BC) Side-visninger af skemaer for indlæsning af en larve i en larve chip. Larven sidder ventrale side nedad på et dækglas, og dens krop ligger inden for 140 um dyb mikrokammer. En 20 ml sprøjte er forbundet til vakuum indsugningsåbningen og anvendes til at inducere en blid vakuum. Den Halocarbon olie-PDMS-glas interface er bundet af vakuum ind i en tæt forsegling, som begrænser larve i mikrokammer. Denne sæl er let reversibelved at frigøre trykket fra sprøjten, hvorefter dyret straks genvinder motilitet. For opretstående mikroskoper (B), er sprøjten vakuum tilsluttet via Polyethylen-50 rør fra toppen af chippen. For inverterede mikroskoper (C), er disse forbindelser fremstillet fra den side af chippen, mens det øverste lag af chippen er fastgjort til mikroskopbordet via dobbeltklæbende tape.
Figur 2. Billeder af PDMS chips og korrekt placering af larve.
(AD). Fotografier, der viser PDMS chips til inverterede og opretstående mikroskoper. 23 G dispenseringsnålen tip er blevet indsat i vakuum port, som muliggør forbindelse via en slange til vakuum (sprøjte). Scale bar = 1.5 mm. (EH). Drosophila larver. E og F viser eksempler på korrekt immobiliserede dyr. Den mindre dyr i F er at foretrække, hvis vil blive udført flere billeder over lange tidsskalaer (> 12 timer). G viser et dyr, der er for stor, og H viser et lille dyr, der er placeret forkert. Skala bar = 1,5 mm. Klik her for at se større billede.
Figur 3.. Nerveknusning skade i segmenter nerver i Drosophila larver.
(A) cartoon af nerveknusning assay. De segmenter nerver inden for en 3. (B) Udsigt larve nervesystem fra et dyr dissekeret 20 timer efter nerve crush. Immunfarvning for neuronale membraner med anti-HRP-antistoffer (rød) fremhæver hjernen lapper, ventral nerve ledning, og lange segmenter nerver, der indeholder motoneuron og sensoriske neuron axoner. En delmængde af individuelle motorneuroner er mærket ved at køre ekspression af UAS-mCD8-GFP (grønt) med m12-Gal4 driver. Cellelegemer og dendritter fra disse neuroner ligger i den ventrale nerve ledning, mens deres axoner projektet til kroppens væg muskler via segmenter nerver. (Denne driver også driver GFP-ekspression i muskel 12 for hver larve hemisegment, der sammen kan ses som anterior-posterior striber på hver side af dyret). Regionen beskadiget af crush er fremhævet med blå stiplede linjer. Skala bar = 70 mM. (C) Luk op visninger af de beskadigede axoner, 20 timer efter skaden. Venstre: denproksimale Axon har gennemgået spiring og ny vækst. Til højre: den distale Axon er fragmenteret, med lidt GFP tilbage, på grund af Wallerian degeneration og clearance af vragrester. Skala bar = 10 mM. (D) Billeder af nerve crush på en tidlig 3. instar larve. Den røde pil peger på den ventrale nerve ledning. Placeringen af crush er mod bunden af 3rd segment som beskrevet i protokollen tekst (protokol nr. 3). Billederne i D blev oprindeligt udgivet i J. Cell Bio 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Time-lapse billeddannelse af axonal transport af peptiderge synaptiske vesikler. Denrotte atrienatriuretisk peptid ANF tagget med GFP, UAS-ANF-GFP 21, blev udtrykt i specifikke motoneurons hjælp af EVE-RRA-Gal4 driver 22. Live-billeddannelse i segmenter nerver afslører den hurtige transport af ANF-GFP mærket peptiderge vesikler i axoner. Se også Movie S1. (A) Enkeltbilleder af motoneuron axoner fra levende time-lapse billeddannelse. Grøn, rød og blå pile viser eksempler på anterograd, stationære og retrograd vesikler, hhv. Skala bar = 5 um. (A ') Individuelle tidsrammer fra filmen blev lagt sammen ved hjælp ImageJ. (B) En kymograph genereret ud fra time-lapse billeddannelse af ANF-GFP transport, blev genereret fra en samling af enkeltbilleder spænder et minut af imaging tid ved hjælp af 'Multiple Kymograph' plug-in til ImageJ 23. (C) Kvantificering af gennemsnit segmentariske hastigheder, der blev beregnet ud fra skråningerne af segmenterede spor i kymographs. Den grønne bar præsentationts anterograd segmentær hastighed (n = 543), og den blå bjælke præsenterer retrograd segmental hastighed (n = 548) af vesikler fra 10 kymographs. (D) Kvantificering af partikel tæthed. Partikeldensitet blev målt ved antallet af anterograd (vist i grøn bar), stationære (vist i rød bjælke) og retrograd (vist i blå bjælke) partikler pr 100 um af Axon længde fra 10 kymographs. Dataene i denne figur blev også offentliggjort tidligere i Ghannad-Rezaie m.fl., PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
Figur 5. Anvendelse af larve chip til laser mikrokirurgi og calcium imaging.
En dendritceller fra et klasse IV sensorisk neuron transected ved med high-powered laser pulser fra en pulserende UV dye laser. Protokoller for brugen af denne metode til mikrokirurgi kan findes andre steder 16. Den effektive immobilisering i larve chippen giver mulighed for hurtige ændringer i intracellulære calcium niveauer, der skal studeres af direkte billedvisning. I dette eksempel blev genetisk kodet calcium indikator GCaMP3.0 udtrykt i klasse IV dendritiske arborization (C4da) sensoriske neuroner ved hjælp af PPK-Gal4 driver. (A) Time-lapse billeder af GCaMP3.0 intensitet var falsk farvet efter farven intensitet skala til at angive ændringer i intensitet over tid. Enkelte billeder blev udvundet fra en time-lapse film (Movie S2) afbildet på en roterende disk konfokal mikroskop ved 5 billeder / sek. (B) Kvantificering af calcium dynamik som svar på laser mikrokirurgi. Den normaliserede fold ændring i soma GCaMP3.0 fluorescensintensitet (ΔF/F0) af individuelle neuroner blev plottet mod tiden (n = 7, vist i gråt). Den gennemsnit ΔF/F0 var repræsenteret i orange. Den maksimale stigning i GCaMP3.0 intensitet blev observeret mellem 1-2 sek efter skade. Baggrund blev trukket fra den rå G-CaMP3.0 fluorescens intensitet. Dataene i denne figur blev også offentliggjort tidligere i Ghannad-Rezaie et al (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12..
Figur 6.. Imaging axonal spiring og degeneration ved hjælp af larve chip. Repræsentative konfokal billeder af den proximale stump (venstre) og distale stump (højre) af octopaminergic motoneuron axoner på forskellige tidspunkter efter den nerve crush. Billeder blev taget på lignende steder, som vist i figur 3C. Disse neuroner er mærket ved at køre udtryk for en UAS-mCD8-RFP transgen hjælp af Tdc2-Gal4 driver 24,25. Cellen organer for disse neuroner ligger i den ventrale nerve ledning 24. Tre individuelle axoner kan ses inden for en enkelt segmental nerve, og er let løses fra hinanden. Dette er en ideel situation for studiet af de enkelte cellulære begivenheder, såsom opsplitning af degenererende axoner, som er komplet inden 15 timer for disse neuroner. Billeder blev opnået fra levende dyr ved hjælp af larve chip på 63X forstørrelse på en roterende disk konfokal mikroskop. Skalapanelerne = 10 um til venstre paneler (proksimale træstubbe) og 20 um til højre paneler (distale træstubbe). Klik her for at se større billede.
Figur 7. Brug af larvechip til at spore photoconverted fluorescerende proteiner over lange tider og afstande i levende dyr.
I dette eksempel, et fusionsprotein af photoconvertible fluorescerende protein Dendra2 19 fusioneret til α-tubulin, udtrykkes fra et UAS-Dendra2-α-tubulin transgenet i klasse IV dendritiske arborization (C4da) sensoriske neuroner ved anvendelse af ppk-Gal4 driver 26.. (A) Skematisk for fotoomdannelse eksperiment. Cellen organer C4da neuroner ligger i periferien og udvide axoner gennem segmental nerver til at danne synaptiske terminaler i nerve ledningen. Den Dendra2-α-tubulin i en delmængde af cellelegemer i den bageste halvdel af dyret underkastes fotoomdannelse ved UV-belysning i 6 sekunder ved hjælp af en standard DAPI filter med Hg-lampe (venstre tegneserie). Efter tid, kan photoconverted Dendra2-α-tubulin påvises ved synaptiske terminaler i den ventrale nerve ledningen. Dette indikerer, at tubulin protein er blevet Transported over en lang afstand (af ~ 1-2 mm). Skala bar = 1 mm (B) eksempel billeder af Dendra2-α-tubulin i klasse IV sensorisk neuron celle krop før og efter fotoomdannelse. Skala bar = 5 um. (C) eksempel billeder af synaptiske terminaler til klasse IV sensoriske neuroner på enten 0 hr eller 48 timer efter fotoomdannelse af celle organer. Den specifikke udseende photoconverted Dendra2-α-tubulin på synaptiske terminaler efter tiden indebærer, at protein rejste fra cellen kroppen til Axon terminalen. Fotoomdannelse og billedbehandling på alle tidspunkter blev gennemført i larve chip. Skala bar = 15 mM. Klik her for at se større billede.
Movie S1. Laser mikrokirurgi og calcium billeddannelse af en C4da neuron. Et pulserende UV laser blev brugt til at transektere en pænary dendritiske gren. Laser transection inducerede en hurtig stigning i GCaMP intensitet, som begyndte på skadestedet og rejste til cellen kroppen. UAS-GCaMP3.0 18 blev udtrykt ved brug af C4da specifikke PPK-Gal4 driver 26. Filmene var falsk farvet til at angive den relative intensitet niveauer af GCaMP3.0. Den time-lapse imaging blev udført med snurrende disk konfokal mikroskopi ved 5 billeder / sek.
Film S2. Hurtig axonal transport af ANF-GFP i motorneuroner.
Rotten atrienatriuretisk peptid ANF tagget med GFP, UAS-ANF-GFP 21, blev udtrykt i specifikke motoneurons hjælp af EVE-RRA-Gal4 driver 22. Transporten af disse peptiderge vesikler indenfor larve segmental nerver blev afbildet på larve chippen ved 300 msek / ramme ved hjælp af en roterende skive konfokal mikroskop.
Supplerende Figur 1 (DXF-fil)
DXF fil til silicium skimmel fabrikation. Filen er beregnet til negativ fotoresistbelagte maske (mørk indgivet maske til SU-8) på en 4 tommer silicium wafer. Den anden række indeholder 5 forme til at gøre larve chips bruges i denne protokol. Hver af disse chips (i række 2) indeholder en ~ 5,4 mm x 1,5 mm kammer designet til at passe en tidlig fase 3. instar larve. Den første række (række 1) indeholder et større kammer (~ 5.4 mm x 2 mm), mens den tredje række (række 3) indeholder en mindre kammer (~ 4.4mm x 1.5mm). Disse kan anvendes med larver af større og mindre størrelser, hhv. Scale bar = 2 mm.
Discussion
Gøre eller opnåelse larve chip:
Larven chip består af en PDMS blok (det såkaldte 'PDMS chip ") knyttet til en dækglas. Protokollen i trin 1 beskrives proceduren for fremstilling og anvendelse af larve chips, under forudsætning af en SU-8 mug er til rådighed. SU-8 formen er microfabricated ved fotolitografisk mønstring en 140 um tyk SU-8 fotoresistlag på en silicium wafer (for detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Som microfabrication af SU-8 skimmel kræver adgang til specialudstyr, anbefaler vi at bestille det fra en microfabrication facilitet (f.eks. Den LNF facilitet på University of Michigan 14), eller fra et støberi ved at sende dem chip-design, der leveres som en supplerende fil. Hvis man ønsker at ændre udformningen af PDMS chip (fx til anvendelse med larver af forskellige størrelser), en CAD-software, der håndterer DXF-filer (f.eks Autocad) kan anvendes. En SU-8 mug kan også ske in-house at følge instruktionerne i Mondal et al. Kan 27 Mange læsere finder det bekvemt at blot at opnå en prøve PDMS chip til at afprøve teknikken før opdigte deres egne chips. Dette vil blive gjort frit tilgængelige efter anmodning.
Anvendelse af mikrofluid 'larve chip' for levende billeddannelse:
Immobiliseringen metode larve chip undgår anvendelsen af anæstetika, og i stedet involverer tryk, via anvendelse af et vakuum til at begrænse dyrets bevægelse. Mens dyr kan overleve immobilisering i chippen for flere timer 12, en kortere immobilisering periode (5-15 min) anbefales. Det er tid nok til billeddannelse mange cellulære begivenheder af interesse, herunder ændringer i intracellulært calcium, eller hurtigt axonal transport. Det er også tid nok til de ønskede manipulationer i levende dyr, såsom laser-baserede mikrokirurgi fotoblegning og photoconverSion.
At studere begivenheder på langs over en længere periode i et enkelt dyr, kan dyrene anbringes i chippen og filmede flere gange, adskilt af perioder med hvile. Druesaft agarplader er ideelle til at hvile mellem billeddannelse sessioner, da de giver en nem fødekilde og fugtighed. Flere billeddiagnostiske sessioner gøre påvirke larvernes overlevelse til en vis grad, da hver session bærer en vis risiko for at beskadige dyret (se del 2 i fejlfinding, nedenfor). Dyr kan rutinemæssigt afbildes> 5 gange i løbet af to dage med en overlevelsesrate på mere end 50%. Da dyrene ikke bedøves, de er sunde og bevægelige straks efter frigivelse af vakuumet i chippen. Der er derfor ikke behov for nyttiggørelse tid mellem billeddiagnostiske sessioner, så den tid, afstand mellem sessioner er fleksibel og kan tilpasses til målsætningerne i eksperimentet.
Fejlfinding:
Den mest almindelige tekniske eranlægger sag med larve chip og anbefalede løsninger er følgende:
(1) Dyret bevæger sig for meget. For meget mobilitet kan forstyrre de billeddannende mål. De mest almindelige årsager til dette i larve chippen er a) dyret er for lille til chippen, eller b) vakuumtrykket påføres under immobiliseringstrinet er kompromitteret. Larven chip beskrevet i denne protokol er designet til tidlig iscenesat 3. instar larver. Den optimale størrelse for dyret er 3,5-4 mm i længden (langs anteroposterior aksen). For at sikre at vakuumtrykket er tilstrækkelig, Træk sprøjten 2-2,5 ml, eller indtil der mærkes modstand i håndtaget. En indikation af, at vakuum fungerer er, at små bobler i omkredsen kanalen kan ses bevæge sig langsomt mod vakuumkilden. En anden indikation er, at dækglasset altid skulle rejse med chippen, når chippen løftes fra toppen (og dette er den anbefalede metode til transport af kammeretnår larverne er positioneret, og vakuummet er tændt). Vakuum kan blive kompromitteret, hvis der er revner i slangen, eller hvis der er olie i slangen. Dette kan nemt løses ved at erstatte 23 G dispensering nålespidsen og polyethylen-50-rør (fra trin 1,6-1,14).
(2) Dyret dør efter billeddannelse i chippen. Metoden er bestemt til at forårsage minimal stress på dyret, og dyr af vildtype genotype har en overlevelsesrate> 90%, selv efter en times immobilisering på chippen 12.. Da nogle genotyper kan være mindre modstandsdygtige over for stress i chippen, så tjek først at vildtype dyr (for eksempel Canton S) overleve immobilisering teknik. a) Den mest almindelige årsag til dødelighed er forkert positionering af larve (se figur 2G-H). Såfremt dele af neglebånd, hoved eller luftrør er ikke helt i kammeret, så de kan blive beskadiget under immobilisering og enlarve, der er for stor til den chip (> 4 mm) er mindre tilbøjelige til at overleve. b) En mindre almindelig årsag til dødelighed er brugen af for meget pres eller vakuum, når du lægger chippen. Når placeret korrekt i den chip, tryk fra vakuum er veltolereret. Men overdrevent tryk, enten fra vakuum eller i den indledende fase af at positionere dyret kan være et problem. Det er bedst at lære graden nødvendige tryk empirisk ved forsøg med vildtype larver af den korrekte størrelse. c) Hvis der for meget Halocarbon olie dækker dyrets luftrør dyret potentielt kan have problemer med langsigtede overlevelse. Olien spiller flere vigtige roller i chippen: Det er vigtigt for oprettelsen af det vakuum, optikken under billedbehandling, og det modvirker udtørring i chippen. Men overdreven olie bør undgås. (Dette kan også føre til olie i slangen og sprøjten, kompromittere vakuum). De foreslåede protokol frakker bare den ventrale side af larve med olie, så reFlytter overskydende olie ved placering af larve på et rent dækglas før overførsel til den endelige dækglas til billeddannelse. d) fototoxicitet kan opleves fra imaging session. Som med alle levende billedbehandling ansøgning, er det ideelt at bruge korte eksponeringstider med lav intensitet laserlys, hvilket bedst opnås ved hjælp af et meget følsomt kamera eller detektor. Forsøge at minimere belysning med UV-lys, herunder bredspektret lys lavet af Hg lyskilder.
Andre spørgsmål og fremtidige retninger:
Da denne metode ikke udnytter bedøvelsesmidler, fortsætter dyrets hjerte til at slå. Dette skaber en vis uundgåelig mobilitet, som påvirker billeddannelse nogle steder mere end andre. Eksemplerne her viser, at den ventrale nerve ledning, segmenter nerver og krop væg kan let filmede uden indblanding fra hjerteslag. I tilfælde, hvor hjerteslag påvirker billeddannelse, kan de regelmæssige bevægelser undertiden korrigeres for medi analyse software (for eksempel Image Stabilizer plugin til ImageJ). Det fungerer godt, når de enkelte objekter bevæger sig på en hurtig tidsskala (fx ~ 1 mM / sek til hurtig aksonal transport) eller på en meget langsom tidsskala (minutter til timer). Men når det objekt (er) af interesse farten med en række hastigheder og retninger, kan det være sværere at korrigere for hjerteslag inducerede bevægelser.
Et andet problem er mindre variabilitet i optik fra dyr til dyr, eller mellem flere billedoptagelse af samme dyr i chippen. Jo dybere objekt af interesse er i dyret, jo større denne variation vil være. Segmental nerver og den ventrale nerve ledningen er normalt for dybt inden så dyret, der skal afbildes på en regelmæssig mikroskop. Den milde overtryk i larve chip skubber Men disse strukturer meget tæt på neglebånd og dækglasset. Den nøjagtige afstand af disse strukturer fra dækglasset vil have små variationer fra trundervægter le til retssagen. Variationen for objekter lukke kutikula, såsom cellelegemer af sensoriske neuroner, er mindre. Det er derfor vigtigt, især for at foretage målinger af intensitet, at udnytte et stort antal dyr og uafhængige forsøg at tage højde for variabiliteten i optik.
Mens her viste eksempler har fokuseret på processer inden for neuroner, bør tilgangen være modtagelig for billeddannelse nogen struktur i dyret, der kan bringes i fokus dybde af mikroskop mål. Dette omfatter neglebånd, krop væg muskler, og deres NMJs. Trachea på den ventrale side af dyret og potentielt dele af fordøjelseskanalen kan også afbildes. Dyret kan også være placeret med sin dorsale side mod dækglasset til kortvarig billeddannelse af strukturer nær den dorsale overflade. Evnen til billede strukturer dybt inde i dyret er begrænset af distancen af mikroskop mål anvendes. Strukturer såsom imaginal diske er utilgængelige for høj forstørrelse (f.eks 40X) mål.
Larven chips, der er beskrevet i denne protokol er designet til larver i begyndelsen af 3. instar etape (spænder i størrelse fra 3,5 til 4 mm). Men mange interessante spørgsmål kræver billedbehandling på forskellige larvestadier. Mindre chips til at rumme 2 nd instar larver, eller større chips til at rumme sent 3. instars kan nemt udformet efter samme princip. (Supplerende Figur 1 indeholder en let modificerbare DXF-fil for at gøre silicium forme med ændrede kammer størrelser). Det enkle princip om den reversible sæl kan endog anvendes til andre organismer såsom C. elegans eller zebrafisk, med de vigtigste variant er kammerets størrelse. En nyttig fremtidige retning er at designe en chip, som kan immobilisere mange dyr på én gang, skal bruges til screening formål. Men for dette, ville konstruktionen skal være væsentligt anderledesfra den aktuelle enhed, hvor spørgsmål om at placere dyret på chippen skal behandles for hvert dyr uafhængigt.
Den nerveknusning assay til at studere skade reaktioner i larvernes perifere nerver:
Den nerve crush beskrevne analyse her larve segmental nerver er en simpel metode til at indføre en skade på perifere axoner i Drosophila. Fordelene ved denne metode kan nævnes: a) er det nemt at foretage med standardværktøjer findes i en Drosophila lab (et stereomikroskop CO 2 kilde og tang) b) det kan gennemføres hurtigt for mange dyr, hvilket gør biokemisk analyse af nerve snore efter skade gennemførlig 14 c) de molekylære og cellulære reaktioner på denne skade er meget reproducerbar 14,15,28 og kan bruges til at opdage processer, der også er vigtige for vertebrate neuroner 29,30.
Alternative metoder til skade neuroner er at focusa kraftig laser, for eksempel en pulserende UV eller femtosekund laser, at afskære en Axon via laser mikrokirurgi 17,31-33. Larven chip er en ideel metode til at positionere dyret for sådan mikrokirurgi. Men på grund af mindre forskelle i optik mellem forsøg, diskuteret ovenfor, kan laser-baserede metode være vanskeligere at gengive i larver, især i larve segmentariske nerver. Også laserbaseret axonal skade kræver mere tid til at placere hvert dyr, og derfor er vanskeligere at gennemføre i stor skala (med et stort antal dyr).
Fejlfinding:
Den hyppigst forekommende teknisk spørgsmål fra nerveknusning er død fra skader på indre organer. Ved udførelse af knuse, er det vigtigt ikke at klemme den ventrale nerve ledning, spytkirtler, eller tarmene. Det er også vigtigt ikke at punktere kutikula. Disse spørgsmål er bedst undgås ved at bringe tang ved en vinkel på 45 ° neglebånd overflade (se figur 3).
Kvaliteten af tangen har en stor indflydelse på effektiviteten af knuse og overlevelse bagefter. Vi anbefaler Dumostar nummer 5 pincet. For at bevare deres skarphed, skal tangen håndteres med omhu, ikke anvendes til andre formål, og erstattet når de bliver sløve eller bøjet.
Størrelsen af dyret kan også påvirke effektiviteten af crush. Små dyr (mindre end 3 mm i længden) er langt mindre tilbøjelige til at overleve skaden. Med store dyr (vandrer 3 rd instars), er det mere vanskeligt at finde nerver og undgå skader på de større spytkirtler og tarme, og der er mindre tid til at studere skade reaktioner før pupation. Den nerve crush er mest effektivt gennemført i begyndelsen af 3. stadiums larver (som er ~ 3-4,5 mm i længden langs anteroposterior aksen).
Fødekilde at dyret er hævet på kan påvirkestyrken af neglebånd og overlevelse efter crush. Det anbefales at opdrætte dyr i fødevarer fremstillet af en standard gær-glucose opskrift.
Den bedste metode til at lære at gøre det knuse effektivt, er at øve sig på mange dyr, først med det primære mål at opnå overlevelse (og ikke pupation) 24 timer efter crush. Begyndere normalt har en lav overlevelsesrate (fx 10%), men når teknikken er lært, kan overlevelsesrater nå ~ 90%.
Andre spørgsmål og fremtidige retninger:
Knuse analysen giver en kraftfuld metode til at studere spiring af Axon proksimalt skaden site og degeneration af axoner og synapser distale til skaden site. Mens satserne for degeneration varierer mellem forskellige neuron typer, de er meget reproducerbar inden for en given neuron typen, der giver hyldest til reproducerbarheden af skaden analysen.
I modsætning hertil "regenerativ 'spiringrespons observeret i proksimale axoner er mere udfordrende at studere. Alle axoner i segmental nerve indlede omfattende spiring tæt på skadestedet (se for eksempel figur 6 og figur 3). Men omfanget af spiring kan variere fra neuron til neuron, og er vanskelige at kvantificere. Der kan konstateres en lignende grad, og variation i spiring efter flere fokale læsioner af enlige motoneurons i segmental nerver indført ved hjælp af en UV pulserende farvestof laser. Vi tolker, at den nondiscriminate retningen af den spirende skyldes fraværet af vejlednings stikord i de segmenter nerver. I modsætning hertil sensoriske neuron axoner såret ved hjælp af laser tæt på deres cellelegemer undergår ny axonal vækst i samme retning som den tabte Axon 34. Axoner i denne region af dyret sandsynligvis udsat for mere specifik positionelle information til vejledning af regenererende axoner. Miljøet inden segmental nerver er usandsynligt at have meget resemblance til det miljø, som axoner oprindeligt navigerede under deres vejledning i fosterstadiet, og derfor forventes ikke at have oplysninger til at guide regenererende axoner.
En anden begrænsning for at studere regeneration ved hjælp af segmental nerveknusning analysen er, at sårede sensoriske og motoneuron axoner har fortsat en betydelig afstand til at dække (0.25-1 mm) for at nå deres mål, og en begrænset tidsramme (<3 dage), inden dyret gennemgår pupation. En nylig undersøgelse har identificeret en genetisk manipulation af prothoraciotropic hormonreceptor som tredobler varigheden af 3. instar larvestadiet 35. Denne manipulation vil forlænge tidsrammen for at studere genopretning og degeneration af neuroner efter skaden betydeligt til 9 i stedet for 3 dage. Dette kan være lang nok til at observere nye begivenheder, såsom genåbning af en skadet axon med sin postsynaptiske mål, især hvis skaden er foranlediget tæt på den synaptiske slutning.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tilskud nummer IOS-0.842.701 til CAC), og National Institute of Health (R00MH080599 til BY, R21 NS062313 til NC, og NS069844 til CAC). Vi vil gerne anerkende James Schutt, Emily Han, og Leni Truong for teknisk support, og Bloomington Stock center for flueliner. Alle chips blev fabrikeret på Lurie nanofabrikation Facility på University of Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
