Summary
זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.
Abstract
הדמיה חיה היא טכניקה חשובה לחקר תהליכים ביולוגיים של תא, אולם זה יכול להיות מאתגר בבעלי חיים. הציפורן השקופה של זחל דרוזופילה עושה את זה אורגניזם מודל אטרקטיבי למחקרי הדמיה לחיות. עם זאת, אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים במיקרוסקופ. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה וקלה לשימוש עבור לשתק והדמית זחלי דרוזופילה על polydimethylsiloxane (PDMS) מכשיר microfluidic, שאנו מכנים 'שבב הזחל'. שבב הזחל מורכב מmicrochamber PDMS דוקים שמצורף לcoverslip זכוכית דק, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים ומביא מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וגוף קיר שרירים, בתוך בסמיכות לcoverslip. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך, ימנע את השימוש של anesthetics וכימיקלים, המאפשר הלימוד של מגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים. מאז זחלים להתאושש בקלות מהקיבוע, הם יכולים להיות חשופים בקלות לפגישות הדמיה מרובות. זה מאפשר למחקרים ארוכי טווח על קורסי זמן שנעו בין שעות עד ימים. פרוטוקול זה מתאר צעד אחר הצעד כיצד להכין את השבב וכיצד לנצל את השבבים עבור הדמיה חיה של אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אירועים אלה כוללים את ההובלה המהירה של האברונים באקסונים, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן. יישום נוסף של השבב הוא ללמוד משובי ותגובות ניווניות לפגיעה באקסון, ולכן החלק השני של פרוטוקול זה מתאר נוהל חדש ופשוט לפציעתם של האקסונים בעצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי.
Introduction
זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, נוצל כאורגניזם מודל במשך 100 שנים, והוכיח סייע בהגדרת איתות בסיסית ומסלולים התפתחותיים הנשמרים מחסרי חוליות לאדם. ההדמיה חיה היא גישה חשובה ללימוד מנגנונים תאיים, ותכנית הגוף הפשוטה וציפורן שקופה של זחל דרוזופילה הופכת אותו למערכת אטרקטיבית להדמית חיה, במיוחד שכן יש כלים גנטיים רבים זמינים לביטוי חלבונים מתויגים fluorescently בסוגי תאים ספציפיים.
אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים למיקרוסקופ. גישות קיבוע קונבנציונליות כוללות נתיחה 1,2 או שימוש בכלורופורם, אשר שניהם להרוג את בעלי החיים. ההרדמה אתר 4 וisofluorane 5-8 היו בשימוש גם. בעוד הרדמה מספקת יתרונות רבים, הם גם מעכבים את הפעילות עצבית ופיזיולוגיה חשובה (כולל פעימות הלב) 9-11, ולכן יכול להשפיע על התהליך למד וליצור לחץ על בעלי החיים. ישנם גם חששות בטיחות אדם לעבודה עם אתר וisofluorane.
אנחנו פיתחנו שיטה ללא שימוש בסמים כדי לשתק זחלי דרוזופילה במכשיר אחד PDMS microfluidic השכבה, שאנו מכנים 'שבב הזחל' 12. פרוטוקול זה יתאר כיצד להשיג או לעשות שבב הזחל, ואיך לנצל אותו להדמיה לחיות בתחילת מבוימת זחלי instar 3 rd. השבב מורכב מmicrochamber דוקים, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים באמצעות כוח מכאני עדין. שיטת הקיבוע מביאה מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וקיר שרירי גוף, בתוך בסמיכות לcoverslip זכוכית. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים כאלה עם aper המספרי גבוהture יעדים (ההגדלה גבוהה).
יתרונות של שבב הזחל על פני שיטות קונבנציונליות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (i) שימוש בשבב הזחל מחליף את השימוש בכימיקלים, המאפשר הדמיה vivo של חיות unanesthetized. (Ii) זחלים להתאושש מייד לאחר שחרורו מהשבב (בניגוד לתקופת החלמה 2 שעות עבור 8,13 isofluorane). זה מאפשר הדמיה על סולמות זמן רחבים, החל מאלפיות שניים לדקות, שעות וימים. (Iii) השימוש של PDMS, שהוא חומר חדיר גז, מאפשר לדיפוזיה מתמדת של חמצן / אוויר מהסביבה אל תוך גוף הזחל. (Iv) השבב הוא קל ובטוח לשימוש, ו( v) זה לשימוש חוזר, ויכול להיות מיוצר בעלות מינימאלית.
בנוסף להוראות לשימוש בשבב הזחל, פרוטוקול זה יספק כמה דוגמאות של השימוש בו כדי ללמוד אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אלה כוללים הדמיה חיה של axonaתחבורת ליטר, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן.
יישום נוסף של השבב הוא ללמוד את תגובות עצביות לפגיעה באקסון. לשם כך הליך נוסף מתואר (בחלק 3) לפציעתם אקסונים בתוך עצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי. assay הפשוט זה יכול להתבצע גם במהירות וreproducibly תחת סטראו לנתיחה סטנדרטי, המאפשר לבעלי חיים רבים להיות מעובד באותו הזמן. תגובות תאיות לפציעה ניתן ללמוד על ידי הדמיה לחיות בשבב הזחל.
Protocol
1. מה שהופך את שבב PDMS
כדי להפוך את שבב PDMS מן העובש SU-8, בצע את שלבי 1.1-1.7. אם שבב הוא ביד, אבל צריך התאסף לשימוש, דלג לשלב 1.8.
- מערבבים 45 גרם של בסיס PDMS ו4.5 גרם של סוכן ריפוי (10:01 יחס) מערכת PDMS במכל פלסטיק חד פעמי קטן ומערבבים אותם באמצעות מקל פלסטיק ומערבבים היטב.
- מניחים את המכל במכל ואקום (למשל ייבוש) עבור 10 דקות כדי להסיר כל בועות.
- מניחים את התבנית בSU-8 בתחתית 150 מ"מ בצלחת פלסטיק בקוטר ויוצקים באיטיות את תערובת PDMS על העובש. יש להיזהר שלא ליצור בועות תוך לשפוך PDMS.
- Cure PDMS בתנור (או חממה) ב-C ° 650 במשך 4 שעות.
- הסר את עובש PDMS/SU-8 נרפא מהתנור ולתת לו להתקרר במשך כמה דקות.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך את PDMS נרפא לאורך הקצה של עובש SU-8 ולנתק אותו מSU-8 עובש.
- מחלקים את לוח PDMSלתוך שבבי PDMS בודדים באמצעות סכין גילוח.
- באמצעות מחט מחלק 21 G, לתקוע חור ביציאת הוואקום (מתואר באיור 1 א) של שבב PDMS.
- קח את המחט מחלק 23 G ולסובב את קצה המחט מבסיסו כמה פעמים כדי לשבור את המחט להטות את מהרכזת המנעול.
- הכנס את קצה מחט 23 G לתוך חתיכה קטנה של צינורות פוליאתילן, כך שהצינורות מכסה לפחות מילימטר של המחט. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את צינורות העודפים מהמחט. זה יוצר טבעת פלסטיק סביב קצה אחד של המחט, אשר תיצור חותם כאשר מוכנס לתוך נמל צריכת ואקום.
- לשימוש עם מיקרוסקופ הפוכה (איורים 1B ו 2A-B): הכנס את קצה מחט 23 G לתוך החור של נמל החלל הריק. לשימוש עם מיקרוסקופ זקוף (1C דמויות ו2C-D): לתקוע חור שני בצד של שבב PDMS עם dispe 21 Gnsing מחט; החור הזה יספק גישה לחור הראשון מהצד. לאחר מכן הכנס את קצה מחט 23 G עם טבעת צינור לתוך החור בצד. מניחים נייר דבק דו צדדי על גבי שבב PDMS לאטום את החור העליון (איור 1 ג).
- קח פיסת צינורות פוליאתילן שהוא כ 20 סנטימטר באורך. חבר צד אחד של הצינור לקצה המחט שמוחדר ליציאת הוואקום.
- חבר הצד השני של צינורות האחרים לאחת מהיציאות של שסתום 3 כיוונים (ראה ברזלים '3-דרך 'ברשימה של חומרים)
- צרף מזרק 20 מ"ל לאחת משתי יציאות הנותרות. הנמל האחרון הוא פתוח לסביבה.
2. באמצעות שבב הזחל עבור הדמית חיה
- נקה את שבב PDMS עם נייר דבק שקוף. צרף חתיכת הסרט לעומקו של שבב. ודא הקלטת נוגעת במשטח PDMS כולו, ולאחר מכן לקלף את הקלטת.
- חזור על השלב מעל 2-3x כדי לוודא שישאין חלקיקים או שמן (עודפים מניסויים קודמים) על פני השטח של שבב PDMS. מאז שבב PDMS הוא לשימוש חוזר, זה מאוד חשוב להסיר שאריות שמן כפי שהוא יכול להשפיע על ההידבקות של PDMS לזכוכית ולגרום לאיטום לקוי.
- העבר (ליקוט כלומר) מוקדם זחלי instar 3 rd לצלחת פטרי המכילה מים. (זחלי שלב הליקוט 3 rd instar נמצאים במזון, ולא בצד של בקבוקון התרבות). לרחוץ את הזחלים במים כדי להסיר את המדיום לתרבות.
- קח coverslip זכוכית נקי ומקום טיפה קטנה של Halocarbon 700 שמן במרכזה.
- בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים נקי, מוקדם מבוים זחל instar 3 rd מהמים (הזחל צריך להיות ~ 3.5-4 מ"מ אורך). מניחים את החיה בקצרה על מגבת לנגב או נייר קלה להסרת עודפי מים, ולאחר מכן למקם אותו בטיפת השמן. הירידה צריכה להיות קטנה מספיק כך שקנה הנשימה של הזחלים אינן מצופים. בואו STA הזחלy בטיפת השמן ל10 שניות.
- הסר את הזחל מטיפת השמן ולאחר מכן הנח אותו על coverslip זכוכית נקי.
- העבר את הזחל למשנה coverslip זכוכית הנקי. צעד זה מסיר את עודפי שמן.
- שים לב לנטיית זחל. הדמיה עצבי חוט ומגזרי העצביים, בצד הגחוני של זחל צריך לשבת על coverslip. צידו הגבי, המתאפיין בשני צינורות לקנה הנשימה אורך, צריך לפנות מעלה. הערה: זה הוא הנטייה הזחל מעדיף באופן טבעי.
- מניח בעדינות את שבב PDMS על גבי הזחל. הזחל צריך להיות מיושר לאמצע מרכז microchamber, עם הזנב שלה מכוון ליציאת הוואקום. היזהר שהזחל לא נוגע בקצוות של החדר. זה חשוב במיוחד למסופים הקדמי וקנו נשימה אחורית. הערה: צעד זה נעשה הכי טוב תחת סטראו.
- לדחוף את שבב PDMS נגד coverslip הזכוכית כדי להשיג חותם טוב. ודא שהזחל הוא לגמרימוקף microchamber כאשר שבב PDMS נוגע coverslip הזכוכית.
- לעבור את שסתום 3 כיוונים על כך שהמזרק יכול לצייר אוויר מmicrochamber PDMS (באמצעות הצינור) כדי ליצור ואקום.
- ביד אחת, החזק את coverslip שבב PDMS / כוס בחוזקה. השתמש ביד השנייה כדי למשוך את בוכנת המזרק. לסגת 2-2.5 מיליליטר של אוויר, עד שההתנגדות מורגשת בידית המזרק, כדי ליצור ואקום. הוואקום מייצר חותם חזק בין שבב PDMS, שמן, וממשקי coverslip ומגביל את הניידות של הזחל.
- לעבור את השסתום מכך ששבב PDMS הוא מבודד מהמזרק ומן הסביבה. כתוצאה מכך, רמת ואקום יציבה יחסית נשמר בmicrochamber ללא הצורך להחזיק את בוכנת המזרק.
- בדוק את הזחל תחת stereoscope לוודא כי הגוף של בעלי החיים כולו ממוקם בתוך microchamber, וכי בעל החיים הוא נייח. קנה הנשימה צריכה להיות גלויה. שארשבב PDMS צריך להיות במגע עם coverslip. הערה: ראה 2E דמויות ו2F לדוגמאות של בעלי חיים משותקים בצורה נכונה בשבב. כמה אוריינטציות שגויות מוצגות איורים 2G ו 2H.
- הנח את שבב הזחל (שבב PDMS + coverslip זכוכית) על המיקרוסקופ. שבב הזחל, צינורות ואת המזרק צריך להיות מטופל בזהירות כדי להימנע מניתוק של שבב PDMS מן coverslip. למיקרוסקופ זקוף, לתקן את הצד 'העליון' של השבב לבמה מיקרוסקופ עם קלטת דו צדדית (איור 1 ג).
- השתמש מטרת ההגדלה גבוהה (נפט טבילה, 40-63X מומלץ) כדי לאתר המבנה של בעל החיים (ים) של עניין ולבצע את ההדמיה. במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה הצורך בהגדלה נמוכה כדי לזהות את האזור הרצוי להדמיה לפני שעברתי להגדלה גבוהה יותר.
- כשהשלימה הדמיה, לשחרר את הוואקום על ידי מיתוג את השסתום לתפקידכי הוא פתוח לסביבה.
- ניתוק שבב PDMS מן coverslip. הזחל צריך להיות מייד ניע.
- שימוש במלקחיים כדי להסיר את הזחל מmicrochamber ומניח בעדינות את הזחל על צלחת אגר מיץ ענבים להתאוששות.
3. גרימת פציעה למחוץ עצב לעצבי הזחל מגזרי
- בצע את השלב 2.3 לעיל כדי לבודד מוקדמים מבוים 3 זחלי instar rd של הגנוטיפ הרצוי. כמתואר בשלב 2.3 לרחוץ את הזחלים במים כדי להסיר את האוכל.
- השתמש בתחנת הרדמה סטנדרטית זבוב CO 2, עם CO 2 כרית נשמרת תחת סטראו לנתיחה, כדי להכניע את הזחלים. זחלים צריכים להיות immotile לאחר מיקום על CO 2 כרית ל1-2 דקות.
- כעת הנח את זחל הרדים יחיד על צלחת אגר מיץ ענבים תחת סטראו. הפעל את הצד הגחוני בעלי החיים עד כדי להמחיש את חוט עצב הגחון ומגזרי עצבים דרך ציפורן (
- שימוש במספר-5 מלקחיים Dumostar, לצבוט את העצבים מגזרי בחוזקה באמצעות הציפורן ל5-10 שניות. כאשר זה נעשה בצורה נכונה, לציפורן נותרה בשלמותה ואת קיר הגוף אינו מנוקב. הערה: הפגיעה יכולה להתנהל בעמדות שונות לאורך ציר הגוף הקדמי, אחורי, כל עוד חוט עצב הגחון, בלוטות רוק, ומעיים אינן פגומות. מיקום הפגיעה היעיל ביותר הוא לקראת סוף קטע בטן 3 rd, כפי שמוצג באיור 3D. פגיעה בניזקי מיקום זה רוב העצבים, והוא הקל ביותר להתרבות בלי להרוג את בעלי החיים.
- לאחר הפציעה, להפוך את בעלי החיים כדי שהצד למטה על צלחת ענבי גחונה. זה צריך להיות מסוגל להזיז את ראשו ולאכול. אם הפגיעה הייתה מוצלחת, אז במחצית האחורית של הזחל תהיה משותקת.
- לשמור על בעלי החיים נפגעו בצלחת אגר מיץ ענבים ב25 &# 176; C לזמן הרצוי בהתאם למטרת הניסוי. לmotoneurons, את הגדם הפרוקסימלי מתחיל לנבוט בתוך 8-10 שעות של פציעה 14, וגדם דיסטלי מתחיל להתנוון בתוך 6-8 שעות 15. לעצב סנסורי דה IV כיתה, את הגדם הפרוקסימלי מתחיל לנבוט בתוך 4-6 שעות, ואת התחלת הגדם הדיסטלי להידרדר בתוך 3-4 שעות לאחר פציעה. הערה: עם נהגי Gal4 מתאימים וכתבי ניאון, צמיחה והניוון ניתן לצפות בשבב הזחל (לדוגמא, ראו איור 6).
Representative Results
שבב הזחל מורכב מבלוק אחד PDMS השכבה, (שבב PDMS) אשר העיצוב מתואר בסכמטי באיור 1. (ראה גם קובץ DXF הנוסף לעיצוב תבנית משלך). Microchamber הזחל, יציאת ואקום, והערוצים היקפיים (איור 1 א) הם 140 מיקרומטר חריצים בשבב PDMS. השבב ממוקם בחלקו העליון של תחילת מבוימת 3 זחל instar rd, הנשענת על גבי coverslip עם שמן (איורים 1B ו-C 1). ממשק שמן הזכוכית בין coverslip ושבב PDMS מאפשר לחותם שנוצר על פי בקשה של ואקום קל. חותם זה לוכד את הזחלים בתוך התא, ומאז ביים מוקדם זחל instar 3 rd הוא מעט עבה יותר מקאמרי, איטום החדר יוצר כמה מועקה פיזית בבעלי החיים, בצורה יעילה משתקת ומגביל את תנועתה. במדינה משותקת זה הגחון, מסויםמבנים בגוף, כגון חוט עצב הגחון ומגזרי נדחפים קרוב לcoverslip. זהו יתרון עבור הדמיה, שכן במדינה המשותקת מבנים אלה יכולים לשקר במרחק העבודה של 40X 63X ויעדים. לאחר הוואקום משתחרר, הזחל ניתן להסיר בקלות מmicrochamber, המאפשר ניסויים נוספים שיש לבצע. גישת קיבוע מכאנית גרידא זה יכול לשמור 90% מזחלים בחיים לאחר תקופות חוסר תנועה רציפות של שעה עד 1 12.
הוואקום שנוצר על ידי מזרק פשוט 20 מיליליטר, ולכן כל היחידה היא קלה להובלה מסטראו, שבו המיקום בתא מתבצע, למיקרוסקופ confocal או epifluorescence, שבו הדמיה חיה מתבצעת. המזרק מחובר ליציאת הוואקום באמצעות צינורות פוליאתילן ו23 מחטים מחלק G (עם רכזות מנעול הוסרו), כפי שמתואר בצעדים 1.6-1.14. עבור מיקרוסקופים הפוכים, צינורותומזרק מחובר באמצעות החלק העליון של השבב (איורים 1B, 2A, ו -2 ב '). עבור מיקרוסקופים זקופים, הם מחוברים דרך יציאה בצד של השבב (1C דמויות, 2C, ו2 ד '). התצורה עבור מיקרוסקופים הפוכים היא קצת יותר קלה לשימוש. המזרק הוא משך ליצירת ואקום עדין (של כ 10 psi), אשר נקשר ממשק נפט הזכוכית PDMS כדי ליצור חותם הדוק בין coverslip ומכשיר PDMS, השמנה ולשתק את הזחל בתוך התא.
המיקום של הזחל לmicrochamber (שלבים 2.7-2.10 בפרוטוקול) הוא קריטי עבור חוסר תנועה והישרדות (איורים 2E-H) יעילים. אם בעל החיים הוא גדול מדי לחדר, (איור 2G), או אם הראש או קנה הנשימה שלה הפכה תפס בין הקצה של החדר והכיסוייםשפתיים (איור 1H), ואז זה סביר לשרוד את ההליך.
להלן כמה דוגמאות לשימוש בשבב הזחל ללמוד תגובות תאיות שונות בתאי עצב (איורים 4-7, סרט S1 והסרט S2).
הדמיה של תחבורת אקסון מהירה: שבב הזחל שימש לתמונת התחבורה בתיווך kinesin של שלפוחית הסינפטית בתוך אקסונים היקפיים בודדים (איור 4 והסרט S1) אנטרוגרדית (~ 1.0 מיקרומטר / sec) ומדרדר (~ 0.8 מיקרומטר / sec. תנועה) של שלפוחית הללו ניתן ללמוד בקלות מסרטים שנאספו על מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב.
מיצוב של בעלי החיים למייקרו לייזר:. דנדריט נוירון חושי היה transected באמצעות לייזר צבע UV פעם (איור 5 והסרט S2) פרוטוקולים לשימוש לאניתן למצוא את השיטה שלו למייקרו למקום אחר 16,17. טכניקת הקיבוע היעילה מאפשרת שינויים מהיר בזמן בקנה מידה בנוירון נפגע, כגון שינויים בסידן תוך תאי (זוהו על ידי 2 + GCamp3.0 מחוון Ca מקודד גנטי 18), כדי להיות מזוהים ונמדד (איור 5).
מחקר של תגובות משובי וניווניות פציעה: אם בעל החיים מותר לנוח בין פגישות הדמיה, שבב הזחל לאחר מכן ניתן להשתמש כדי ללמוד את האירועים תאיים המתרחשים על פני טווח גדול של קשקשי זמן. לדוגמא, שני 'משובי' ותגובות ניווניות לפגיעה באקסון, שיתקיים במשך סולם של 15 שעה שעה, ניתן הדמיה בשבב הזחל (איור 6). בדוגמא זו, את האקסונים של motoneurons octopaminergic נפצעו דרך למחוץ המגזרי העצב (איור 3), שתואר בחלק 3 של הפרוטוקול. הגדם הפרוקסימלי האקסון,שעובר הנבטה חדשה, ואקסונים דיסטלי, המהווים ורידים ולאחר מכן הופכים למפוצלים בתהליך של ניוון Wallerian, יכולים להיות צילמו ולמד במרווחי זמן שונים לאחר הפציעה.
מעקב חלבוני ניאון photoconvertible לאורך זמן Vivo: הפיתוח של חלבוני photoconvertible ניאון, הקרינה שמשנה באופן בלתי הפיך בחשיפה לאור UV) מאפשר לתייג במיוחד משנה של חלבונים בתוך תא, ולעקוב אחר גורלם של החלבונים שכותרתו לאורך זמן 19 , 20. טכניקה זו מתבצעת לרוב בתרבית תאים, לעומת זאת, עם שבב זחל אחד יכול לעקוב אחר חלבוני photoconvertible מקודד גנטי בתוך תאים מוגדרים in vivo. כדוגמא אנו מראים כי חלבון היתוך Denda2-α-טובולין, בא לידי ביטוי בעצב סנסורי דה IV הכיתה, ניתן photoconverted בגופי תא (7 א דמויות ו
כל דוגמאות שתוארו (האיורים 4-7 וסרטים S1 ו S2) היו הדמיה באמצעות מערכת confocal דיסק מסתובב, בהיקף של סורק Nipkow CSU10 ומצלמה EMCCD C9100-50, רכוב על אובזרוור Axio עם 63X (1.5 NA) מטרת שמן, ומונע שימוש בתוכנת רכישת Volocity.
איור 1. קריקטורות strong> סכמטי לשימוש בשבב הזחל.
() שבב הזחל מורכב משבב PDMS, שמסומן בצבע הכחול בהיר, דבק coverslip זכוכית. השבב מכיל 140 מיקרומטר ערוצי microfluidic עבים, שמסומנים בלבן. Microchamber המרכזי נועד להתאים בנוחות בתחילת מבוימת 3 זחל instar rd דרוזופילה (קריקטורה של בצבע ירוק בהיר). קובץ DXF המכיל ממדים מדויקים שניתן להשתמש בם כדי לעצב את התבנית מסופק כנתונים משלימים. בר = 1.5 מ"מ קנה מידה. (BC) Side-נופים של שרטוטים לטעינת זחל לתוך שבב זחל. הזחל יושב בצד הגחון על coverslip, והגוף שלה נמצא בתוך microchamber העמוק 140 מיקרומטר. מזרק מיליליטר 20 מחובר ליציאת צריכת ואקום ומשמש כדי לגרום לואקום עדין. הממשק-PDMS זכוכית שמן Halocarbon מחויב לוואקום לתוך חותם חזק, המגביל את הזחל בmicrochamber. חותם זה הוא בקלות הפיךעל ידי שחרור הלחץ מהמזרק, לאחר שבעלי החיים חוזר מייד תנועתיות. עבור מיקרוסקופים זקופים (ב '), ואקום המזרק מחובר דרך צינורות פוליאתילן-50 מהחלק העליון של השבב. עבור מיקרוסקופים הפוכים (C), הקשרים האלה עשויים מהצד השני של השבבים, ואילו 'העליון' של השבב מחובר לבמה מיקרוסקופ באמצעות קלטת דו צדדית.
איור 2. תמונות של שבבי PDMS ומיקום נכון של זחל.
(לספירה). תצלומים מראים שבבי PDMS עבור מיקרוסקופים הפוכים וישרים. קצה המחט מחלק G 23 כבר הוכנס ליציאת הוואקום, המאפשר חיבור דרך צינורות אל הוואקום (מזרק). סרגל קנה מידה = 1.5 מ"מ. (EH). דרוזופילה משותקים. E ו-F דוגמאות מופע של בעלי חיים משותקים בצורה נכונה. בעלי החיים הקטנים יותר בF עדיפים אם מספר רב של תמונות על סולמות זמן רב (> שעות 12) יתנהלו. G מציג בעלי חיים שהם גדול מדי, ו-H מציג חיה קטנה שממוקמת באופן שגוי. סרגל קנה מידה = 1.5 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. פציעה למחוץ עצב של עצבים מגזרי בזחלי דרוזופילה.
() קריקטורה של assay למחוץ עצב. העצבים החלקיים בתוך 3 rd (B) של מערכת עצבים זחל מחיה גזור 20 שעות לאחר למחוץ עצב. Immunostaining לממברנות עצביות עם נוגדנים נגד HRP (אדום) מדגישה את אונות המוח, חוט עצב הגחון, ועצבים מגזרי ארוכים אשר מכילים motoneuron ואקסונים תא עצב תחושתיים. קבוצת משנה של motoneurons הבודד מסומנים על ידי נהיגה ביטוי של כטב"מ-mCD8-GFP (ירוק) עם נהג M12-Gal4. גופי תא ודנדריטים מהנוירונים האלה משקרים בחוט עצב הגחון, בעוד שהאקסונים שלהם מקרינים על קיר של שרירי גוף דרך העצבים מגזרי. (מנהל התקן זה גם מניע את ביטוי ה-GFP בשריר 12 עבור כל hemisegment זחל, שביחד ניתן לראות פסים קדמי, אחורי בכל צד של בעלי החיים). האזור שנפגע על ידי למחוץ מסומן בקווים מקווקווים כחולים. סרגל קנה מידה = 70 מיקרומטר. (C) סגור את נופים של אקסונים הפגועים, 20 שעות לאחר פציעה. משמאל:האקסון הפרוקסימלי עבר הנבטה וצמיחה חדשה. מימין: האקסון דיסטלי הוא מקוטע, עם GFP הקטן שנותר, בשל ניוון Wallerian ופינוי של פסולת. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. תמונות (ד ') של למחוץ העצב בזחל instar 3 rd מוקדם. נקודות החץ האדומות לחוט עצב הגחון. המיקום של ההתאהבות הוא לכיוון החלק התחתון של המקטע 3, כפי שמתואר בטקסט Protocol (פרוטוקול 3). התמונות בD פורסמו במקור בג התא Biol 191, 211-223, doi:.. 10.1083 (2010) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. זמן לשגות הדמיה של תחבורת אקסון של שלפוחית סינפטית peptidergic.עכברוש natriuretic פפטיד פרוזדורי ANF מתויג עם GFP, כטב"מ-ANF-GFP 21, בא לידי ביטוי בתוך motoneurons הספציפי באמצעות מנהל ההתקן של ערב-RRA-Gal4 22. הדמיה חיה של עצבים מגזרי חושפת את התחבורה המהירה של ANF-GFP שכותרתו שלפוחית peptidergic באקסונים. ראה גם הסרט S1. (א) מסגרות בודדת של אקסונים motoneuron מהזמן לשגות הדמיה חי. חיצים ירוקים, אדום וכחול מצביעים על דוגמאות של אנטרוגרדית, שלפוחית נייחת ומדרדר, בהתאמה. בקנה מידה בר = 5 מיקרומטר. (א ') מסגרות זמן בודדות מתוך הסרט מוזגו באמצעות ImageJ. (ב') רשם גלים שנוצרו מהזמן לשגות הדמיה של תחבורת ANF-GFP, נוצר מאוסף של מסגרות בודדות פורש דקה אחת של כימות זמן הדמיה באמצעות 'הרשם הגלים המרובים' תוסף עבור ImageJ 23. (C) של מהירויות מגזריות בממוצע, שחושבו מהמדרונות של עקבות מפולחות בkymographs. הפס הירוק presenמהירות אנטרוגדית ts מגזרי (n = 543) והפס הכחול מציג מהירות מדרדר מגזרית (n = 548) של שלפוחית מ10 kymographs. כימות (ד ') של צפיפות חלקיקים. צפיפות חלקיקים נמדדה במספר אנטרוגרדית (המוצג בסרגל ירוק), חלקיקים נייחים (המוצג בסרגל אדום) ומדרדר (המוצג בסרגל כחול) לכל אורך האקסון 100 מיקרומטר מ10 kymographs. הנתונים באיור זה גם פורסמו בעבר בGhannad-Rezaie ואח', PLoS ONE 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
איור 5. שימוש בשבב הזחל למייקרו לייזר והדמיה סידן.
דנדריט מתא עצב תחושתי מסוג הרביעי הוא transected ידי עם פעימות לייזר רבת עוצמה מליזר צבע UV פעם. ניתן למצוא בפרוטוקולים לשימוש בשיטה זו למייקרו במקום אחר 16. הקיבוע היעיל בשבב הזחל מאפשר שינויים מהירים ברמות סידן תוך כדי להיחקר על ידי הדמיה לחיות. בדוגמא זו, GCaMP3.0 מחוון סידן מקודד גנטי בא לידי ביטוי בarborization הדנדריטים IV כיתת עצב סנסורי (C4da) באמצעות מנהל התקן ppk-Gal4. () זמן לשגות תמונות של עוצמת GCaMP3.0 היו כוזבות בצבע לפי הצבע בקנה מידה אינטנסיביות כדי לציין את השינויים בעוצמת לאורך זמן. מסגרות בודדות שהוצאו מסרט הזמן לשגות (סרט S2) צילם על מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב ב5 מסגרות / sec. כימות (B) של דינמיקת סידן בתגובה למייקרו לייזר. השינוי של פי המנורמל של עוצמת סומה GCaMP3.0 הקרינה (ΔF/F0) של נוירונים בודדים היה זמם נגד הזמן (n = 7, שמוצג באפור). ΔF/F0 הממוצע היה מיוצג בתפוז. גידול השיא של עוצמת GCaMP3.0 נצפה בין 1-2 שניות לאחר פציעה. רקע היה מפחית את עוצמת הקרינה ה-G-CaMP3.0 גלם. הנתונים באיור זה גם פורסמו בעבר בGhannad-Rezaie ואח', (2012) PLoS ONE 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12.
איור 6. הנבטה הדמיה אקסון וניוון באמצעות שבב הזחל. תמונות confocal נציג של הגדם הפרוקסימלי (משמאל) וגדם דיסטלי (מימין) של אקסונים motoneuron octopaminergic בנקודות זמן שונים לאחר למחוץ העצב. תמונות צולמו במקומות דומים, כפי שמוצגות באיור 3 ג. נוירונים אלה מסומנים על ידי הנהיגה ביטוי של transgene כטב"מ-mCD8-RFP באמצעות TDC24,25 נהג 2-Gal4. גופי התא של הנוירונים האלה משקרים בחוט עצב הגחון 24. ניתן לראות שלושה אקסונים בודדים בתוך עצב מגזרי אחת, והם נפתרים בקלות אחד מהשני. זהו מצב אידיאלי לחקר אירועים הסלולר בודדים, כגון פיצול של אקסונים המתנוונת, אשר יושלם בתוך 15 שעה לנוירונים אלה. תמונות התקבלו מבעלי חיים באמצעות שבב הזחל ב63X הגדלה במיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. ברים סולם = 10 מיקרומטר עבור לוחות שמאל (גדמי פרוקסימלי) ו20 מיקרומטר ללוחות מימין (גדמים הדיסטלית). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7. באמצעות הזחלשבב למעקב אחר חלבוני ניאון photoconverted על זמנים ארוכים ומרחקים בבעלי חיים.
בדוגמא זו, חלבון היתוך של חלבון photoconvertible ניאון Dendra2 19, התמזגו α-טובולין, בא לידי ביטוי מtransgene כטב"מ-Dendra2-α-טובולין בarborization הדנדריטים כיתת IV עצב סנסורי (C4da), באמצעות מנהל התקן ppk-Gal4 26. סכמטי (א ') לניסוי photoconversion. גופי התא של הנוירונים C4da לשקר בפריפריה ולהרחיב את האקסונים דרך עצבים מגזרי ליצירת מסופים הסינפטיים בחוט העצב. Dendra2-α-טובולין בתוך קבוצת משנה של גופי תא במחצית האחורית של בעלי החיים הוא נתון photoconversion על ידי תאורת UV לשניות 6 באמצעות מסנן DAPI רגיל עם מנורת כספית (קריקטורה משמאל). לאחר הזמן, Dendra2-α-טובולין photoconverted ניתן לאתרם במסופים הסינפטיים בחוט עצב הגחון. זה מצביע על כך חלבון טובולין כבר טראןהתהדר לאורך מרחק ארוך (של ~ מ"מ 1-2). תמונות דוגמא בר = 1 מ"מ בקנה מידה (ב) לDendra2-α-טובולין בגוף תא עצב תחושתי IV כיתה לפני ואחרי photoconversion. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) תמונות דוגמא של מסופים הסינפטיים לעצב סנסורי IV בכיתה בבית או 0 שעות או 48 שעות לאחר photoconversion של גופי התא. המראה הספציפי של Dendra2-α-טובולין photoconverted במסופים הסינפטיים לאחר הזמן מרמז כי החלבון נסע מהגוף התא לתחנה סופית האקסון. Photoconversion והדמיה בכל נקודות הזמן נערכו בשבב הזחל. בר = 15 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
הסרט S1. מייקרו לייזר והדמיה סידן של נוירון C4da. לייזר UV פעם שימש לtransect חסודהסניף הדנדריטים האר"י. חיתוך רוחב לייזר גרם לעלייה מהירה בעוצמת GCaMP, שהחלה באתר של פציעה ונסעה אל גוף התא. כטב"מ-GCaMP3.0 18 בא לידי ביטוי באמצעות מנהל התקן ppk-Gal4 הספציפי C4da 26. הסרטים היו כוזבים בצבע כדי לציין את רמות העצמה היחסית של GCaMP3.0. הזמן לשגות ההדמיה נערכה עם מיקרוסקופיה confocal דיסק מסתובב ב5 מסגרות / sec.
הסרט S2. תחבורת אקסון מהירה של ANF-GFP בmotoneurons.
Natriuretic פפטיד פרוזדורי החולדה ANF מתויג עם GFP, כטב"מ-ANF-GFP 21, בא לידי ביטוי בתוך motoneurons הספציפי באמצעות מנהל ההתקן של ערב-RRA-Gal4 22. ההובלה של שלפוחית peptidergic אלה בתוך עצבים מגזרי זחל הייתה צילמה על שבב הזחל ב300 msec / מסגרת באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב.
Figure1 המשלים (קובץ DXF)
קובץ DXF לייצור תבנית סיליקון. הקובץ מיועד למסכת photoresist שלילית (מסכה הגישה אפל לSU-8) על פרוסות סיליקון 4 אינץ'. השורה השנייה מכילה 5 תבניות להכנת שבבי זחל שימוש בפרוטוקול זה. כל אחד מהשבבים הללו (בשורה 2) מכיל קאמרי ~ 5.4 מ"מ x 1.5 מ"מ נועד להתאים זחל instar 3 rd בשלב מוקדם. השורה הראשונה (השורה 1) מכילה תא גדול יותר (~ 5.4 מ"מ x 2 מ"מ), ואילו בשורה השלישית (שורה 3) מכילה תא קטן יותר (~ 4.4mm x 1.5mm). אלה עשויים להיות מנוצלים עם זחלים של גדלים גדולים יותר וקטנים יותר, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ.
Discussion
ביצוע או קבלת שבב הזחל:
שבב הזחל מורכב מבלוק PDMS (שמכונה 'שבב PDMS') המצורף לcoverslip זכוכית. הפרוטוקול בשלב 1 מתאר את ההליך להכנת ושימוש בשבבי זחל, בהנחה שעובש SU-8 הוא זמין. עובש SU-8 microfabricated ידי photolithographically דפוסי שכבת 140 מיקרומטר עבה SU-8 photoresist על פרוסות סיליקון (לפרטים ראו Ghannad-Rezaie et al. 12). כmicrofabrication של עובש SU-8 דורש גישה לציוד מיוחד, אנו ממליצים להזמין אותו ממתקן microfabrication (למשל. מתקן LNF באוניברסיטת 14 מישיגן), או מיציקה על ידי שליחתם תכנון שבבים המסופק כקובץ נלווה. אם האדם רוצה לשנות את העיצוב של שבב PDMS (למשל לשימוש עם זחלים בגדלים שונים), תוכנות CAD שמטפלת בקבצי DXF (למשל אוטוקאד) יכול לשמש. SU-8 עובש יכול להיות גם בתוך הבית בהתאם להוראות בMondal et al. 27 קוראים רבים עשויים למצוא אותו נוח פשוט להשיג מדגם שבב PDMS לנסות את הטכניקה לפני בודה שבבים משלהם. זה יהיה זמין באופן חופשי על פי דרישה.
שימוש ב'שבב הזחל 'microfluidic עבור הדמיה חיה:
שיטת הקיבוע בשבב הזחל תמנע את השימוש בחומרי ההרדמה, ובמקום כרוך בלחץ, באמצעות היישום של ואקום, להגביל את תנועתו של בעל החיים. בעוד בעלי חיים יכולים לשרוד חוסר תנועה בשבב במשך שעות מרובות 12, לתקופה קצרה יותר חוסר תנועה (5-15 דק ') מומלץ. זה מספיק זמן להדמית אירועים רבים תאיים של עניין, לרבות שינויים בסידן תוך תאי, או בתחבורת אקסון מהירה. זה גם מספיק זמן למניפולציות רצויים בבעלי חיים, כגון מייקרו לייזר מבוסס, photobleaching, וphotoconverשיאון.
כדי ללמוד את האירועים על פני תקופת זמן ארוכה יותר בחיה אחת לאורך זמן, ניתן להציב חיות לשבב וצלמו מספר פעמים, מופרדות על ידי תקופות של מנוחה. צלחות אגר מיץ ענבים הן אידיאליים למנוחה בין פגישות הדמיה, כפי שהם מספקים מקור מזון קל ולחות. פגישות הדמיה מרובות עושות משפיעות על הישרדות זחל לתואר, שכן כל מפגש כרוך בסיכון כלשהו לפגיעה בבעלי החיים (ראה חלק 2 בפתרון בעיות, בהמשך). בעלי חיים ניתן הדמיה באופן שיגרתי> 5 פעמים במשך יומיים עם שיעור הישרדות של יותר מ 50%. מאז החיות אינן מורדמים, הם בריאים וניעה מייד לאחר שחרורו של הוואקום בשבב. לפיכך, אין צורך בזמן התאוששות בין פגישות הדמיה, ולכן מרווח הזמן בין הפגישות הוא גמיש ויכול להיות מותאם למטרות הניסוי.
פתרון בעיות:
הטכני הנפוץ ביותר הואתובעת עם זחל שבב ופתרונות מומלצים הם כדלקמן:
(1) בעלי החיים הוא נעו יותר מדי. יותר מדי ניידות יכולה להפריע למטרות ההדמיה. הסיבות הנפוצות ביותר לכך בשבב הזחל הן) בעלי החיים הוא קטנים מדי עבור השבב, או ב) לחץ הוואקום מיושם במהלך שלב הקיבוע נפגעת. שבב הזחל שתואר בפרוטוקול זה מיועד לתחילת מבוימת זחלי instar 3 rd. הגודל האופטימלי לבעלי החיים הוא 3.5-4 מ"מ האורך (לאורך ציר anteroposterior). כדי להבטיח שלחץ הוואקום מספיק, למשוך מיליליטר 2-2.5 המזרק, או עד שההתנגדות מורגשת בידית. אחת אינדיקציות כי הוואקום הוא עובד היא שבועות קטנות בערוץ ההיקפי ניתן לראות נעות באיטיות לכיוון מקור הוואקום. אינדיקציה נוספת היא כי coverslip תמיד צריך לנסוע עם השבב כאשר השבב הוא הרים מלמעלה (וזו השיטה המומלצת להובלה הקאמריתברגע שהזחלים הוא המיקום ואת הוואקום הוא על). הוואקום עלול להיות בסכנה אם יש סדקים בצינור, או אם יש נפט בצינור. זה יכול להיות מטופל בקלות על ידי החלפת 23 G מחלק קצה מחט וצינורות פוליאתילן-50 (מצעדים 1.6-1.14).
(2) בעלי החיים מת לאחר ההדמיה בשבב. ההליך זה נועד לגרום ללחץ מינימאלי על בעלי החיים, ויש להם חיות של גנוטיפ סוג בר שיעור הישרדות> 90%, גם לאחר שעות של חוסר תנועה על השבב 12. מאז כמה גנוטיפים עשויים להיות פחות גמישים ללחץ של השבב, יש לבדוק תחילה כי בעלי חיים מסוג בר (לדוגמא, קנטון S) לשרוד את טכניקת הקיבוע. א) הגורם השכיח ביותר לקטלני הוא מיקום לא נכון של הזחל (ראה איורים 2G-H). אם חלקים של הציפורן, הראש או קנה הנשימה הם לא לגמרי בתוך החדר, ואז הם יכולים להיות פגומים בחוסר התנועה, וזחל שהוא גדול מדי עבור השבב (> 4 מ"מ) הוא פחות סביר כדי לשרוד. ב) סיבה שכיחה פחות לקטלני היא השימוש בלחץ או ואקום בעת טעינת השבב יותר מדי. כשהוא מוצב כראוי בשבב, הלחץ שנוצר על ידי הוואקום הוא נסבל היטב. עם זאת לחץ מוגזם, או מהוואקום או בשלב הראשוני של מיצוב החיה יכול להיות בעיה. זה הכי טוב כדי ללמוד את מידת הלחץ הדרושה באופן אמפירי על ידי ניסויים עם זחלים מסוג בר בגודל הנכון. ג) אם יותר מדי שמן Halocarbon מכסה את קנה הנשימה של בעלי החיים בעלי החיים פוטנציאליים עלולים להיות בעיות בהישרדות לטווח ארוך. השמן ממלא מספר תפקידים חשובים בשבב: זה חשוב ליצירת הוואקום, אופטיקה במהלך הדמיה, וזה מנטרל יובש בשבב. יש להימנע משמן זאת מוגזם. (זה גם יכול להוביל לנפט בצינור והמזרק, להתפשר הוואקום). מעילי הפרוטוקול הציעו רק את הצד הגחוני של הזחל עם שמן, ולאחר מכן removes עודפי שמן על ידי מיקום של הזחל על coverslip נקי לפני העברה לcoverslip הסופי להדמיה. ד) phototoxicity ניתן לחוות מפגישת ההדמיה. כמו עם כל יישום הדמיה לחיות, הוא אידיאלי לשימוש זמני חשיפה קצרים עם אור נמוך עוצמת לייזר, אשר הוא הטובה ביותר להשיג באמצעות מצלמה או גלאי רגיש מאוד. נסה למזער את התאורה עם אור האולטרה סגול, כולל ספקטרום רחב אור שנוצר על ידי מקורות אור כספית.
נושאים אחרים וכיוונים לעתיד:
מאחר ושיטה זו לא לנצל הרדמה, לבו של בעל החיים ממשיך לפעום. זה יוצר כמה ניידות בלתי נמנעת, אשר משפיעה על הדמיה במקומות מסוימים יותר מאחרים. דוגמאות כאן מראות כי חוט עצב הגחון, עצבים מגזרי, וקיר גוף ניתן הדמיה בקלות ללא הפרעה מהלב. במקרים בהם קצב הלב משפיע הדמיה, לפעמים יכולות להיות מתוקנות תנועות הרגילות לעםבתוכנת ניתוח (לדוגמא, תוסף מייצב התמונה לImageJ). זה עובד היטב כאשר אובייקטים בודדים נעים על ציר זמן במהירות (לדוגמא ~ מיקרומטר / 1 שניות להובלת אקסון מהירה) או בקנה מידת זמן איטי מאוד (דקות עד שעות). עם זאת, כאשר האובייקט (ים) של מהלך עניינים עם מגוון רחב של מהירויות וכיוונים, זה יכול להיות קשה יותר לתיקון לתנועות הדופק מושרה.
בעיה נוספת היא השתנות קלה באופטיקה מבעלי החיים לבעלי חיים, או בין פגישות הדמיה מרובות של אותו בעלי החיים בשבב. העמוק יותר מושא העניין הוא בבעלי החיים, גדול יותר תהיה וריאציה זו. עצבים מגזריים וחוט עצב הגחון הם בדרך כלל עמוקה מדי בתוך אז חיה להיות צילמו במיקרוסקופ רגיל. עם זאת בלחץ המתון חווה בשבב הזחל דוחף את המבנים האלה קרובים מאוד לציפורן וcoverslip. המרחק המדויק של מבנים אלה מcoverslip יהיה וריאציות קטנות מTRIAL לדין. הווריאציה לאובייקטים לסגור את הציפורן, כגון גופי התא של הנוירונים חושיים, הוא פחות. לכן זה חשוב, במיוחד לביצוע מדידות של עוצמה, לנצל מספר רב של בעלי חיים ומחקרים עצמאיים לחשבון לשונות באופטיקה.
אמנם דוגמאות שהובאו כאן התמקדו על תהליכים בתוך תאי עצב, הגישה צריכה להיות נוחה להדמיה כל מבנה בבעלי החיים שניתן הביאו בתוך עומק ההתמקדות של מטרת מיקרוסקופ. זה כולל את הציפורן, קיר שרירי גוף, וNMJs. קנה הנשימה בצד הגחון של בעלי החיים ואפשרות חלקים של מערכת העיכול יכולים גם להיות צילמו. בעלי החיים יכולים גם להיות ממוקמים בצד הגב שלה לכיוון coverslip להדמיה לטווח קצר של מבנים סמוכים לפני השטח הגבי. יכולת מבני תמונה עמוקה בתוך בעלי החיים היא מוגבלת על ידי מרחק העבודה של מיקרוסקופ מטרת שימוש. מבנים כגון imדיסקי aginal אינם נגישים להגדלה גבוהה (למשל 40X) מטרות.
שבבי הזחל שתוארו בפרוטוקול זה מיועדים לזחלים בשלב מוקדם 3 instar rd (הנע בגודל 3.5-4 מ"מ). עם זאת הרבה שאלות מעניינות דורשות הדמיה בשלבי זחל שונים. שבבים קטנים יותר כדי להכיל 2 זחלי instar nd, או שבבים גדולים יותר כדי להכיל instars 3 rd מאוחר יכולים להיות מתוכננים בקלות באמצעות אותו העיקרון. (איור משלים 1 מכיל קובץ DXF לשינוי בקלות לייצור תבניות סיליקון עם גדלים קאמריים שונים). העיקרון הפשוט של החותם הפיך אפילו יכול להיות מיושם על אורגניזמים אחרים כגון ג elegans או דג הזברה, עם הגרסה העיקרית היא גודל החדר. כיוון עתידי שימושי הוא לעצב שבבים שיכולים לשתק את בעלי חיים רבים בו זמנית, לשימוש למטרות הקרנה. עם זאת, עבור זה, העיצוב היה צריך להיות שונה באופן משמעותימהמכשיר הנוכחי, שבו הסוגיות של מיצוב בעלי החיים בשבב צריך להיות עסקה עבור כל חיה באופן עצמאי.
Assay למחוץ העצב ללימוד תגובות פגיעה בעצבים היקפיים זחל:
Assay למחוץ עצב המתואר כאן לעצבים מגזרי זחל הוא שיטה פשוטה להחדרת פגיעה באקסונים היקפיים בדרוזופילה. יתרונות של שיטה זו כוללים: א) זה פשוט לנהל עם תקן כלים שנמצאו במעבדה דרוזופילה (CO 2 מקור סטראו ומלקחיים), ב) שהוא יכול להתנהל במהירות לבעלי חיים רבים, מה שהופך את הניתוח ביוכימי של חוטי עצב לאחר פגיעה 14 ריאלי; ג) התגובות מולקולריות ותאיות לפגיעה זו הן לשחזור 14,15,28 מאוד וניתן להשתמש בו כדי לגלות את התהליכים שהם גם חשובים בנוירונים חוליות 29,30.
שיטות חלופי לפציעתם של הנוירונים היא focusa לייזר בעצמה גבוהה, למשל פעמו-UV או לייזר femtosecond, לנתק את האקסון באמצעות מייקרו לייזר 17,31-33. שבב הזחל הוא שיטה אידיאלית למיצוב החיה למייקרו מסוג זה. עם זאת, בגלל הבדלים קלים באופטיקה בין ניסויים, שנדונה לעיל, השיטה מבוססת הלייזר יכולה להיות קשה יותר להתרבות בזחלים, בעיקר בעצבים מגזרי זחל. כמו כן, פגיעה באקסון לייזר מבוססת דורשת זמן רב יותר כדי למקם את כל בעלי חיים, ולכן קשה יותר לנהל בקנה מידה גדול (עם מספר גדול של בעלי חיים).
פתרון בעיות:
הבעיה הטכנית הנפוצה ביותר נתקלה מלמחוץ העצב היא מוות כתוצאה מנזק לאיברים פנימיים. בעת ביצוע למעוך, חשוב שלא לצבוט את חוט עצב הגחון, בלוטות רוק, או במעיים. כמו כן, חשוב שלא לנקב את העור המת. נושאים אלה נמנעו הטובה ביותר על ידי הבאת המלקחיים בזווית של ° 45 לsurfac הציפורןדואר (ראה איור 3).
יש האיכות של המלקחיים השפעה גדולה על האפקטיביות של ההתאהבות וההישרדות לאחר מכן. אנו ממליצים מספר Dumostar 5 מלקחיים. כדי לשמור על החדות שלהם, המלקחיים חייבים להיות מטופלים בזהירות, שאינו משמשים למטרות אחרות, והוחלפו ברגע שהם הופכים לבוטים או כפופים.
גודלו של בעל החיים יכול גם להשפיע על האפקטיביות של ההתאהבות. חיות קטנות (פחות מ 3 מ"מ אורך) הן הרבה פחות סיכוי לשרוד את הפציעה. עם בעלי חיים גדולים, (נדודי 3 instars rd), קשה יותר לאתר את העצבים ולמנוע נזק לבלוטות הרוק הגדולים והמעיים, ויש פחות זמן ללמוד את תגובות פציעה לפני ההתגלמות. למחוץ העצב מתנהל בצורה היעילה ביותר בזחלי instar 3 rd המוקדמים (שהם ~ 3-4.5 מ"מ האורך לאורך ציר anteroposterior).
מקור המזון שבעלי החיים עולה על עשוי להשפיע עלחוזקו של העור המת וההישרדות לאחר למחוץ. מומלץ לגדל בעלי חיים במזון עשויים ממתכון השמרים-גלוקוז סטנדרטי.
השיטה הטובה ביותר ללימוד איך לעשות למחוץ בצורה יעילה היא להתאמן על בעלי חיים רבים, תחילה במטרה העיקרית להשגת הישרדות (ולא התגלמות) 24 שעות לאחר למחוץ. בדרך כלל יש למתחילים שיעור נמוך הישרדות (למשל 10%), אבל ברגע שהטכניקה נלמדת, שיעורי הישרדות יכולים להגיע ~ 90%.
נושאים אחרים וכיוונים לעתיד:
Assay למחוץ מספק שיטה רבת עוצמה כדי לחקור הנביטה הפרוקסימלי האקסון לאתר פציעה והניוון של אקסונים וסינפסות דיסטלי לאתר פציעה. בעוד השיעורים של ניוון להשתנות בין סוגים שונים של תאי עצב, הם מאוד לשחזור בתוך סוג נוירון נתון, מתן עדות לשחזור של assay הפציעה.
לעומת זאת, 'משובי' הנבטההתגובה שנצפתה באקסונים הפרוקסימלי היא יותר מאתגר למחקר. כל האקסונים בעצב המגזרי ליזום נרחבים הנבטה קרובה לפגיעה באתר (לדוגמא, ראו איור 6 ואיור 3). עם זאת היקף ההנבטה יכול להשתנות מתא העצב לתא עצב, וקשה לכמת. מידה דומה ושונה בהנבטה ניתן לצפות לאחר יותר נגעי מוקד של motoneurons הבודד בעצבים מגזרי הציג באמצעות לייזר צבע פעמו UV. אנו מפרשים שיווני nondiscriminate של ההנבטה היא בשל היעדר רמזי הדרכה בעצבים המגזרי. לעומת זאת, אקסונים תא עצב תחושתיים נפגעו על ידי לייזר קרוב לגופי התא שלהם לעבור צמיחת אקסון חדשה באותו הכיוון כמו האקסון לאיבוד 34. האקסונים באזור זה של בעלי החיים סביר להניח שנחשפו למידע positional ספציפי יותר להדרכתו של אקסונים ההתחדשות. הסביבה בתוך עצבים מגזרי לא סביר שיש להם הרבה resemblanלסה"נ לסביבה שהאקסונים לנווט במקור בהדרכה שלהם בעובר, ולכן הוא לא צפוי להיות מידע כדי להדריך אקסונים התחדשות.
מגבלה נוספת ללימוד התחדשות באמצעות assay למחוץ עצב המגזרי היא שעדיין יש אקסונים חושיים וmotoneuron פצועים מרחק משמעותי כדי לכסות (.25-1 מ"מ) כדי להגיע ליעד שלהם, ומסגרת זמן מוגבלת (<3 ימים) לפני שעובר על בעלי החיים התגלמות. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מניפולציה גנטית של קולטן הורמון prothoraciotropic שמשלש את משך הזמן של שלב זחל instar 3 rd 35. מניפולציה זו תרחיב את מסגרת הזמן ללימוד ההתאוששות והניוון של תאי עצב לאחר פגיעה באופן משמעותי, עד 9 במקום 3 ימים. זה עשוי להיות ארוך מספיק כדי להתבונן אירועים חדשים, כגון חיבור מחדש של האקסון נפגע עם יעד postsynaptic, במיוחד אם הפגיעה הנגרמת קרובה לסיום הסינפטי.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, (מספר מענק IOS-0,842,701 לCAC), והמכון הלאומי לבריאות (R00MH080599 לBY, R21 NS062313 לNC, וNS069844 לCAC). ברצוננו להודות ג'יימס Schutt, אמילי האן, והלנים Truong לתמיכה טכנית, ומרכז מלאי Bloomington לקווים לטוס. כל השבבים היו מפוברק במתקן לוריא Nanofabrication באוניברסיטת מישיגן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
