Summary
Traditionelle metoder til isolering af opløselige type 1 kollagen (Kol1) kræver omkring 10 dage fra start til slut på grund af langvarige buffer inkubationer og møjsommelig resuspensions af fibriller. Her beskriver vi et middel til at rense Kol1 fra små dermale biopsier i mindre end 3 timer.
Abstract
Opløselig type 1 kollagen (Kol1) anvendes i udstrakt grad som en klæbende substrat for cellekulturer og som et cellulært stillads for regenerativ applikationer. Klinisk er dette protein i vid udstrækning anvendes til kosmetisk kirurgi, dermal injektioner, knogletransplantation og rekonstruktionskirurgi. Kilderne til Kol1 for disse procedurer er almindeligt ikke-humant, hvilket øger risikoen for betændelse og afvisning samt fremsendelse xenobiotikum sygdom. I lyset af dette vil en metode til hurtigt og effektivt at oprense Kol1 fra begrænsede mængder autologt afledte væv omgå mange af disse spørgsmål, men standard isolation protokoller er langvarige og kræver ofte store mængder af collagene væv. Her viser vi en effektiv Kol1 ekstraktion metode, der reducerer den nødvendige tid til at isolere og oprense dette protein fra omkring 10 dage til mindre end 3 timer. Vi valgte dermis som vores vævskilden på grund af dets tilgængelighed i mange kirurgiske procedurer. Thans metode bruger traditionelle udvinding buffere kombineret med kraftig agitation og centrifugalfiltreringsenheden at opnå meget ren, opløselig Kol1 fra små mængder af læderhuden. Kort fortalt dermale biopsier vasket grundigt i iskold dH2O efter fjernelse af fedt, bindevæv, og hår. Hudprøverne fratages noncollagenous proteiner og polysaccharider ved hjælp af 0,5 M natriumacetat og en høj hastighed bench-top homogenisator. Kollagen fra resterende faststoffer efterfølgende ekstraheret med en 0,075 M natriumcitrat-buffer ved hjælp af homogenisator. Disse ekstrakter renses ved hjælp af 100.000 MW cut-off centrifugefiltre der giver Kol1 præparater af sammenlignelige eller bedre kvalitet til kommercielle produkter eller dem, der opnås ved hjælp af traditionelle procedurer. Vi forventer, at denne metode vil lette udnyttelsen af autologt afledt Kol1 for et væld af forskning og kliniske anvendelser.
Introduction
I årtier har forskere og kommercielle leverandører isoleret solubiliseret Kol1 fra et sortiment vævskilder herunder hud og sener ved hjælp af en variant af en simpel syreekstraktionsmetode protokol efterfulgt af neutralisering, hvilket resulterer i en genopslæmning af en matrix af organiserede Kol1 fibriller, der kan anvendes til en lang række biomedicinske anvendelser 1-4. Mens der er mange eksempler på kliniske applikationer til Kol1, få af disse beskæftiger autologt afledt col1 fordi forberedelsen af dette protein kræver langvarige ekstraktioner tage dage eller uger at udføre 5-7. Som et resultat, forskning efterforskere og læger generelt bruge dyre kommercielle præparater af Kol1, der er udarbejdet ved hjælp af ikke-menneskelige væv såsom rotter, kvæg eller svin læderhuden eller ved hjælp af hud fjernes fra døde dyr eller efter mandlig omskæring. For regenerativ applikationer, mange af disse produkter udviser variation med hensyn til deres evne til at danne fastmatricer eller vævskonstruktioner kan understøtte cellebinding og vækst. Derfor er der et udtalt behov for en ny standardiseret metode designet til hurtigt at udtrække Kol1 fra tilgængelige og rigelige autologe væv kilder.
En sådan metode ville spare både tid og penge i forskning indstilling, hvor Kol1 kunne udvindes fra dyremodel af interesse og anvendes til præklinisk afprøvning af manipuleret væv samles på kollagenbaserede stillads. På samme tid, ville have mulighed for at bruge en hurtigt isoleret, autologt afledt col1 i klinikken øge den samlede sikkerhed for patienter, der ellers ville modtage allogene eller xenogene præparater. For patienter, der fik en autogen forberedelse, ville dette strømlinede metode i høj grad reducere intervallet mellem biopsi indsamling og kollagen ansøgning. Af disse grunde vi forsøgt at forbedre på en veletableret Kol1 isolering og rensning metode ved hjælp af high-speed aggrænsning og størrelse-udelukkelse centrifugering. Denne metode er enkel at udføre ved anvendelse af standard buffere og udstyr, der findes i mange laboratorier. Ved at anvende high-speed agitation, vores protokol reducerer den nødvendige tid til at isolere opløselige, dermal Kol1 fra cirka 10 dage til mindre end 3 timer 8. Vigtigt er det, kan denne metode let udføres i det kliniske miljø for at forberede autologt afledt col1 til patienter i løbet af et enkelt sæt procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Her vil vi vise isolering af Kol1 fra lammeskind. Som skrevet, kan protokollen også anvendes med succes isolere Kol1 fra kanin og menneskehud.
1.. Forbered Dermal Sample
- Ækvilibrer alle reagenser til 4 ° C før brug.
- Skyl huden prøve (25-50 g) i iskoldt dH2O og fjerne enhver uld, pels eller hår med hårfjerningsmiddel.
- Brug et enkelt barberblad til at skrabe prøven fri for bindevæv og fedt.
- Skyl prøven i iskold dH 2 O.
- Skær huden prøven i 1 cm x 1 cm stykker med en enkelt barberblad.
2. Fjern Noncollagenous Solubiliseret Material
- Der afvejes 5 g prøve pr 50 ml konisk rør og tilsæt 30 ml iskold 0,5 M natriumacetat.
- Bland rør i 1 minut ved m / sek indstilling 6 ved anvendelse af en 50 ml rør adapteren i bench-top homogenisator.
- Kassér supernatant og gentag for i alt 7 Natriumacetat vaskecyklusser.
- Skyl prøven i iskold dH2O og blandes én gang for at fjerne tilbageværende natriumacetat.
- Anvend en spatel til at komprimere prøven mod siden af røret for at fjerne overskydende væske og derefter overføres til en frisk 50 ml konisk rør.
3. Type I kollagen Extraction
- Vask prøven to gange i 2 ml / g 0,075 M natriumcitrat-buffer i 1 min ved 6 m / sek i bench-top homogenisator komprimere prøven og bortkastning af supernatanten efter hver vask.
- Tilføj en frisk 2 ml / g portion af 0,075 M natriumcitrat-puffer til prøven.
- Udfør 6 sekventielle 1 min, 6 m / sek bench-top homogenisator mix cyklusser af agitation uden at fjerne buffer mellem hver cyklus.
- Overfør den tykke, klar supernatant til en samling rør.
- Tilføj yderligere 1 ml / g 0,075 M natriumcitratbuffer til prøven og udføre en afsluttende bench-top homogenisator agitation cyklus.
- Tilføj denne sidste supernatant til en samling rør.
- Centrifugér opsamlingsrøret ved 3.200 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten overføres til den øverste rum i en 100.000 molekylvægt cut off centrifugalfilterenhed enhed.
- Centrifuger ved 3.200 x g i 30 min ved 4 ° C.
- Overfør det oprensede Kol1 fra øvre kammer til et rent konisk rør og opbevares ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne Kol1 isolation protokollen kræver omkring 2 timer og 15 minutter at gennemføre. Figur 1 viser et skematisk diagram skitserer de vigtigste trin i denne procedure. Forberedelse af prøven og udførelse af de 7 cykler af højhastigheds-agitation og skylninger med natriumacetat tager ca 35 min (figur 1A-C). Udførelse af en agitation og skyl cyklus med dH2O tager cirka 5 minutter (figur 1D og 1E). Tilføjelse natriumcitrat og udsætte prøven for en omrøring og skyllecyklus efterfulgt af 6 cyklusser af omrøring tager cirka 45 minutter (figur 1F og 1G). Centrifugering af de resterende faste stoffer fra den flydende ekstrakt tager 15 minutter (figur 1 H). Endelig overføre prøven til et filter, og udfører en anden centrifugering trin at koncentrere det rensede opløseliggjort col1 og fjerne små proteinertager 30 minutter (figur 1I og 1J). Slutproduktet er en koncentreret, meget ren fremstilling af opløseligt Kol1 der kan yderligere polymeriseres ved tilsætning af Na 2 HCO 3 og inkubering ved 37 ° C. Fasekontrastmikroskopi billeder af dette størknede produkt afslører Kol1 fibriller, der kunne tjene som et substrat til cellebinding til vævskulturplader eller benyttes som et stillads til 3-D vævsdyrkningsapplikationer (figur 2A og 2B).
Fig. 1. Skematisk oversigt over den forbedrede Kol1 isolation metode. A) skiver dermis sættes til en 50 ml konisk rør. B) 0,5 M natriumacetat tilsættes til prøven. C) DenPrøven underkastes 7 cyklusser omrøring med natriumacetatpuffer erstattet efter hver cyklus. D) dH2O tilsættes til hudprøven. E) Præparatet underkastes en cyklus af agitation og dH2O hældes fra. F) 0,075 M natriumcitrat tilsættes til prøven. G) prøven udsættes for 6 cyklusser af omrøring. H) prøven centrifugeret for at fjerne store partikler. I) Supernatanten overføres til en 100.000 molekylvægt cut off centrifugalfilterenhed i et konisk rør. J) Denne enhed centrifugeres, og den viskose væske, der forbliver i det øverste rum opsamles.
Figur 2. Rapid isolation from dermis til opnåelse col1 polymeriseres til fibriller. Opløseligt Kol1 blev neutraliseret ved tilsætning af Na 2 HCO 3 og derefter inkuberet ved 37 ° C. En fase kontrast billede (A) og transmission elektronmikrografi (viser den bevarede d-banding) (B) i Kol1 fibriller genereres ved hjælp af vores hurtige isolation metode. Skalapanelerne = 10 m og 500 nm (henholdsvis). Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et afgørende element ved denne metode er den gentagne effektiv komprimering af dermal prøven for at fjerne overskydende væske. Det er vigtigt at fjerne så meget natriumacetat som muligt i trin 2.5 ved at komprimere prøven. Vi bruger en spatel til at komprimere huden mod siden af røret, men kunne ostelærred også anvendes, selv om dette ville nødvendiggøre fjernelse af prøven fra røret og øge den tid, der kræves for at udføre disse trin. Ligeledes er det vigtigt at komprimere prøven i trin 3.1, således at mængden af natriumcitrat er nøjagtig i de efterfølgende ekstraktionstrin. Ikke i tilstrækkelig grad at fjerne væske fra prøven i nogen af disse skridt vil have en skadelig virkning på det endelige Kol1 udbytte. Et andet centralt element i denne protokol er at bevare alle reagenser ved 4 ° C. Dette sikrer en effektiv ekstraktion af syre solubiliseret col1 og forhindrer størkning af kollagen. Derudover kunne den procedure, der skal udføres ved hjælp af allesterile reagenser i et sterilt miljø. Dette ville være af særlig betydning for dem, der ønsker at ansætte denne metode til at isolere Kol1 til brug i mennesker. Mange kommercielle kilder Kol1 er blevet effektivt steriliseret ved gamma-bestråling. Desværre er denne praksis i høj grad reducerer dets evne til at danne geler på grund af protein fragmentering og denaturering 9,10.
Denne procedure er de optimale betingelser for Col1 ekstraktion som bestemt ud fra mange eksperimenter udføres for at etablere den ideelle andel af dermal prøven buffer volumen. Tilføjelsen af flere rør er foreslået, når investigator ønsker at anvende denne procedure til større hudprøver. Baseret på vores erfaringer, er det ikke tilrådeligt at tilføje mere prøve eller buffer end angivet for hvert rør. Det er også værd at bemærke, at perler sammensat af silica, keramik, granat, aluminiumoxid, siliciumcarbid eller zirconiumoxid, der almindeligvis anvendes i forbindelse med bench-top homogenizers, er udeladt fra vores procedure. De 6 sekventielle 1 min agitation cykler, der er beskrevet i trin 3.3 er nødvendige på grund af en begrænsning, som vores agitation udstyr. Vi kan kun omrøre prøven i alt 60 sekunder ad gangen, hvorefter maskinen kræver et stop. Hvis man har udstyr, der kan indstilles til 6 min lige, ville det sandsynligvis være fint skifte til en seks minutters cyklus. Vi gør dog foreslå streng overholdelse beskrevet prøvens vægt og buffervolumener.
Vi har fundet denne forberedelse metode effektivt isolerer opløselig Kol1 fra lam, kanin, og menneskelige dermal prøver 8. På den anden side er denne protokol ikke var vellykket på at rense Kol1 fra svinehud prøver. Selv med omfattende ændringer i metoden, svin dermis produceret en ublu beløb af skum på grund af resterende lipider og fedt resulterer i ineffektiv Kol1 udvinding. Omvendt kan Kol1 oprenses fra hele rotte halereller isolerede rotte hale sener med en let modificeret præparat, der omfatter lyserende matrixperlerne. Det er tidligere blevet beskrevet i detaljer 8.
For forskere, de mulige anvendelser af den endelige syre-opløst Kol1 produkt opnået ved hjælp af denne metode kan nævnes: a) at tilvejebringe en klæbende substrat for dyrkningsplader at understøtte celle udlæg og spredning, b) mikro-mønstret af overflader til 2 - eller 3 - dimensionelle (2 - eller 3-D) cellekultur, og c) oprettelse af 3-D scaffolds for vævsdyrkningsapplikationer. Mens nogle små beløb af parti-til-parti variation må forventes fra enhver rensning metode, har vi fundet, at disse flydende Kol1 præparater er konsekvent i stand til at blive kombineret med forskellige cellepopulationer og kastes i forme. Efter neutralisering af pH og opvarmning, er resultatet et størknet manipuleret væv konstruere med rumligt orienterede celler jævnt fordelt i hele matrixen. Afhængig af formen afskimmel, kan disse konstruktioner laves i næsten enhver form og størrelse 3,4,11-14.
Sammenfattende er det vores opfattelse, at den mest tvingende grund til at anvende denne metode er, at det drastisk reducerer den tid og indsats, der kræves for at isolere meget ren, opløselig Kol1 fra en autolog vævskilde såsom små hudbiopsier. Metoden er baseret på veletablerede procedurer og producerer et produkt, der opfylder eller overstiger kvaliteten af dyre kommercielle præparater med hensyn til Kol1 renhed og evnen til at danne stabile 3-D væv. Samtidig, denne forenklede metode gør det muligt effektiv og hurtig isolering af autologt afledt col1 der kan sikkert bruges til en lang række kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en forskningsbevilling fra National Institutes of Health (HL068915 til DBC), en ny forsker Award fra Thrasher Research Fund (til den fælles landbrugspolitik), en Grant-in-Aid fra American Heart Association (12GRNT11910008 til DBC) , en forskningsbevilling fra Børns Heart Foundation (til DBC), og donationer til Boston Børnehospital hjerteledningen fonden, Ryan Family Endowment, og af David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
