Summary
Drosophila larver er et attraktivt modellsystem for levende avbildning på grunn av deres gjennomskinnelig skjellaget og kraftige genetikk. Denne protokollen beskriver hvordan du kan utnytte en single-layer PDMS enhet, kalt 'larve chip "for levende avbildning av cellulære prosesser i nevroner av 3 rd instar Drosophila larver.
Abstract
Live-avbildning er en viktig teknikk for å studere cellebiologiske prosesser, men dette kan være utfordrende i levende dyr. Den gjennomsiktige cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt modellorganisme for live imaging studier. Men, er en viktig utfordring for live imaging teknikker for å invasivt immobilisere og plassere et dyr på mikroskopet. Denne protokollen presenterer en enkel og lett å bruke metoden for å immobilisere og bildebehandling Drosophila larver på en polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic enhet, som vi kaller den "larve chip". Larvene brikken består av en tettsittende PDMS mikrokammeret som er festet til en tynn glass dekkglass, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret og bringer ventrale strukturer som for eksempel nerveledning, segmental nerver, og kropps veggen muskler, i umiddelbar nærhet til dekkglass. Dette gjør det mulig for bildebehandling med høy oppløsning, og viktigere, unngår bruk av anesthetics og kjemikalier, noe som letter studiet av en rekke fysiologiske prosesser. Siden larver gjenopprette lett fra immobilisering, kan de lett utsettes for flere imaging sesjoner. Dette gjør det mulig for longitudinelle studier over tid kurs som spenner fra timer til dager. Denne protokollen beskriver steg-for-steg hvordan du forberede chip og hvordan du kan utnytte brikken for live avbildning av nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse hendelsene inkluderer rask transport av organeller i aksoner, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer. En annen anvendelse av brikken er å studere regenerativ og degenerative responser til aksonal skade, slik at den andre delen av denne protokoll beskriver en ny og enkel fremgangsmåte for å skade aksoner i perifere nerver av en segmental nerve knuse.
Introduction
Bananflue, Drosophila melanogaster, har vært benyttet som modellorganisme i over 100 år, og har vist seg instrumental i å definere grunnleggende signal-og utviklingsveier som er bevart fra virvelløse dyr til menneske. Live-avbildning er en viktig tilnærming til å studere cellulære mekanismer, og den enkle kroppen plan og gjennomskinnelig cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt system for sanntidsavbildning, spesielt siden det er mange genetiske verktøy tilgjengelig for å uttrykke fluorescently merket proteiner i bestemte celletyper.
En viktig utfordring for live bildeteknikker er å invasivt immobilisere og plassere et dyr for mikroskopi. Konvensjonelle metoder omfatter immobilisering disseksjon 1,2 eller bruk av kloroform, som begge avlive dyret. De anestetika ether 4 og isofluorane 5-8 har også blitt brukt. Mens bedøvelse gir mange fordeler, De også hemmer nevral aktivitet og viktig fysiologi (inkludert hjerteslag) 9-11, dermed kan påvirke prosessen studert og skape stress på dyret. Det er også menneskelig sikkerhet bekymringer for å jobbe med eter og isofluorane.
Vi har utviklet et stoff-fri metode for å immobilisere Drosophila larver i et enkelt lag PDMS microfluidic enhet, som vi kaller den "larve chip '12. Denne protokollen vil beskrive hvordan få tak i eller lage larven chip, og hvordan du kan utnytte det for live bildebehandling i tidlig-iscenesatt 3 rd stadiums larver. Brikken består av en tettsittende mikrokammeret, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret via skånsom mekanisk kraft. Immobilisering metoden bringer ventral strukturer som nerve ledningen, segmental nerver, og kroppen veggen muskler, med nærhet til et glass dekkglass. Dette gir høy oppløsning avbildning av slike strukturer med høy numerisk aperTure (høy forstørrelse) siktemål.
Fordeler med larve-brikken fremfor andre konvensjonelle teknikker, omfatter følgende: (i) Anvendelse av larven chip erstatter bruk av kjemikalier, noe som åpner for in vivo avbildning av unanesthetized dyr. (Ii) Larver komme umiddelbart etter frigjøring fra brikken (i motsetning til en 2 timers restitusjonsperiode for isofluorane 8,13). Dette gjør det mulig for bildebehandling enn brede tidsskalaer, fra millisekunder til minutter, til timer og dager. (Iii) Anvendelse av PDMS, som er en gass-permeable materiale, gjør det mulig for kontinuerlig diffusjon av oksygen / luft fra omgivelsene inn i den larve kroppen. (Iv) Brikken er enkel og trygg å bruke, og (v) den er gjenbrukbar, og kan fremstilles til en rimelig pris.
I tillegg til instruksjoner for bruk larven chip, vil denne protokollen gir flere eksempler på bruken for å studere nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse inkluderer direkte avbildning av axonal transport, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer.
En annen anvendelse av brikken er å studere neuronal respons på aksonal skade. For dette en ekstra prosedyre er beskrevet (i del 3) for å ha skadet axons innenfor perifere nerver ved en sekvensiell nerve knuse. Denne enkle analysen kan utføres både hurtig og reproduserbart under en standard disseksjon stereomikroskop, som gjør det mulig for mange dyr som skal behandles på samme tid. Cellulære reaksjoner på skaden kan studeres av levende avbildning i larven chip.
Protocol
En. Making the PDMS Chip
For å gjøre en PDMS chip fra SU-8 mold, følg punkt 1.1 til 1.7. Hvis en brikke er på hånd, men må monteres for bruk, går du til trinn 1.8.
- Bland 45 g av PDMS base og 4,5 g herder (10:01 ratio) fra en PDMS kit i en liten engangs plastbeholder og bland dem godt med en plast røre pinne.
- Plasser beholderen i en vakuumbeholder (for eksempel en eksikkator) i 10 minutter for å fjerne bobler.
- Plasser SU-8 form på bunnen av en 150 mm i diameter plast fatet og langsomt helles PDMS blandingen i formen. Pass på ikke å generere bobler mens helle PDMS.
- Kurere PDMS i en ovn (eller inkubator) ved 650 ° C i 4 timer.
- Fjern kurert PDMS/SU-8 mold fra ovnen og la den avkjøles i noen minutter.
- Ved hjelp av et barberblad, kutte kurert PDMS langs kanten av SU-8 mugg og løsne den fra SU-8 mold.
- Fordel PDMS skivei individuelle PDMS chips med et barberblad.
- Ved å bruke en 21 G nål dispensering, stikke et hull i vakuumport (vist i figur 1A) av PDMS-brikken.
- Ta en 23 G utlevering nål og vri nålespissen fra sin base et par ganger for å bryte nålespissen av fra hub lås.
- Sett 23 G nålespissen inn et lite stykke polyetylenrør, slik at slangen omfatter i det minste en millimeter av nålen. Deretter kan du bruke et barberblad for å kutte overskytende slange vekk fra nålen. Dette skaper en plastisk ring rundt en ende av nålen, noe som vil skape en tetning når de settes inn i vakuum inntaksporten.
- For bruk med en invertert mikroskop (Tall 1B og 2A-B): Sett inn 23 G nålespissen inn i hullet på vakuumporten. For bruk sammen med en opprettstående mikroskop (figurene 1C og 2C-D): rote en andre åpning på siden av PDMS-brikken med en 21 G dispernsing nål; vil dette hullet gi tilgang til det første hullet fra siden. Deretter setter du inn 23 G nålespissen med slange ring inn side hullet. Legg et stykke dobbeltsidig tape over toppen av PDMS-brikken for å forsegle topphullet (figur 1C).
- Ta et stykke polyetylenrør som er omtrent 20 cm i lengde. Koble den ene siden av røret til nålen spissen som er satt inn i vakuumporten.
- Sett den andre siden av slangen til en av portene i en 3-veis ventil (se '3-veis stoppekran 'i listen over materialer)
- Fest en 20 ml sprøyte inn i en av to gjenværende porter. Den siste port er åpen til omgivelsene.
2. Bruke Larva Chip for Live Imaging
- Rengjør PDMS chip med gjennomsiktig tape. Fest et stykke av båndet på undersiden av brikken. Pass på at tapen berører hele PDMS overflaten, og deretter løsner båndet.
- Gjenta ovenstående trinn 2-3x å sørge for at detikke er noen partikler eller olje (beholdt fra tidligere forsøk) på overflaten av PDMS-brikken. Siden PDMS chip er gjenbrukbare, er det svært viktig å fjerne oljerester som det kan påvirke vedheft av PDMS til glass og resultere i mangelfull tetting.
- Overfør tidlig (dvs. beite) 3 rd stadiums larver til en petriskål som inneholder vann. (Den slåing 3. instar larver er i mat, i stedet for på siden av hetteglasset kultur). Bade larvene i vann for å fjerne kulturmediet.
- Ta et rent glass dekkglass og plassere en liten dråpe Halocarbon 700 olje i midten.
- Bruk pinsett, forsiktig plukke opp en ren, tidlig-iscenesatt 3. instar larve fra vannet (larven bør være ~ 3.5-4 mm i lengde). Plasser dyret kort på en lett tørke eller papir håndkle for å fjerne overflødig vann, og deretter plassere den på oljefallet. Dråpen bør være liten nok slik at luftrøret av larvene ikke er belagt. La larven stay på oljedråpen i 10 sek.
- Fjern larven fra oljefallet og deretter plassere den på et rent glass dekkglass.
- Overfør larven til en annen rent glass dekkglass. Dette trinnet fjerner overflødig olje.
- Vær oppmerksom på larve orientering. For bildebehandling nevrale ledningen og segmentell nerver, bør den ventrale siden av larve sitte på dekkglass. Dens ryggsiden, preget av to langsgående trakealtubers, skal vende oppover. Merk: Dette er orienteringen larven foretrekker naturlig.
- Påfør PDMS chip på toppen av larven. Larven bør være på linje til sentrum midt på mikrokammeret, med halen orientert mot vakuum port. Vær forsiktig slik at larven ikke berører kantene på kammeret. Dette er spesielt viktig for de fremre og bakre tracheal terminaler. Merk: Dette trinnet gjøres best under et stereomikroskop.
- Skyv PDMS chip mot glass dekkglass for å oppnå en god tetning. Sørg for at larven er heltomsluttet av mikrokammeret når PDMS chip berører glass dekkglass.
- Slå av 3-veisventilen, slik at sprøyten kan trekke luft fra PDMS mikrokammeret (gjennom produksjonsrøret) for å skape et vakuum.
- Med den ene hånden, holder PDMS chip / glass dekkglass fast. Bruk den andre hånden til å trekke sprøytestempelet. Trekk 2-2,5 ml luft, til du kjenner motstand i håndtaket sprøyte, for å skape vakuum. Vakuumet produserer en tett forsegling mellom PDMS chip, olje, og dekk grensesnitt og begrenser mobiliteten av larven.
- Slå ventilen slik at PDMS-brikken er isolert fra sprøyten og fra omgivelsene. Som et resultat, blir et relativt stabilt vakuumnivå opprettholdes i mikrokammeret uten behov for å holde sprøytestemplet.
- Sjekk larven under stereoscope å sørge for at hele dyrekroppen er plassert inne i mikrokammeret, og at dyret er immobile. Luftrøret skal være synlig. Resten avPDMS chip skal være i kontakt med dekkglass. Merk: Se figur 2E og 2F for eksempler på dyr riktig immobilisert i brikken. Noen ukorrekte orientering er vist i figurene 2G og 2H.
- Plasser larve chip (PDMS chip + glass dekkglass) på mikroskopet. Larven chip, slangen og sprøyten skal håndteres forsiktig for å unngå avløsning av PDMS chip fra dekkglass. For en oppreist mikroskop, fikse "topp" side av brikken til mikroskopet scenen med dobbeltsidig tape (figur 1C).
- Bruk en høy forstørrelse objektiv (olje-nedsenking, 40-63X er anbefalt) å finne dyrets struktur (r) av interesse og utfører bildebehandling. I noen tilfeller kan et lavere forstørrelse være nødvendig for å identifisere det ønskede område for avbildning før den settes i høyere forstørrelse.
- Ved avbildning er fullført, slipper vakuum ved å slå ventilen til stillingensom er åpen til omgivelsene.
- Løsne PDMS chip fra dekkglass. Larven bør være umiddelbart motile.
- Bruk pinsett til å fjerne larven fra mikrokammeret og påfør larve på en drue-juice agar plate for gjenoppretting.
Tre. Indusere en Nerve Crush Skade Larve Segments Nerver
- Følg trinn 2.3 over for å isolere tidlig trinnvis 3. instar larver av den ønskede genotype. Som beskrevet i trinn 2.3 bade larvene i vann for å fjerne mat.
- Bruk en standard fly CO 2 anesthetization stasjon, med CO 2 pad holdt under en disseksjon stereo, å undertrykke larvene. Larver bør bli immotile etter plassering på CO 2 pad for 1-2 min.
- Nå plasserer en enkelt bedøvet larve på en drue juice agar plate under stereomikroskopet. Slå dyret ventral siden opp for å visualisere ventral nerve ledningen og segment nerver gjennom skjellaget (
- Bruke Dumostar nummer fem tang, klemme segmental nervene tett gjennom skjellaget i 5-10 sek. Når dette er gjort riktig, er fortsatt skjellaget intakt og kroppsveggen er ikke gjennomboret. Bemerk: Skaden kan bli utført ved forskjellige posisjoner langs de fremre-bakre kropps aksen, så lenge den ventrale nerveledning, spyttkjertler, og tarmene ikke skades. Den mest effektive skade plasseringen er mot slutten av 3. abdominal segment, som vist i Figur 3D. Skade på dette stedet skader flest nerver og er den enkleste å reprodusere uten å drepe dyret.
- Etter skaden, slår dyret slik at ventral side ned på druen plate. Det bør være i stand til å bevege hodet og spise. Hvis skaden var vellykket, da den bakre halvdel av larven blir lammet.
- Hold skadde dyr på druesaft agar plate på 25 &176, C til den ønskede tid i henhold til den eksperimentelle målet. For motoneurons begynner proksimale stubben å spire innen 8-10 timers skade 14, og den distale stubben begynner å utarte innen 6-8 hr 15. For klasse IV da sensoriske nerveceller, begynner den proksimale stubben å spire i løpet av 4-6 timer, og den distale stubben start å utarte innen 3-4 timer etter skade. Merk: med passende Gal4 drivere og fluorescerende reportere, kan den spirende og degenerasjon observeres i larven chip (for eksempel, se figur 6).
Representative Results
Larvene brikken består av et enkelt lag PDMS blokk, (a PDMS chip), hvis utforming er vist i skjematisk i figur 1. (Se også tilleggs DXF fil for å designe din egen mold). Larven mikrokammeret, vakuum port, og perimeter kanaler (Figur 1a) er 140 mikrometer fordypninger i PDMS chip. Brikken er plassert på toppen av en tidlig arrangert 3. instar larve, som hviler på toppen av et dekkglass med olje (figurene 1B og 1 C). Den oljeglassgrenseflaten mellom dekkglass og PDMS-brikken gjør det mulig for en tetning for å bli laget ved anvendelse av et mildt vakuum. Denne tetning feller larvene i kammeret, og siden tidlig arrangert 3. instar larve er litt tykkere enn kammeret, forsegling av kammeret skaper noen fysisk innsnevring på dyr, effektivt immobilizing og begrense dens bevegelse. I dette immobilisert tilstand, viss ventralkroppsstruktur, slik som den ventrale nerveledning og segmental blir ført nær dekkglass. Dette er fordelaktig for avbildning, da det i den immobiliserte tilstanden disse strukturene kan ligge innenfor arbeidsavstanden til 40X og 63X mål. Etter at vakuumet slippes, kan larven lett kan fjernes fra mikrokammeret, slik at ytterligere forsøk som skal utføres. Dette rent mekanisk immobilisering tilnærming kan holde 90% av larver i live etter kontinuerlig immobilisering perioder på inntil 1 time 12.
Vakuumet er laget av et enkelt 20 ml sprøyte, og dermed hele anlegget er lett å transportere fra et stereomikroskop, hvor posisjoneringen i kammeret er utført, til en konfokal eller epifluorescence mikroskop, der direkte avbildning er utført. Sprøyten er koplet til vakuumporten via polyetylenrør og 23 g dispense nåler (med låse nav fjernet), slik som beskrevet i trinn 1.6 til 1.14. For invertert mikroskop, slangenog sprøyten er forbundet via toppen av brikken (figurene 1B, 2A og 2 B). For stående mikroskoper, er de forbundet med en port på siden av brikken (figurene 1C, 2C og 2D). Konfigurasjonen for invertert mikroskop er noe lettere å bruke. Sprøyten trekkes å opprette en slakk vakuum (på omtrent 10 psi), som binder den olje glass-PDMS-grensesnitt for å danne en tett forsegling mellom dekkglass og PDMS-enheten, fangst og immobilisering av larven i kammeret.
Plasseringen av larven inn i mikrokammeret (trinn 2.7 til 2.10 i protokollen) er kritisk for effektiv immobilisering og overlevelse (figurene 2E-H). Hvis dyret er for stort for kammeret, (fig. 2G), eller hvis dens hode og luftrøret blir fanget mellom kanten av kammeret og dekkerleppe (figur 1H), så er det lite sannsynlig å overleve inngrepet.
Følgende er flere eksempler på bruk av larve chip for å studere ulike cellulære responser i nevroner (figur 4-7, Movie S1 og Movie S2).
Imaging av rask aksonal transport: Larven chip ble brukt til å avbilde kinesin-mediert transport av synaptiske vesikler innenfor enkelte perifere axoner (Figur 4 og Movie S1) Den antero (~ 1,0 mikrometer / sek) og retrograd (~ 0,8 mikrometer / sek. ) bevegelse av disse vesiklene kan lett studeres fra filmer samlet på en roterende disk konfokalmikroskop.
Plassering av dyr for laser mikrokirurgi:. Et sensorisk nevron dendrite ble transected ved hjelp av en pulset UV dye laser (Figur 5 og Movie S2) Protokoller for bruk av tsin metode for mikrokirurgi kan finnes andre steder 16,17. Den effektive immobilisering teknikken tillater rask time-skala endringer i den skadde nervecellen, for eksempel endringer i intracellulært kalsium (oppdaget av genetisk kodet Ca 2 + indikator GCamp3.0 18), for å bli oppdaget og målt (figur 5).
Studie av regenererende og degenerative responser på skade: Hvis dyret tillates å hvile mellom avbildnings sesjoner, larve-brikken deretter brukes til å studere cellulære hendelser som forekommer over et stort spekter av tidsskala. For eksempel, både 'regenerativ' og degenerative responser til aksonal skade, noe som finner sted i løpet av en tidsskala på 15 timer, kan avbildes på larve-brikke (figur 6). I dette eksempelet, ble axons av octopaminergic motoneurons skadet via segmental nerve knuse (figur 3), som er beskrevet i del 3 av protokollen. Den proksimale axon stubben,som gjennomgår ny spiring, og de distale aksoner, som danner åreknuter, og deretter blir fragmentert gjennom prosessen Wallerian degenerasjon, kan avbildes og undersøkt ved forskjellige tidsintervaller etter skaden.
Sporing photoconvertible fluorescerende proteiner over tid in vivo: Utvikling av photoconvertible fluorescerende proteiner, hvis fluorescens endres irreversibelt ved eksponering for UV-lys) gjør det mulig å spesifikt merke en undergruppe av proteiner i en celle, og følge skjebnen til de merkede proteiner over tid 19 , 20. Denne teknikken er vanligvis utført i cellekultur, men med larve-brikken man kan spore genetisk kodede photoconvertible proteiner innenfor definerte celler in vivo. Som et eksempel viser vi at Denda2-α-tubulin fusjonsprotein, uttrykt i klasse IV da sensoriske nerveceller, kan photoconverted i celle organer (7A og
Alle de beskrevne eksemplene (figurene 4-7 og filmer S1 og S2) ble fotografert ved hjelp av en roterende disk confocal system, bestående av en Nipkow CSU10 skanner og en C9100-50 EMCCD kamera, montert på en Axio Observer med 63X (1,5 NA) Målet olje, og drevet ved hjelp Volocity oppkjøpet programvare.
Figur 1. Skjematiske tegneserier for bruk larven chip.
(A) Et larve brikken består av en PDMS-brikken, er anført i lyseblå, festet til et glass dekkglass. Brikken inneholder 140 mikrometer tykke microfluidic kanaler, som markeres i hvitt. Den sentrale mikrokammeret er designet for å passe perfekt en tidlig iscenesatt 3. instar Drosophila larve (cartooned i lys grønn). En DXF fil med nøyaktige dimensjoner som kan brukes til å utforme støpeformen er gitt som supplerende data. (BC) Side-visninger av skjemaer for å legge en larve til en larve chip skala bar = 1,5 mm.. Larven sitter ventral side ned på et dekkglass, og kroppen sin ligger innenfor 140 mikrometer dyp mikrokammeret. En 20 ml sprøyte som er koblet til vakuuminntak port og brukes til å fremkalle en svak vakuum. Den Halocarbon olje-PDMS-glass-grensesnittet er bundet av vakuum inn i en tett forsegling, som begrenser larven i mikrokammeret. Denne tetning er lett reversibelved å slippe ut trykket fra sprøyten, hvoretter dyret gjenvinner umiddelbart motilitet. For stående mikroskoper (B), er sprøyte vakuum tilkoblet via polyetylen-rør 50 fra toppen av brikken. For invertert mikroskop (C), er disse forbindelser laget fra siden av brikken, mens "topp" av brikken er festet til objektbord via dobbeltsidig tape.
Figur 2. Bilder av PDMS chips og riktig plassering av larve.
(AD). Photographs viser PDMS chips til en snudd og stående mikroskoper. Den 23 G utleverings nålespissen har blitt satt inn i vakuum-port, som muliggjør forbindelse gjennom slange til vakuum (sprøyte). Scale bar = 1,5 mm. (EH). Drosophila larver. E og F viser eksempler på korrekt immobilisert dyr. Jo mindre dyret i F er å foretrekke hvis flere bilder over lang tidsskala (> 12 t) vil bli gjennomført. G viser et dyr som er for stor, og H viser et lite dyr som er plassert feil. Scale bar = 1,5 mm. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Nerve klemskade av segmentell nerver i Drosophila larver.
(A) tegneserie av nerve knuse assay. Segment nervene i en 3. (B) Utsikt over larve nervesystemet fra et dyr dissekert 20 timer etter nerve knuse. Farging for neuronmembraner med anti-HRP antistoffer (rød) fremhever hjernelapper, ventral nerve ledningen, og lange segmentell nerver som inneholder motoneuron og sensoriske nervecellen axons. En undergruppe av individuelle motoneurons er merket ved å kjøre uttrykk for UAS-mCD8-GFP (grønt) med m12-Gal4 driver. Celle organer og dendritter fra disse nevronene ligger i ventrale nerve ledningen, mens deres axons prosjektet til kroppen veggen muskler via segmental nervene. (Dette fører kjører også GFP ekspresjon i muskel 12 for hver larve hemisegment, som til sammen kan bli sett på som anterior-posterior striper på begge sider av dyret). Regionen skadet av forelskelsen er markert med blå stiplede linjer. Scale bar = 70 mikrometer. (C) Lukk opp utsikt over de skadede axoner, 20 timer etter skade. Venstre: denproksimale axon har gjennomgått spirer og ny vekst. Høyre: distale axon er fragmentert, med lite GFP resterende, på grunn av Wallerian degenerasjon og rydding av rusk. Scale bar = 10 mikrometer. (D) Bilder av nerve forelsket i en tidlig 3 rd instar larve. Den røde pilen peker på den ventrale nerve ledningen. Plasseringen av knuse er mot bunnen av den tredje segment, som beskrevet i protokollen tekst (protokoll 3). Bildene i D ble opprinnelig publisert i J. Cell Biol 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Time-lapse avbildning av aksonal transport av peptidergic synaptiske vesikler. Denrotte atrial natriuretisk peptid ANF tagget med GFP, UAS-ANF-GFP 21, ble uttrykt innenfor bestemte motoneurons bruker eve-RRA-Gal4 driver 22. Live-avbildning av segmentell nerver avslører rask transport av ANF-GFP merket peptidergic vesikler i axons. Se også Movie S1. (A) Løse rammer av motoneuron axoner fra live-time-lapse bildebehandling. Grønne, røde og blå pilene viser eksempler på antero, stasjonære og retrograd vesikler, henholdsvis. Scale bar = 5 mikrometer. (A ') Individuelle tidsrammer fra filmen ble slått sammen ved hjelp ImageJ. (B) En kymograph generert fra time-lapse avbildning av ANF-GFP transport, ble generert fra en samling av enkeltbilder som strekker seg over ett minutt av bildebehandling tid ved hjelp av "Multiple kymograph 'plug-in for ImageJ 23. (C) Kvantifisering av gjennomsnitts segmentell hastigheter, som ble beregnet ut fra bakken av segmenterte spor i kymographs. Den grønne linjen presentasjonts antero segmental hastighet (n = 543) og den blå linjen viser retrograd segmental hastighet (n = 548) av vesikler fra 10 kymographs. (D) Kvantifisering av partikkeltetthet. Partikkeltetthet ble målt med antall antero (vist i grønt bar), stasjonære (vist i rød søyle) og retrograd (vist i blått bar) partikler per 100 mikrometer av axon lengde fra 10 kymographs. Dataene i denne figur ble også tidligere publisert i Ghannad-Rezaie et al, PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
Figur 5. Bruk av larven chip for lasermikrokirurgi og kalsium-avbildning.
En Dendritt fra en klasse IV sensorisk nevron er transected av med kraftige laserimpulser fra en pulset UV dye laser. Protokoller for bruk av denne metode for mikro kan finnes andre steder 16.. Den effektive immobilisering i larven chip gir mulighet for raske endringer i intracellulære kalsiumnivået å bli studert av levende avbildning. I dette eksempelet, ble den genetisk kodet kalsium indikator GCaMP3.0 uttrykt i klasse IV dendrittiske arborization (C4da) sensoriske nerveceller ved hjelp av PPK-Gal4 driver. (A) Tid-lapse bilder av GCaMP3.0 intensitet var falsk farget i henhold til fargen intensitetsskala for å indikere endringen i intensitet over tid. Enkeltbilder ble hentet fra en time-lapse film (Movie S2) fotografert på en roterende disk konfokalmikroskop på 5 bilder / sek. (B) Kvantifisering av kalsium dynamikk som svar på laser mikrokirurgi. Normalisert ganger endring av soma GCaMP3.0 fluorescens intensitet (ΔF/F0) av enkelte nerveceller ble plottet mot tid (n = 7, vises i grått). Den gjennomsnitt ΔF/F0 var representert i oransje. Toppen økning på GCaMP3.0 intensitet ble observert mellom 1-2 sek etter skade. Bakgrunnen ble subtrahert fra den rå G-CaMP3.0 fluorescensintensitet. Dataene i denne figur ble også tidligere publisert i Ghannad-Rezaie et al, (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12.
Figur 6. Imaging aksonal spirende og degenerasjon bruker larven chip. Representative confocal bilder av den proksimale stubben (til venstre) og distal stubbe (til høyre) av octopaminergic motoneuron axons på ulike tidspunkter etter nerve knuse. Bilder ble tatt på lignende steder som vist på figur 3C. Disse nervecellene er merket ved å kjøre uttrykk for et UAS-mCD8-RFP transgenet ved hjelp av Tdc2-Gal4 driver 24,25. Cellen organer for disse nevronene ligger i ventrale nerve ledningen 24. Tre individuelle axoner kan sees i et enkelt segmental nerve, og kan lett løses fra hverandre. Dette er en ideell situasjon for studiet av individuelle cellulære hendelser, for eksempel fragmentering av degenereres axoner, som er komplett innen 15 timer for disse nevronene. Bildene ble hentet fra levende dyr som bruker larven chip på 63X forstørrelse på en roterende disk konfokalmikroskop. Scale barer = 10 mikrometer for venstre paneler (proksimale stubber) og 20 mikrometer for høyre panel (distal stubber). Klikk her for å se større bilde.
Figur 7. Bruke larvenchip å spore photoconverted fluorescerende proteiner over lange tider og avstander i levende dyr.
I dette eksemplet er et fusjonsprotein av photoconvertible fluorescerende protein Dendra2 19, fusjonert til α-tubulin, blir uttrykt fra et UAS-Dendra2-α-tubulin transgenet i klasse IV dendrittiske arborization (C4da) sensoriske neuroner, ved hjelp av PPK-Gal4 driver 26.. (A) Skjematisk for photoconversion eksperimentet. Cellen kroppene til de C4da nevroner ligger i periferien og utvide axons gjennom segmental nervene å danne synaptiske terminaler i nerve ledningen. Den Dendra2-α-tubulin i et delsett av celler organer i den bakre halvdel av dyret utsettes for photoconversion ved UV-belysning etter 6 sek ved å bruke en standard DAPI filter med Hg-lampe (venstre tegneserie). Etter tid, kan det photoconverted Dendra2-α-tubulin bli oppdaget på synaptiske terminaler i ventrale nerve ledningen. Dette indikerer at tubulin protein har blitt tranutfordret over en lengre avstand (for ~ 1-2 mm). Scale bar = 1 mm (B) Eksempel bilder av Dendra2-α-tubulin i en klasse IV sensorisk nevron celle kroppen før og etter photoconversion. Scale bar = 5 mikrometer. (C) eksempel bilder av synaptiske terminaler for klasse IV sensoriske nevroner på enten 0 timer eller 48 timer etter photoconversion av cellen organer. Den spesifikke utseende photoconverted Dendra2-α-tubulin på synaptiske terminaler etter tid innebærer at proteinet reiste fra cellekroppen til axon endestasjonen. Photoconversion og bildebehandling på alle tidspunkter ble gjennomført i larve chip. Scale bar = 15 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.
Movie S1. Laser mikrokirurgi og kalsium avbildning av en C4da nevron. Et pulset UV-laser ble brukt til tversgående en primær dendrittiske gren. Laser tran indusert en rask økning i GCaMP intensitet, som begynte på stedet av skader og reiste til cellekroppen. UAS-GCaMP3.0 18 ble uttrykt ved hjelp av C4da spesifikk PPK-Gal4 driver 26. Filmene var falske farget for å indikere den relative intensitetsnivåer GCaMP3.0. Time-lapse bildebehandling ble gjennomført med en roterende disk konfokalmikroskopi på 5 bilder / sek.
Movie S2. Rask aksonal transport av ANF-GFP i motoneurons.
Rotta atrial natriuretisk peptid ANF tagget med GFP, UAS-ANF-GFP 21, ble uttrykt innenfor bestemte motoneurons bruker eve-RRA-Gal4 driver 22. Transporten av disse peptidergic vesikler innenfor larve segmentell nerver ble fotografert på larven chip på 300 msek / ramme ved hjelp av en roterende plate konfokalmikroskop.
Supplerende Figure1 (DXF fil)
DXF fil for silisium mold fabrikasjon. Denne filen er beregnet for negativ fotoresist maske (mørk innlevert maske for SU-8) på en 4 tommers silisiumskive. Den andre rad inneholder fem formene for å gjøre larven chips som brukes i denne protokollen. Hver av disse brikkene (i rad 2) inneholder en ~ 5,4 mm x 1,5 mm kammer designet for å passe et tidlig stadium 3. instar larve. Den første rekke (rad 1) inneholder et større kammer (~ 5,4 mm x 2 mm), mens den tredje rekke (rad 3) inneholder et mindre kammer (~ 4,4 mm x 1,5 mm). Disse kan benyttes med larver av større og mindre størrelser, henholdsvis. Scale bar = 2 mm.
Discussion
Å gjøre eller skaffe larven chip:
Larvene brikken består av en PDMS-blokken (kalt "PDMS chip") festet til en glass dekkglass. Protokollen i trinn 1 beskriver fremgangsmåten for å lage og bruke larva chips, forutsatt en SU-8 mold er tilgjengelig. SU-8 mold er microfabricated av photolithographically mønster en 140 mikrometer tykt SU-8 fotoresistsjiktet på en silisiumskive (for detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Som microfabrication av SU-8 mold krever tilgang til spesialisert utstyr, anbefaler vi å bestille den fra en microfabrication anlegget (f.eks. LNF-anlegget ved University of Michigan 14), eller fra et støperi ved å sende dem chip design som er gitt som en tilleggsfilen. Dersom man ønsker å endre utformingen av PDMS-brikke (for eksempel for bruk med larver av forskjellige størrelser), et CAD-programvare som håndterer DXF filer (f.eks Autocad) kan brukes. En SU-8 mugg kan også gjøres i huset å følge instruksjonene i Mondal et al. 27 Mange lesere kan finne det praktisk å bare få en prøve PDMS chip for å prøve ut den teknikken før fabrikere sine egne brikker. Dette vil bli gjort fritt tilgjengelig på forespørsel.
Bruk av microfluidic 'larve chip "for direkte avbildning:
Den immobiliserende metode i larven chip unngår bruk av bedøvelsesmidler, og i stedet innebærer trykk, via anvendelse av et vakuum, for å begrense dyrets bevegelser. Mens dyr kan overleve immobilisering i brikken for flere timer 12, en kortere immobilisering periode (5-15 min) er anbefalt. Dette er nok tid for imaging mange cellulære hendelser av interesse, inkludert endringer i intracellulært kalsium, eller rask aksonal transport. Dette er også tilstrekkelig tid til ønskede manipulasjoner i levende dyr, for eksempel laser baserte mikrokirurgi, fotobleking, og photoconverSion.
For å studere arrangement i lengderetningen over lengre tidsrom i et enkelt dyr, kan dyrene bli plassert inn i brikken og avbildes flere ganger, separert ved hvileperioder. Drue juice agar plater er ideelle for hvile mellom bilde økter, som de gir en enkel matkilde og fuktighet. Flere bildebehandlings økter gjør påvirker larve overlevelse til en grad, ettersom hver økt bærer noen risiko for å skade dyret (se del 2 i feilsøking, nedenfor). Dyr kan rutinemessig avbildes> 5 ganger i løpet av to dager med en større enn 50% overlevelsesrate. Siden dyrene ikke bedøves, de friske og motile umiddelbart etter frigjøring av vakuumet i brikken. Det er derfor ikke behov for utvinning tid mellom avbildnings sesjoner, slik at tidsavstanden mellom sesjoner er fleksibel og kan bli justert til målene for forsøket.
Feilsøking:
Den vanligste teknisk ersaksøker med larve chip og anbefalte løsninger er følgende:
(1) Dyret beveger seg for mye. For mye mobilitet kan interferere med de bildedannende mål. De vanligste årsakene til dette i larven chip er a) dyret er for liten for chip, eller b) vakuumtrykket brukes under immobilisering trinnet er kompromittert. Larven chip beskrevet i denne protokollen er designet for tidlig iscenesatt 3 rd stadiums larver. Den optimale størrelse for dyret er 3,5-4 mm i lengde (langs anteroposteriøre akse). For å sikre at vakuumtrykket er tilstrekkelig, Trekk sprøyten 2-2,5 ml, eller til du kjenner motstand i håndtaket. En indikasjon på at vakuumet virker, er at små bobler i den ytre kanal kan ses å bevege seg langsomt mot vakuumkilden. En annen indikasjon på at dekk bør alltid ha med brikken når brikken er løftet fra toppen (og dette er den anbefalte metode for transport av kammeretnår larvene er posisjonert og vakuumet er på). Vakuumet kan bli svekket hvis det er sprekker i slangen, eller om det er olje i slangen. Dette kan enkelt løses ved å erstatte 23 G dispense nålespissen og polyetylen-50 rør (fra trinn 01.06 til 01.14).
(2) Dyret dør etter bildebehandling i brikken. Fremgangsmåten er beregnet til å forårsake minimal belastning på dyret, og dyr av villtype genotype har en> 90% overlevelse, selv etter en time for immobilisering på brikken 12.. Siden enkelte genotyper kan være mindre motstandsdyktige mot stress av chip, først sjekke at vill type dyr (for eksempel, Canton S) overleve immobilisering teknikk. a) Den vanligste årsaken til dødelighet er korrekt posisjonering av larven (se figurene 2G-H). Dersom deler av hårstråene, hodet og luftrøret er ikke helt og holdent inne i kammeret, så de kan bli ødelagt i løpet av immobilisering, og enlarve som er for stor for chip (> 4 mm) er mindre sannsynlighet for å overleve. b) En mindre vanlig årsak til dødelighet er bruken av for mye trykk eller vakuum ved lasting av brikken. Når den er riktig plassert i brikken, trykket som genereres av vakuum er godt tolerert. Men overdreven press, enten fra vakuum eller i den innledende fasen av posisjonering dyret kan være et problem. Det er best å lære graden av press som trengs empirisk ved forsøk med villtype larver av riktig størrelse. c) Hvis for mye Halocarbon olje dekker dyrets luftrøret dyret kan potensielt ha problemer med langsiktig overlevelse. Oljen spiller flere viktige roller i chip: er det viktig for etableringen av vakuum, optikken under bildebehandling, og det motvirker uttørking i brikken. Men overdreven olje bør unngås. (Dette kan også føre til at olje i røret og sprøyten, kompromittere vakuum). De foreslåtte protokoll strøk bare ventral side av larven med olje, deretter removes overflødig olje ved plassering av larven på en ren dekkglass før de overføres til den endelige dekkglass for bildebehandling. d) fototoksistet kan oppleves fra bildebehandlings økten. Som med alle levende bildebehandlingsprogrammet, er det ideelt å bruke korte eksponeringstider med lav intensitet laserlys, noe som er best oppnås ved hjelp av en svært følsom kamera eller detektor. Prøv å minimere belysning med UV-lys, inkludert bredspektret lys skapt av Hg lyskilder.
Andre problemstillinger og fremtidige retninger:
Siden denne metoden ikke utnytter bedøvelsesmidler, fortsetter dyrets hjerte å slå. Dette skaper noen uunngåelig mobilitet, noe som påvirker bilde enkelte steder mer enn andre. Eksemplene her viser at den ventrale nerve ledningen, segmental nerver, og kroppsveggen lett kan avbildes uten innblanding fra hjerterytme. I tilfeller der hjerterytme påvirker bildebehandling, kan de vanlige bevegelser noen ganger korrigeres for medi analyseprogramvare (for eksempel bildestabilisator plugin for ImageJ). Dette fungerer godt når enkelte objektene beveger seg på en rask tidsskala (for eksempel ~ 1 mikrometer / sek for rask aksonal transport) eller på en veldig langsom tidsskala (minutter til timer). Imidlertid, når det objekt (er) av interesse trekk med en rekke hastigheter og retninger, kan det være vanskeligere å korrigere for hjerterytme indusert bevegelser.
En annen sak er liten variasjon i optikk fra dyr til dyr, eller mellom flere imaging økter av samme dyr i brikken. Jo dypere objektet av interesse er innen dyret, jo større denne variasjonen blir. Segment nerver og ventrale nerve ledningen er vanligvis altfor dypt inne så dyr til å bli fotografert på en vanlig mikroskop. Men det mildt press opplevd i larven chip skyver disse strukturene svært nær skjellaget og dekkglass. Den nøyaktige avstanden til disse strukturene fra dekk vil ha små variasjoner fra trIAL til rettssaken. Variasjonen for objekter lukke skjellaget, slik som celle likene av sensoriske nerveceller, er mindre. Det er derfor viktig, spesielt for å gjøre målinger av intensiteten til å utnytte et stort antall dyr og uavhengige forsøk for å redegjøre for variasjon i optikken.
Mens de som vises her eksempler har fokusert på prosesser i nevroner, bør tilnærmingen være mottagelig for bildebehandling noen struktur i dyret som kan bringes i fokus dybden av mikroskop mål. Dette inkluderer skjellaget, kroppen veggen muskler, og deres NMJs. Trachea på den ventrale side av dyret og potensielt deler av fordøyelseskanalen kan også avbildes. Dyret kan også være plassert med sin dorsale side mot dekkglass for kortvarig avbildning av strukturer nær den dorsale overflate. Evnen til å bildestrukturer dypt inne i dyret er begrenset av arbeidsavstanden til mikroskopobjektiv anvendes. Strukturer som imVagina-plater er utilgjengelige for høy forstørrelse (f.eks 40X) mål.
Larven chips som er beskrevet i denne protokollen er designet for larver tidlig i det 3. instar scenen (som varierer i størrelse 3,5 til 4 mm). Men mange interessante spørsmål krever bildebehandling på ulike larvestadier. Mindre brikker for å imøtekomme 2 nd stadiums larver, eller større chips å imøtekomme sene 3 rd instars kan enkelt utformet etter samme prinsipp. (Supplerende Figur 1 inneholder en lett modifiserbare DXF fil for å lage silisium muggsopp med endrede kammerstørrelser). Den enkle prinsippet for reversibel tetning kan også festes på andre organismer som for eksempel C. elegans eller sebrafisk, med hoved variant blir kammeret størrelse. En nyttig fremtidige retningen er å utforme en chip som kan immobilisere mange dyr på en gang, for å bruke for screening formål. Men for denne, vil utformingen må være vesentlig forskjelligfra dagens enhet, der spørsmål om plassering av dyr i brikken må behandles med for hvert dyr uavhengig.
Den nerve knuse analysen for å studere skade responser i larve perifere nerver:
Den nerve knuse analysen beskrevet her for larve segmentell nerver er en enkel metode for å innføre en skade i perifere axoner i Drosophila. Fordelene ved denne fremgangsmåte omfatter: a) det er lett å gjennomføre med standard verktøy som finnes i et Drosophila lab (et stereomikroskop CO to source-og tang), b) den kan gjennomføres raskt for mange dyr, slik biokjemisk analyse av nerveledning etter skade gjennomfør 14, c) de molekylære og cellulære responser til denne skaden er svært reproduserbare 14,15,28 og kan brukes til å oppdage prosesser som også er viktige i virveldyr nevroner 29,30.
Alternative metoder for å skade nerveceller er å focusa høyeffekts laser, for eksempel en pulset-UV eller femtosecond laser, for å bryte en axon via laser mikro 17,31-33. Larvene brikken er en ideell metode for posisjonering av dyr for en slik mikrokirurgi. Imidlertid, på grunn av små forskjeller i optikken mellom studier diskutert ovenfor, kan laserbasert metode være vanskeligere å reprodusere i larver, spesielt i larve segmentell nerver. Også laserbasert aksonal skade krever mer tid for å plassere hvert dyr, og derfor er vanskeligere å utføre i stor målestokk (med et stort antall dyr).
Feilsøking:
Den hyppigst påtruffet teknisk problem fra nerve forelskelsen er død av skader på indre organer. Når du driver trengselen, er det viktig ikke å klemme den ventrale nerve ledningen, spyttkjertlene, eller tarmen. Det er også viktig ikke å punktere skjellaget. Disse problemene er best unngås ved å bringe pinsett i en 45 ° vinkel til skjellaget surface (se figur 3).
Kvaliteten på tang har en stor innvirkning på effektiviteten av knuse-og overlevelses etterpå. Vi anbefaler Dumostar nummer fem tang. For å beholde sin skarphet, må pinsett håndteres med forsiktighet, ikke brukes til andre formål, og erstattet når de blir sløve eller bøyd.
Størrelsen av dyret kan også påvirke effektiviteten av knuse. Små dyr (mindre enn 3 mm i lengde) er mye mindre sannsynlighet for å overleve skaden. Med store dyr, (vandrende 3 rd instars), er det vanskeligere å finne de nervene og unngå skade på de større spyttkjertlene og tarmer, og det er mindre tid til å studere skade svar før forpupping. Denne nerve knuse blir mest effektivt utført i begynnelsen 3. instar larver (som er ~ 3 til 4,5 mm i lengde langs anteroposteriøre aksen).
Den matkilde at dyret er hevet over kan påvirkestyrken på skjellaget og overlevelse etter trengselen. Det anbefales å heve dyr i mat laget av en standard gjær-glukose oppskrift.
Den beste metoden for å lære hvordan du gjør knuse effektivt er å øve på mange dyr, først med det primære målet om å oppnå overlevelse (og ikke pupation) 24 timer etter trengselen. Nybegynnere har normalt en lav overlevelse (f.eks 10%), men når teknikken er lært, kan overlevelsen nå ~ 90%.
Andre problemstillinger og fremtidige retninger:
Den knuse analysen gir en kraftig metode for å studere spirende av axon proksimale til skade området og degenerasjon av axoner og synapser distalt for skaden området. Selv om utbredelsen av degenerasjon variere mellom ulike typer nevroner, er de svært reproduserbare innenfor et gitt neuron-type, som gir bevis på reproduserbarheten av skaden assay.
I kontrast til den "regenerative" sproutingrespons observert i proksimale axons er mer utfordrende å studere. Alle aksoner i segmental nerve initiere omfattende spirende nærheten av skadestedet (for eksempel, se figur 6 og figur 3). Men graden av spirende kan variere fra nervecelle til neuron, og det er vanskelig å kvantifisere. En tilsvarende grad og variasjon i spirende kan observeres etter flere fokale lesjoner av single motoneurons i segmental nerver introdusert ved hjelp av en UV Pulsed dye laser. Vi tolker at nondiscriminate retningen på den spirende skyldes fravær av veiledning pekepinner i segmentell nerver. I kontrast, sensoriske nervecellen axons skadet av laser i nærheten av sine celle organer gjennomgå ny aksonal vekst i samme retning som den tapte axon 34. Axoner i denne regionen av dyret er trolig utsatt for mer spesifikk posisjonsinformasjon for veiledning av de regenererende axoner. Miljøet innen segmental nervene er usannsynlig å ha mye resemblance til miljøet som axons opprinnelig navigert under deres veiledning i embryoet, dermed ikke forventes å ha opplysninger å veilede regenererende axons.
En annen begrensning for å studere regenerering bruke den segmental nerve knuse analysen er at skadde sensoriske og motoneuron axons fortsatt ha en betydelig avstand til å dekke (0.25-1 mm) for å nå sine mål, og en begrenset tidsramme (<3 dager) før dyret gjennomgår pupation. En fersk studie har identifisert en genetisk manipulering av prothoraciotropic hormon reseptor som tredobler varigheten av 3. instar larvestadiet 35. Dette manipulasjon vil forlenge tidsrammen for å studere utvinning og degenerasjon av nerveceller etter skade betydelig, til ni i stedet for tre dager. Dette kan være lang nok til å observere nye hendelser, som for eksempel ny tilkobling av en skadet akson med sin postsynaptiske mål, spesielt hvis skaden er forårsaket nær den synaptiske ending.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation, (stipend nummer IOS-0842701 til CAC), og National Institute of Health (R00MH080599 til BY, R21 NS062313 til NC, og NS069844 til CAC). Vi ønsker å takke James Schutt, Emily Han, og Leni Truong for teknisk support, og Bloomington Stock senter for flueliner. Alle brikkene ble fabrikkert på Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
