Summary
Drosophila larver är ett attraktivt modellsystem för levande avbildning på grund av deras genomskinliga nagelband och kraftfulla genetik. Detta protokoll beskriver hur man använder ett enda lager PDMS enhet, kallad "larv-chip" för live-avbildning av cellulära processer inom nervceller i 3: e INSTAR Drosophila larver.
Abstract
Live avbildning är en viktig teknik för att studera cellbiologiska processer, men detta kan vara en utmaning med levande djur. Den genomskinliga hinnan av Drosophila larv gör den till ett attraktivt modellorganism för live imaging studier. Men det är en viktig utmaning för levande avbildningstekniker för att icke-invasivt immobilisera och placera ett djur på mikroskopet. Detta protokoll utgör en enkel och lätt att använda metoden för att immobilisera och avbildning Drosophila larver på en polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem enhet, som vi kallar den "larv-chip". Larvaen chip består av en tätt åtsittande PDMS mikrokammare som är ansluten till ett tunt täckglas, som, vid applicering av ett vakuum via en spruta, immobiliserar djuret och bringar ventrala strukturer såsom nerv sladd, segmentella nerver och kropp vägg muskler, i nära anslutning till täckglas. Detta gör det möjligt för högupplösande avbildning, och viktigare, undviker användningen av anesthetics och kemikalier, vilket underlättar undersökning av ett stort antal fysiologiska processer. Sedan larver återvinna lätt från immobilisering, kan de lätt underkastas multipla avbildning sessioner. Detta gör det möjligt för longitudinella studier över tidsförlopp som sträcker sig från timmar till dagar. Detta protokoll beskriver steg för steg hur man förbereder chipet och hur man utnyttjar det chip för live-avbildning av neuronala händelser i 3: e INSTAR larver. Dessa händelser omfattar den snabba transporten av organeller i axoner, kalcium svar på skada och tidsförlopp studier av handel med foto konvertibla proteiner över långa avstånd och tidsskalor. En annan tillämpning av chip är att studera regenerativ och degenerativa svar på axonal skada, så den andra delen av detta protokoll beskriver en ny och enkel procedur för att skada axoner i perifera nerver med en segmentell nerv krossa.
Introduction
Fruktflugan, Drosophila melanogaster, har använts som modellorganism i över 100 år, och har visat sig vara avgörande för att definiera grundläggande signalering och utvecklingsvägar som är bevarade från ryggradslösa djur till människa. Live avbildning är en viktig metod för att studera cellulära mekanismer, och den enkla kroppsplanen och genomskinlig nagelband av Drosophila larv gör den till ett attraktivt system för live-avbildning, i synnerhet som det finns många genetiska verktyg för att uttrycka fluorescerande taggade proteiner i specifika celltyper.
En viktig utmaning för levande avbildningstekniker är att icke-invasivt immobilisera och placera ett djur för mikroskopi. Konventionella immobilisering tillvägagångssätt inkluderar dissektion 1,2 eller användning av kloroform, som båda döda djuret. De bedövningsmedel eter 4 och isofluoran 5-8 har också använts. Medan anestetika ger många fördelar, De inhiberar också neural aktivitet och viktig fysiologi (inklusive hjärtslag) 9-11, därmed kan påverka processen studeras och skapar stress på djuret. Det finns också humana säkerhetsaspekten för att arbeta med eter och isofluoran.
Vi har utvecklat ett drogfritt sätt att immobilisera Drosophila larver i ett enda lager PDMS mikroflödessystem enhet, som vi kallar den "larv-chip" 12. Detta protokoll kommer att beskriva hur få eller göra larven chip, och hur man kan använda det för live-avbildning i början-iscensatt 3: e INSTAR larver. Kretsen består av en tätt åtsittande mikrokammare, som, vid applicering av ett vakuum via en spruta, immobiliserar djuret via mild mekanisk kraft. Immobilisering Metoden ger ventrala strukturer som nerven sladden, segmentella nerver, och kroppen väggen muskler, i närheten till ett täckglas. Detta gör det möjligt för högupplösande avbildning av sådana strukturer med hög numerisk apertida (hög förstoring) mål.
Fördelar med larven chip över andra konventionella tekniker är följande: (i) Användning av larven chip ersätter användningen av kemikalier, vilket möjliggör in vivo avbildning av obedövade djur. (Ii) Larver hämta omedelbart efter frisättning från chipet (i motsats till en 2 h återhämtningsperiod för isofluoran 8,13). Detta gör det möjligt för avbildning över breda tidsskalor, från millisekunder till minuter till timmar och dagar. (Iii) Användningen av PDMS, som är en gas-genomsläppligt material, möjliggör för kontinuerlig diffusion av syre / luft från omgivningen in larven kroppen. (Iv) Chipet är lätt och säker att använda, och (v) den är återanvändbar, och som kan tillverkas till en minimal kostnad.
Förutom instruktioner för användning av larven chip, kommer detta protokoll ger flera exempel på dess användning för att studera neuronala händelser i 3: e INSTAR larver. Dessa inkluderar live-avbildning av Axonal transporter, kalcium svar på skada och tidsförlopp studier av handel med foto konvertibla proteiner över långa avstånd och tidsskalor.
En annan tillämpning av chipset är att studera neuronala svaren på axonal skada. För detta en extra procedur beskrivs (i del 3) för att skada axoner i perifera nerver med en segmentell nerv krossa. Denna enkla analys kan genomföras både snabbt och reproducerbart under en standard dissektion stereomikroskop, vilket gör det möjligt för många djur som ska behandlas samtidigt. Cellulära svaren på skadan kan studeras genom live-avbildning i larven chip.
Protocol
1. Göra PDMS Chip
För att göra en PDMS-chip från SU-8 mögel, följ steg 1,1-1,7. Om ett chip finns till hands, men måste monteras för att användas, gå till steg 1.8.
- Blanda 45 g av PDMS bas och 4,5 g härdare (10:1) från en PDMS-kit i en liten engångsplastbehållare och blanda dem ordentligt med hjälp av en plast uppståndelse pinne.
- Placera behållaren i en vakuumbehållare (t ex en torkapparat) under 10 min för att avlägsna eventuella bubblor.
- Placera SU-8 mögel på botten av en 150 mm diameter plastskål och långsamt hälla PDMS blandningen på formen. Se till att inte generera bubblor medan hälla PDMS.
- Bota PDMS i en ugn (eller inkubator) vid 650 ° C under 4 timmar.
- Ta bort den härdade PDMS/SU-8 formen ur ugnen och låt den svalna några minuter.
- Med hjälp av ett rakblad, skär de härdade PDMS längs kanten av SU-8 mögel och ta loss den från SU-8 mögel.
- Dela upp PDMS plattai enskilda PDMS chips med hjälp av ett rakblad.
- Med hjälp av en 21 G doseringsnål, peta ett hål i vakuumport (visas i fig. 1A) av PDMS-chip.
- Ta en 23 G doseringsnålen och vrid nålspetsen från sin bas ett par gånger för att bryta nålen tippa bort från låset navet.
- Sätt i 23 G nålspetsen in i en liten bit av polyetenslang så att slangen täcker minst en millimeter av nålen. Använd sedan ett rakblad för att skära den överskjutande slangen bort från nålen. Detta skapar en plastring runt en ände av nålen, vilket kommer att skapa en tätning när de sätts in i vakuuminsugsporten.
- För användning med ett omvänt mikroskop (figurerna 1B och 2A-B): ange det 23 G nålspetsen in i hålet hos vakuumporten. För användning med en upprätt mikroskop (figurerna 1C och 2C-D): peta ett andra hål på sidan av PDMS-chip med en 21 G dispensing nålen, kommer detta hål ge åtkomst till det första hålet från sidan. Sätt sedan den 23 G nålspetsen med slang ring i sidan hålet. Placera en bit dubbelsidig tejp över toppen av PDMS-chip för att försegla det övre hålet (Figur 1C).
- Ta ett stycke av polyetenslang som är ungefär 20 cm lång. Anslut en sida av slangen för att nålspetsen som är införd i vakuumporten.
- Anslut den andra sidan av slangen till en av hamnarna i ett 3-vägsventil (se '3-vägs kranen "i listan med material)
- Bifoga en 20 ml spruta in i en av två kvarvarande portar. Den sista porten är öppen mot omgivningen.
2. Använda Larva Chip för Live avbildning
- Rengör PDMS-chip med genomskinlig tejp. Fäst en bit tejp på undersidan av chip. Se till att tejpen vidrör hela PDMS ytan, och sedan dra av tejpen.
- Upprepa ovanstående steg 2-3x för att se till att detfinns inga partiklar eller olja (som behållits från tidigare experiment) på ytan av PDMS-chip. Sedan PDMS chip är återanvändbar, är det mycket viktigt att ta bort oljerester eftersom det kan påverka vidhäftningen av PDMS till glas och resultera i otillräcklig tätning.
- Överför tidigt (dvs. födosök) 3: e INSTAR larver till en petriskål med vatten. (Den födosök 3: e instar larver finns i livsmedlet, snarare än vid sidan av odlingsflaskan). Nedsänk larverna i vatten för att avlägsna odlingsmediet.
- Ta en ren täckglas och placera en liten droppe Halocarbon 700 olja i centrum.
- Använd pincett, försiktigt plocka upp en ren, tidig-iscensatt 3: e INSTAR larv från vattnet (larven ska vara ~ 3,5-4 mm i längd). Placera djuret en kort stund på en lätt torka eller pappershandduk för att avlägsna överflödigt vatten, och sedan placera den på oljedroppe. Minskningen bör vara tillräckligt liten så att luftstrupen av larverna inte är belagda. Låt larven stay på olja droppe för 10 sek.
- Ta larven från oljedroppe och sedan placera den på en ren täckglas.
- Överför larven till en annan rent glas täckglas. Detta steg tar bort överflödig olja.
- Var uppmärksam på larv orientering. För avbildning neurala sladd och segmentella nerver, bör den ventrala sidan av larven sitter på täckglas. Dess ryggsidan, som kännetecknas av två längsgående Trakealtuber, ska vara vänd uppåt. OBS: Detta är orienteringen larven föredrar naturligt.
- Placera försiktigt PDMS chip ovanpå larven. Larven bör anpassas till mitten mitten av mikrokammare, med svansen orienterad mot vakuumporten. Var försiktig så att larven inte vidrör kanterna på kammaren. Detta är särskilt viktigt för de främre och bakre luftstrupen terminaler. OBS: detta steg görs bäst under ett stereomikroskop.
- Tryck PDMS chip mot glaset täckglas för att uppnå en bra tätning. Se till att larven är heltsom omges av en mikrokammare när PDMS chip vidrör glaset täckglas.
- Slå på 3-vägsventil på så att sprutan kan dra luft från PDMS mikrokammare (genom slangen) för att skapa ett vakuum.
- Med ena handen, håll PDMS chip / glas täckglas ordentligt. Använd den andra handen för att dra ut sprutkolven. Dra 2-2.5 ml luft, tills ett motstånd känns i spruthandtaget, för att skapa vakuum. Vakuumet skapar en tätning mellan PDMS-chip, olja, och täckglas gränssnitt och begränsar rörligheten hos larven.
- Switch ventilen bort så att PDMS chip isoleras från sprutan och från omgivningen. Som ett resultat är en relativt stabil vakuumnivå upprätthålls i mikrokammaren utan behov för att hålla sprutkolven.
- Kontrollera larven under stereoskop för att se till att hela djurkroppen placeras inuti mikrokammaren, och att djuret är orörliga. Luftstrupen bör synas. Resten avPDMS-chip ska vara i kontakt med täckglas. OBS: Se figurerna 2E och 2F för exempel på djur på rätt sätt immobiliserade i chipet. Vissa felaktiga orienteringar visas i fig 2G och 2H.
- Placera larven chip (PDMS chip + täckglas) på mikroskopet. Larven chip, slangen och sprutan ska hanteras varsamt för att undvika avlossning av PDMS chip från täckglas. För en upprätt mikroskop, fixa den "övre" sidan av chipset till mikroskop scenen med dubbelhäftande tejp (Figur 1C).
- Använd en hög förstoring mål (olje-nedsänkning, 40-63X rekommenderas) för att hitta djurets struktur (er) av intresse och utföra bildbehandling. I vissa fall kan en lägre förstoring att behövas för att identifiera den önskade regionen för avbildning före övergång till högre förstoring.
- När avbildning är klar, frigöra vakuumet genom att stänga ventilen till den positionsom är öppen mot omgivningen.
- Lossa PDMS chip från täckglas. Larven bör omedelbart rörliga.
- Använd pincett för att ta bort larven från mikrokammare och försiktigt placera larven på en druvjuice agarplatta för återvinning.
3. Induktion en Nerve krosskada på Larvernas segment nerver
- Följ steg 2.3 ovan för att isolera tidigt iscensatt 3: e INSTAR larver av önskad genotyp. Såsom beskrivs i steg 2,3 bada larverna i vatten för att avlägsna maten.
- Använd en vanlig fluga CO2 anesthetization station, med CO 2 pad hålls under en dissektion stereomikroskop, för att dämpa larverna. Larver bör bli immotile efter placering på CO 2-pad för 1-2 minuter.
- Nu placera ett enda sövda larv på en druvsaft agarplatta under stereomikroskop. Vrid djuret ventrala sidan uppåt för att visualisera den ventrala nerv sladd och segment nerver genom nagelband (
- Använda Dumostar nummer-5 pincett, nyp de segmentella nerver tätt genom nagelbanden för 5-10 sek. När detta är gjort på rätt sätt, nagelbanden intakt och kroppsväggen inte är perforerad. Obs: Skadan kan genomföras vid olika positioner längs de främre-bakre kroppsaxeln, så länge som den ventrala nerv sladd, spottkörtlar, och tarmar inte är skadade. Den mest effektiva skada platsen är mot slutet av den 3: e delen av buken segmentet, såsom visas i fig. 3D. Skada på denna plats skadar flest nerver och är lättast att återge utan att döda djuret.
- Efter skadan, slå djuret så att dess ventrala sidan nedåt på druvan plattan. Den bör kunna röra sitt huvud och äta. Om skadan var framgångsrik, då den bakre halvan av larven ska förlamad.
- Håll skadade djur på druvsaft agarplatta vid 25 &# 176, C för önskad tid enligt den experimentella målet. För motoneuroner börjar proximala stump att gro inom 8-10 tim för skador 14 och den distala stumpen börjar att degenerera inom 6-8 h. 15. För klass IV da sensoriska nervceller börjar proximala stump att gro inom 4-6 timmar, och den distala stumpen börjar urarta inom 3-4 timmar efter skada. Notera: med lämpliga Gal4 drivrutiner och fluorescerande reportrar, kan observeras groning och degeneration i larven chip (till exempel, se figur 6).
Representative Results
Larvaen chip består av ett enda skikt PDMS-block, (a PDMS chip) vars konstruktion beskrivs i schematisk i figur 1. (Se även kompletterande DXF-fil för att designa din egen mögel). Larvaen mikrokammare, vakuumport och omkretskanaler (Figur 1A) är 140 ^ m fördjupningar i PDMS-chip. Chipet är placerad på toppen av en tidig staged 3: e instar larver, som vilar på toppen av ett täckglas med olja (figurerna 1B och 1 C). Den oljeglasytan mellan täckglas och PDMS-chip medger en tätning skapas vid anbringande av ett milt vakuum. Denna tätning fångar larverna i kammaren, och sedan början iscensatt 3: e INSTAR larv är något tjockare än kammaren, tätning kammaren skapar en viss fysisk sammandragning på djuret, effektivt immobilisera och begränsa dess rörelse. I detta immobiliserade tillstånd, vissa ventralakroppsstrukturer, såsom den ventrala nerv sladd och segmentell skjuts nära täckglas. Detta är fördelaktigt för avbildning, eftersom den immobiliserade tillståndet dessa strukturer kan ligga inom arbetsavstånd av 40X och 63x mål. Efter det att vakuum släpps, kan larven lätt avlägsnas från mikrokammaren, vilket gör att ytterligare experiment som skall utföras. Detta rent mekanisk immobilisering tillvägagångssätt kan hålla 90% av larver lever efter löpande immobilisering perioder på upp till 1 tim 12.
Vakuumet skapas av en enkel 20 ml spruta, därav hela enheten är lätt att transportera från ett stereomikroskop, där placeringen i kammaren utförs, till en konfokala eller epifluorescensmikroskop, där levande avbildning utförs. Sprutan är ansluten till vakuumporten via polyeten slang och 23 G doseringsnålar (med lås nav bort), så som beskrivs i steg från 1,6 till 1,14. För inverterade mikroskop, slangenoch sprutan är anslutna via den övre delen av chipet (figurerna 1B, 2A och 2 B). För upprätt mikroskop, de är förbundna via en port på sidan av chipset (fig. 1C, 2C, och 2 D). Konfigurationen för inverterade mikroskop är något lättare att använda. Sprutan dras för att skapa en mjuk vakuum (på ca 10 psi), vilket binder olja-glas-PDMS-gränssnittet för att bilda en tätning mellan täckglas och PDMS anordningen, fånga och immobilisera larven inuti kammaren.
Placeringen av larven in i mikrokammaren (steg från 2,7 till 2,10 i protokollet) är avgörande för effektiv immobilisering och överlevnad (figur 2E-H). Om djuret är för stort för kammaren (figur 2G) eller om dess huvud eller trakea fastnar mellan kanten av kammaren och lockenläpp (figur 1H), så är det osannolikt att överleva förfarandet.
Följande är några exempel på användningen av larv chip för att studera olika cellulära responser i neuroner (fig. 4-7, Bio S1 och Movie S2).
Imaging av snabb axonal transport: Larven chip användes för att bilden av kinesin-medierad transport av synaptiska vesiklar inom enskilda perifera axoner (Figur 4 och Film S1) Den antero (~ 1,0 ìm / sek) och retrograd (~ 0,8 nm / sek. ) förflyttning av dessa blåsor kan lätt studeras från filmer som samlats på en snurrande skiva konfokalmikroskop.
Placering av djuret för lasermikrokirurgi:. En sensoriska neuron Dendrite var transected använda en pulsad UV färgämneslaser (Figur 5 och Film S2) protokoll för användning av tfinns hans metod för mikrokirurgi på annat håll 16,17. Den effektiva immobilisering teknik möjliggör snabb tidsskala förändringar i den skadade neuron, såsom förändringar i intracellulär kalcium (detekteras av genetiskt kodade Ca 2 + indikator GCamp3.0 18), som skall detekteras och mätas (Figur 5).
Studie av regenerativa och degenerativa svar på skada: Om djuret får vila mellan avbildning sessioner, larven chip sedan användas för att studera cellulära händelser som sker över ett stort spektrum av tidsskalor. Till exempel, både "regenerativ" och degenerativa svar på axonal skada, som äger rum över en tidsskala på 15 timmar, kan avbildas i larven chip (Figur 6). I detta exempel var axoner av octopaminergic motoneuroner skadades via segmentell nerv krossa (figur 3), som beskrivs i del 3 i protokollet. Den proximala Axon stubbe,som undergår nya groning, och de distala axoner, som bildar varicosities och sedan blir fragmenterad genom processen Wallerian degeneration, kan avbildas och studeras vid olika tidsintervall efter skadan.
Spårning photoconvertible fluorescerande proteiner med tiden in vivo: Utvecklingen av photoconvertible fluorescerande proteiner, vars fluorescens förändras irreversibelt vid exponering för UV-ljus) gör att man specifikt märka en delmängd av proteiner i en cell, och spåra öde de märkta proteinerna över tiden 19 , 20. Denna teknik är oftast utföras i cellkultur, emellertid, med larven chip en kan spåra genetiskt kodade photoconvertible proteiner inom definierade celler in vivo. Som exempel visar vi att Denda2-α-tubulin fusionsprotein, uttryckt i klass IV da sensoriska nervceller, kan photoconverted i cellkroppar (fig. 7A och
Samtliga av de beskrivna exemplen (fig. 4-7 och filmer S1 och S2) avbildades med hjälp av en snurrande skiva konfokala systemet, bestående av en Nipkow CSU10 scanner och en C9100-50 EMCCD kamera, monterad på en Axio Observer med 63X (1,5 NA) olja mål, och drivs med hjälp av Volocity förvärv programvara.
Figur 1. Schemat karikatyrerna för att använda larven chip.
(A) Den larv chip består av PDMS-chip, som anges i ljusblå, vidhäftat till ett täckglas. Chipet innehåller 140 nm tjocka mikroflödessystem kanaler, anges i vitt. Den centrala mikrokammare är utformad för att tätt passa en tidig iscensatt 3: e INSTAR Drosophila larv (cartooned i ljusgrön). En DXF-fil som innehåller exakta dimensioner som kan användas för att utforma formen anges som kompletterande data. Skala bar = 1,5 mm. (BC) Side-vyer av scheman för påfyllning av en larv i en larv chip. Larven sitter ventrala sidan på ett täckglas, och dess kropp ligger inom 140 ìm djupa mikrokammare. En 20 ml spruta, är ansluten till vakuuminloppsport och används för att framkalla en mild vakuum. Den Halocarbon olja-PDMS-glas gränssnittet är bunden av vakuumet i en tät försegling, vilket begränsar larven i mikrokammaren. Denna tätning är lätt att återställagenom att släppa trycket ur sprutan, varefter djuret återfår omedelbart motilitet. För upprätt mikroskop (B) är sprutan vakuum ansluten via Polyetylen-50 slangen från toppen av chipet. För omvänt mikroskop (C) är dessa anslutningar göras från sidan av chipet, medan "övre" av chipset är fäst till mikroskopställningen via dubbelhäftande tejp.
Figur 2. Bilder av PDMS-chips och korrekt positionering av larven.
(AD). Fotografier som visar PDMS marker för inverterade och upprätt mikroskop. Den 23 G dispense nålspetsen har införts i vakuumporten, vilket möjliggör anslutning via slang till vakuum (spruta). Scale bar = 1,5 mm. (EH). Drosophila larver. E och F visar exempel på korrekt immobiliserade djur. Den mindre djur i F är att föredra om flera bilder över långa tidsskalor (> 12 tim) kommer att genomföras. G visar ett djur som är för stor, och H visar ett litet djur som felaktigt placeras. Skala bar = 1,5 mm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Nerv krosskada av segmentella nerver i Drosophila larver.
(A) Cartoon av nerv krossa analysen. Den segmentella nerver i en 3: e (B) Vy över larver nervsystemet från ett djur dissekerade 20 timmar efter nerv krossa. Immunfärgning av neuronala membran med anti-HRP-antikroppar (röd) belyser hjärnans lober, ventrala nerv sladd, och långa segmentella nerver som innehåller motoneuron och sensoriska neuron axoner. En undergrupp av enskilda motoneurons märks genom att driva uttrycket av UAS-mCD8-GFP (grönt) med m12-Gal4 drivrutin. Cellkroppar och dendriter från dessa nervceller ligger i ventrala nerv sladd, medan deras axoner skjuter till kropp vägg muskler via segmentella nerver. (Detta Föraren också GFP-uttryck i muskel 12 för varje larv hemisegment, vilka tillsammans kan ses som anterior-posterior-ränder på vardera sidan av djuret). Regionen skadas av krossa markeras med blå prickade linjer. Skala bar = 70 nm. (C) Närbild vyer av skadade axoner, 20 timmar efter skada. Vänster: detproximala axon har genomgått groning och ny tillväxt. Höger: den distala Axon är fragmenterad, med lite GFP kvar, på grund av Wallerian degeneration och röjning av skräp. Skala bar = 10 um. (D) Bilder av nerv krossa i en tidig 3: e INSTAR larv. Den röda pilen pekar på den ventrala nerv sladd. Placeringen av krossa är mot botten av den 3: e segmentet, såsom beskrivs i protokollet texten (protokoll 3). Bilderna i D var ursprungligen publicerad i J. Cell Biol 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Time-lapse avbildning av axonal transport av peptiderga synaptiska blåsor. Denråtta atrial natriuretisk peptid ANF taggade med GFP, UAS-ANF-GFP 21, uttrycktes inom specifika motoneuroner hjälp av eve-RRa-Gal4 förare 22. Live avbildning av segmentella nerver avslöjar den snabba transporten av ANF-GFP märkt peptiderga blåsor i axoner. Se även film S1. (A) Enstaka ramar motoneuron axoner från live-time-lapse avbildning. Gröna, röda och blå pilarna visar exempel på antero, stationära och bakåtsträvande blåsor, respektive. Skala bar = 5 ìm. (A ') Individuella tidsramar från filmen slogs samman med ImageJ. (B) En kymograph genereras från time-lapse avbildning av ANF-GFP transporter, genererades från en samling av enskilda bildrutor som spänner över en minut av avbildning tiden med "Multiple kymograph" plug-in för ImageJ 23. (C) Kvantifiering av medelvärdessegmenthastigheter, vilket beräknades från sluttningarna av segmenterade spår i kymographs. Den gröna stapeln prets anterosegmenthastighet (n = 543) och den blå stapeln visar retrograd segmenthastighet (n = 548) av blåsor från 10 kymographs. (D) Kvantifiering av partikeldensitet. Partikeldensitet mättes med antalet antero (visas i grönt bar), stationära (visas i rött bar) och bakåtsträvande (visas i blått bar) partiklar per 100 nm av Axon längd från 10 kymographs. Data i denna figur har också tidigare publicerats i Ghannad-Rezaie et al, PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).
Figur 5. Användning av larven chip för lasermikrokirurgi och kalcium avbildning.
En dendrit från en klass IV sensoriska neuron transected av med kraftfulla laserpulser från en pulsad UV färgämneslaser. Protokoll för att använda denna metod för mikrokirurgi kan hittas någon annanstans 16. Den effektiva immobilisering i larven chip möjliggör snabba förändringar i intracellulära kalciumnivåer som ska studeras av levande avbildning. I detta exempel var det genetiskt kodade kalcium indikator GCaMP3.0 uttryckt i klass IV dendritiska arborization (C4da) sensoriska nervceller med hjälp av PPK-Gal4 förare. (A) Time-lapse bilder av GCaMP3.0 intensitet var falska färgad enligt färg intensitetsskala för att indikera förändringar i intensitet över tiden. Enskilda bildrutor extraherades ur en time-lapse-film (Film S2) avbildas på en snurrande skiva konfokalmikroskop på 5 bilder / sek. (B) Kvantifiering av kalcium dynamik som svar på lasermikrokirurgi. Den normaliserade faldig förändring av soma GCaMP3.0 fluorescensintensitet (ΔF/F0) av enskilda nervceller plottades mot tiden (n = 7, som visas i grått). Den genomsnittliga ΔF/F0 representerades i orange. Den högsta ökningen av GCaMP3.0 intensitet observerades mellan 1-2 sek efter skada. Bakgrund subtraherades från den råa G-CaMP3.0 fluorescensintensitet. Data i denna figur har också tidigare publicerats i Ghannad-Rezaie et al, (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12.
Figur 6. Imaging axonal groning och degenerering använder larven chip. Representant konfokala bilder av den proximala stumpen (vänster) och distala stumpen (höger) i octopaminergic motoneuron axoner vid olika tidpunkter efter nerv krossa. Bilder togs vid liknande platser som visas i figur 3C. Dessa nervceller är märkta genom att driva uttryck av en UAS-mCD8-RFP transgen använder Tdc2-Gal4 förare 24,25. Cellen organ för dessa nervceller ligger i ventrala nerv sladd 24. Tre individuella axoner kan ses inom en enda segmentell nerv, och kan lätt lösas från varandra. Detta är en idealisk situation för att studera enskilda cellulära händelser, till exempel fragmenteringen av degenererande axoner, som är klar inom 15 timmar för dessa nervceller. Bilder erhölls från levande djur som använder larven chip vid 63x förstoring på en snurrande skiva konfokalmikroskop. Skala barer = 10 mikrometer för vänster paneler (proximala stubbar) och 20 nm för högra panelerna (distala stubbar). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 7. Använda larvchip för att spåra photoconverted fluorescerande proteiner över långa tider och sträckor i levande djur.
I detta exempel, ett fusionsprotein av den photoconvertible fluorescerande protein Dendra2 19, fuserad till α-tubulin, uttrycks från en UAS-Dendra2-α-tubulin-transgenen i klass IV dendritisk arborization (C4da) sensoriska neuroner, med hjälp av PPK-Gal4 drivrutin 26. (A) Schematisk för photoconversion experimentet. Cell kroppar C4da nervceller ligger i periferin och utöka axoner genom segmentella nerver att bilda synaptiska terminaler i nerven sladden. Den Dendra2-α-tubulin i en delmängd av cellkroppar i den bakre halvan av djuret utsätts för photoconversion genom UV-belysning för 6 sekunder med en vanlig DAPI filter med Hg-lampa (vänster tecknad). Efter tiden, kan det photoconverted Dendra2-α-tubulin upptäckas vid synaptiska terminaler i den ventrala nerv sladd. Detta indikerar att tubulin proteinet har transported över långa avstånd (av ~ 1-2 mm). Skala bar = 1 mm (B) Exempel bilder av Dendra2-α-tubulin i en klass IV sensoriska neuron cellkroppen före och efter photoconversion. Skala bar = 5 ìm. (C) t.ex. bilder av synaptiska terminaler för klass IV sensoriska neuroner vid antingen 0 h eller 48 h efter photoconversion av cellkropparna. Det specifika utseendet på photoconverted Dendra2-α-tubulin vid de synaptiska terminaler efter tid antyder att proteinet rest från cellkroppen till axonet terminus. Photoconversion och bildbehandling vid alla tidpunkter genomfördes i larven chip. Skala bar = 15 nm. Klicka här för att visa en större bild.
Film S1. Laser mikrokirurgi och kalcium avbildning av en C4da neuron. En pulsad UV-laser användes för tvärsnitt av en primAry dendritiska gren. Lasertransection inducerade en snabb ökning av GCaMP intensitet, som började vid platsen för skadan och reste till cellkroppen. UAS-GCaMP3.0 18 uttrycktes med hjälp av C4da specifika PPK-Gal4 förare 26. Filmerna var falska färgade för att indikera de relativa intensitetsnivåer GCaMP3.0. Den tidsförlopp avbildning utfördes med snurrande skiva konfokalmikroskopi på 5 bilder / sek.
Movie S2. Snabb axonal transport av ANF-GFP i motoneuroner.
Råttan atrial natriuretisk peptid ANF taggade med GFP, UAS-ANF-GFP 21, uttrycktes inom specifika motoneuroner hjälp av eve-RRa-Gal4 förare 22. Transporten av dessa peptiderga vesiklar inom larver segmentella nerver avbildades på larven chip på 300 ms / ram med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskop.
Kompletterande Figur 1 (DXF-fil)
DXF-fil för kiselform tillverkning. Filen är avsedd för negativ fotoresist mask (mörk arkiveras mask för SU-8) på en 4 tums kiselskiva. Den andra raden innehåller fem formar för att göra larven chips som används i detta protokoll. Var och en av dessa marker (i rad 2) innehåller en ~ 5,4 mm x 1,5 mm kammare utformad för att passa ett tidigt stadium 3: e INSTAR larv. Den första raden (rad 1) innehåller en större kammare (~ 5,4 mm x 2 mm), medan den tredje raden (rad 3) innehåller en mindre kammare (~ 4.4mm x 1,5 mm). Dessa kan användas tillsammans med larver av större och mindre storlekar, respektive. Scale bar = 2 mm.
Discussion
Ringa eller få larven chip:
Larvaen chip består av en PDMS-block (det så kallade PDMS chip ") fäst till ett täckglas. Protokollet i steg 1 beskrivs förfarandet för framställning och användning av larv chips, förutsatt en SU-8 mögel finns. SU-8 mögel är mikrofabricerade genom fotolitografiskt mönstring en 140 nm tjock SU-8 fotoresist skikt på en kiselskiva (för detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Eftersom mikrofabrikation av SU-8 mögel kräver tillgång till specialutrustning, rekommenderar vi att beställa den från ett mikrofabrikation anläggning (t ex. Den LNF anläggningen vid University of Michigan 14), eller från ett gjuteri genom att skicka dem till chip design som tillhandahålls som en kompletterande fil. Om man önskar ändra utformningen av PDMS-chip (t.ex. för användning i larver av olika storlekar), ett CAD-program som hanterar DXF-filer (exempelvis AutoCAD) kan användas. En SU-8 mögel kan också göras i egen regi följer instruktionerna i Mondal et al. Kan 27 Många läsare tycker det är bekvämt att helt enkelt få ett prov PDMS-chip för att testa tekniken innan fabricera sina egna marker. Detta kommer att göras fritt tillgänglig på begäran.
: Användning av mikroflödessystem "larv-chip" för live-avbildning
Immobiliseringen metod i larven chip undviker användningen av bedövningsmedel, och i stället innebär tryck, via applicering av ett vakuum, för att begränsa djurets rörelse. Även djur kan överleva immobilisering i chippet för flera timmar 12, en kortare immobilisering period (5-15 min) rekommenderas. Detta är tillräckligt med tid för att avbilda många cellulära händelser av intresse, däribland förändringar i intracellulär kalcium, eller snabb axonal transport. Det är också tillräckligt med tid för önskade manipulationer i levande djur, såsom laserbaserade mikrokirurgi, fotoblekning och photoconversion.
För att studera händelser i längsled över en längre tidsperiod i ett enskilt djur, kan djuren placeras i chipet och avbildat flera gånger, åtskilda av perioder av vila. Druvsaft agarplattor är idealiska för att vila mellan avbildning sessioner, eftersom de ger en enkel näringskälla och fuktighet. Flera avbildning sessioner gör påverkar larvöverlevnad till en grad, eftersom varje session medför en viss risk för att skada djuret (se del 2 i felsökning, nedan). Djur kan rutinmässigt avbildas> 5 gånger under loppet av två dagar med mer än 50% överlevnad. Eftersom djuren inte bedövas, de är friska och rörliga omedelbart efter frisläppande av vakuumet i chippet. Det finns därför inget behov av återhämtningstid mellan avbildning sessioner, så att tidsavståndet mellan sessionerna är flexibel och kan anpassas till målen för försöket.
Felsökning:
Den vanligaste tekniska ärstämmer med larv chip och rekommenderade lösningar är följande:
(1) Djuret rör sig för mycket. För mycket rörlighet kan störa avbildning mål. De vanligaste orsakerna till detta i larv-chip är a) djuret är för liten för chip, eller b) vakuumtryck appliceras under immobilisering steget äventyras. Larven chip som beskrivs i detta protokoll är avsedd för tidig iscensatt 3: e INSTAR larver. Den optimala storleken för djuret är 3,5-4 mm i längd (längs anteroposterior axeln). För att säkerställa att vakuumtrycket räcker, dra sprutan 2-2,5 ml, eller tills ett motstånd känns i handtaget. En indikation på att vakuumet fungerar är att små bubblor i omkretsen kanalen kan ses röra sig långsamt mot vakuumkällan. En annan indikation är att täckglaset alltid ska färdas med chipset när chips lyfts från toppen (och detta är den rekommenderade metoden för att transportera kammarennär larverna är placerade och vakuumet är på). Vakuumet kan äventyras om det finns sprickor i slangen, eller om det finns olja i slangen. Detta kan enkelt åtgärdas genom att ersätta 23 G dispense nålspets och polyetylen-50 slang (från steg 1,6 till 1,14).
(2) Djuret dör efter avbildning i chipet. Metoden används för att orsaka minimal påfrestning på djur, och djur av vildtyp genotypen har en> 90% överlevnad, även efter en timmes immobilisering på chipet 12. Eftersom vissa genotyper kan vara mindre motståndskraftiga mot stress av chipet, först kontrollera att vildtyp djur (t.ex. Canton S) överleva immobiliseringsteknik. a) Den vanligaste orsaken till dödlighet är felaktig placering av larven (se figur 2G-H). Om delar av nagelband, huvudet och luftstrupen är inte helt i kammaren, då de kan bli skadade under immobilisering, och enlarv som är för stor för chip (> 4 mm) är mindre benägna att överleva. b) En mindre vanlig orsak till dödlighet är användningen av alltför mycket tryck eller vakuum vid lastning chipet. När rätt läge i chippet, är det tryck som alstras av vakuum tolereras väl. Men överdrivet tryck, antingen från vakuum eller i det inledande skedet av att placera djuret kan vara ett problem. Det är bäst att ta reda på graden av tryck som behövs empiriskt genom försök med vildtyp larver av korrekt storlek. c) Om för mycket Halocarbon olja täcker djurets luftstrupe djuret kan eventuellt har problem med långsiktig överlevnad. Oljan spelar flera viktiga roller i chippet: det är viktigt att skapa vakuum, optiken under bildbehandling, och det motverkar uttorkning i chipet. Men alltför olja bör undvikas. (Detta kan också leda till olja i slangen och sprutan, att kompromissa med vakuum). De föreslagna protokoll rockar bara den ventrala sidan av larven med olja, sedan reFlyttar överflödig olja genom placering av larven på en ren täckglas innan de överförs till sluttäckglas för avbildning. d) fototoxicitet kan upplevas från avbildning session. Som med alla levande bildprogram, är det idealiskt att använda korta exponeringstider med låg intensitet laserljus, vilket bäst uppnås med hjälp av en mycket känslig kamera eller detektor. Försök att minimera belysning med UV-ljus, också brett spektrum ljus skapat av Hg-ljuskällor.
Övriga frågor och framtida inriktningar:
Eftersom denna metod inte utnyttjar anestetika fortsätter djurets hjärta att slå. Detta skapar en viss oundviklig rörlighet, vilket påverkar avbildning på vissa platser mer än andra. Exemplen här visar att den ventrala nerv sladd, segmentella nerver och kroppsväggen lätt kan avbildas utan inblandning från hjärtslag. I de fall där hjärtslag påverkar bildbehandling, kan de vanliga rörelserna ibland korrigeras för medi analysprogram (t.ex. bildstabilisatorn plugin för ImageJ). Detta fungerar bra när enskilda objekt rör sig i en snabb tidsskala (till exempel ~ 1 mikrometer / sek för snabb axonal transport) eller på en mycket långsam tidsskala (minuter till timmar). Emellertid, när objektet (er) av intresse rör sig med ett intervall av hastigheter och riktningar, kan det vara svårare att korrigera för de enskilda puls inducerade rörelserna.
En annan fråga är liten variation i optik från djur till djur, eller mellan flera avbildning sessioner av samma djur i chippet. Ju djupare föremålet av intresse är inom djuret, ju större denna variation kommer att bli. Segmentella nerver och den ventrala nerv sladd är normalt för djupt inom då djur som skall avbildas med jämna mikroskop. Men den milda trycket erfarenhet av larven chipet driver dessa strukturer mycket nära nagelbanden och täckglas. Den exakta avståndet av dessa strukturer från täckglas kommer att ha små variationer från trIAL till rättegång. Variationen för föremål stänga nagelband, såsom cellkropparna av sensoriska neuroner, är mindre. Det är därför viktigt, särskilt för att göra mätningar av intensitet, för att använda ett stort antal djur och oberoende studier att ta hänsyn till variationen i optiken.
Även om de exempel som visas här har fokuserat på processer inom nervceller bör närma sig vara mottaglig för avbildning av varje struktur i djuret som kan föras inom fokuseringsdjupet hos mikroskopobjektivet. Detta inkluderar nagelbanden, kropps vägg muskler, och deras NMJs. Trakea på den ventrala sidan av djuret och eventuellt delar av mag-tarmkanalen kan också avbildas. Djuret kan även placeras med sin ryggsidan mot täckglas för kortsiktiga avbildning av strukturer nära dorsala ytan. Förmågan att bilden strukturer djupt inne i djuret är begränsad av arbetsavståndet hos mikroskopobjektivet användas. Strukturer såsom imaginal skivor är oåtkomliga för hög förstoring (t.ex. 40X) mål.
Larven marker som beskrivs i detta protokoll är utformade för larver i början av 3: e stadiet stadiet (varierar i storlek 3,5-4 mm). Men många intressanta frågor kräver bildbehandling vid olika larvstadier. Mindre marker för att rymma 2: a stadiets larver, eller större chips för att rymma sent 3 rd instars kan enkelt utformad enligt samma princip. (Kompletterande Figur 1 innehåller en lätt modifierbar DXF-fil för att göra silikonformar med förändrade kammarstorlekar). Den enkla principen för reversibel tätning kan även tillämpas på andra organismer, såsom C. elegans eller zebrafisk, där huvudvariant är kammarens storlek. En användbar framtida inriktning är att utforma ett chip som kan immobilisera många djur på en gång, som ska användas för screening. Men för detta, skulle konstruktionen behöva vara betydligt annorlundafrån den aktuella enheten, där frågan om att placera djuret i chippet måste hanteras för varje djur självständigt.
Den nerv krossa analysen för att studera reaktioner skada i larv perifera nerver:
Nerven kross analys som beskrivs här för larver segmentella nerver är en enkel metod för införande av en skada på perifera axonerna i Drosophila. Fördelarna med denna metod är: a) det är enkelt att göra med standardverktyg som finns i en Drosophila lab (ett stereomikroskop CO2 källa och tång), b) det kan genomföras snabbt för många djur, vilket gör biokemisk analys av nerv sladdar efter skada genomförbart 14, c) de molekylära och cellulära svaren på denna skada är mycket reproducerbara 14,15,28 och kan användas för att upptäcka processer som är viktigt i ryggradsdjur nervceller 29,30.
Alternativa metoder för att skada nervceller är att focusa hög effekt laser, exempelvis en pulsad-UV eller femtosecondlaser, att bryta en axon via lasermikrokirurgi 17,31-33. Larvaen chip är en idealisk metod för positionering av djuret för en sådan mikrokirurgi. Men på grund av mindre skillnader i optik mellan försöken, som diskuterats ovan, kan den laserbaserade metoden vara svårare att reproducera i larver, särskilt i larvsegmentella nerver. Dessutom kräver laserbaserad axonal skada mer tid för att placera varje djur, och därför är svårare att genomföra i stor skala (med ett stort antal djur).
Felsökning:
Den vanligast förekommande teknisk fråga från nerven krossa är död från skador på inre organ. Vid genomförande av trängseln, är det viktigt att du inte klämmer den ventrala nerv sladd, spottkörtlar, eller tarmar. Det är också viktigt att inte punktera nagelbanden. Dessa frågor är bäst undvikas genom att pincetten i 45 ° vinkel mot nagelbanden surface (se figur 3).
Kvaliteten av tången har en stor inverkan på hur effektivt krossa och överlevnad efteråt. Vi rekommenderar Dumostar nummer 5 pincett. För att behålla sin skärpa, måste tången hanteras varsamt, som inte används för andra ändamål, och ersätts när de blir slöa eller böjda.
Storleken på djuret kan också påverka effektiviteten i trängseln. Små djur (mindre än 3 mm i längd) är mycket mindre sannolikt att överleva skadan. Med stora djur, (vandrande 3: e instars), är det svårare att hitta nerverna och undvika skador på de större spottkörtlar och tarmar, och det finns mindre tid att studera svaren skada innan förpuppning. Nerven krossa är mest effektivt genomförs i början av 3 e INSTAR larver (som är ~ 3-4,5 mm i längd längs anteroposterior axeln).
Den näringskälla att djuret höjs på kan påverkastyrkan i nagelband och överlevnad efter krossa. Det rekommenderas att föda upp djur i livsmedel som framställts av en vanlig jäst-glukos recept.
Den bästa metoden för att lära sig att göra det krossa ett effektivt sätt är att träna på många djur, först med det primära målet att uppnå överlevnad (och inte förpuppning) 24 timmar efter att krossa. Nybörjare har normalt en låg överlevnadsgrad (t.ex. 10%), men när tekniken är lärt, kan överlevnaden nå ~ 90%.
Övriga frågor och framtida inriktningar:
Den krossa analysen ger en kraftfull metod för att studera den spirande av Axon proximal till platsen skada och degeneration av axoner och synapser distalt om skadan webbplats. Medan andelen degeneration varierar mellan olika neurontyper, de är mycket reproducerbar inom en viss neuron typ, som ger bevis på reproducerbarhet av analysen skada.
I motsats, den "regenerativa" groningrespons observeras i proximala axoner är mer utmanande att studera. Alla axonerna i segmentell nerv initiera omfattande groning nära skadestället (till exempel, se figur 6 och figur 3). Men omfattningen av groning kan variera från nervcell till nervcell, och är svåra att kvantifiera. Kan observeras en liknande grad och variation i groning efter fler fokala lesioner av enstaka motoneuroner i segmentella nerver som införts med hjälp av en UV-pulsad färgämneslaser. Vi tolkar att det nondiscriminate riktningen på groning är på grund av avsaknaden av vägledning ledtrådar i segmentella nerver. Däremot sensoriska neuron axoner skadades med laser nära sina cellkroppama genomgår ny axonal tillväxt i samma riktning som den förlorade axon 34. Axoner i denna region av djuret sannolikt utsätts för mer specifik positionsinformation för vägledning av de regenererande axoner. Miljön inom segmentella nerver är osannolikt att ha mycket resemblance till den miljö som de axoner ursprungligen navigerat under sin ledning i embryot, alltså inte förväntas ha information för att styra regenererande axoner.
En annan begränsning för att studera regeneration med hjälp av segmentell nerv krossa analysen är att skadade sensoriska och motoneuron axoner har fortfarande ett betydande avstånd att täcka (0,25-1 mm) för att nå sina mål, och en begränsad tid (<3 dagar) innan djuret genomgår förpuppning. En färsk studie har identifierat en genetisk manipulation av prothoraciotropic hormonreceptor som tredubblar varaktighet 3: e instar larver 35. Denna manipulation kommer att förlänga tidsramen för att studera återhämtning och degeneration av nervceller efter skada avsevärt, till 9 istället för 3 dagar. Detta kan vara tillräckligt lång för att observera nya händelser, såsom återanslutning av en skadad axon med sin postsynaptiska mål, särskilt om skadan induceras nära den synaptiska slut.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation, (licensnummer IOS-0.842.701 till CAC) och National Institute of Health (R00MH080599 till BY, R21 NS062313 till NC, och NS069844 till CAC). Vi vill tacka för James Schutt, Emily Han, och Leni Truong för teknisk support, och Bloomington Stock centrum för fluglinor. Alla marker var fabricerade vid Lurie Nanotekniklaboratoriet Facility vid University of Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher Scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in O.D. = 0.125 in |
| Barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way Stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher Scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D., 0.8 mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-544-C | 24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
