Summary
수용성 제 1 형 콜라겐 (COL1)의 분리에 대한 기존의 절차 때문에 긴 버퍼 배양 및 섬유의 힘든 resuspensions의 처음부터 끝까지 약 10 일이 필요합니다. 여기, 우리는보다 3 시간에 작은 피부 생검에서 COL1을 정화 할 수있는 방법을 설명합니다.
Abstract
용해 1 형 콜라겐 (COL1)는 세포 배양을위한 접착제 기판으로 회생 응용 프로그램을위한 세포 지지체로 광범위하게 사용됩니다. 임상 적으로,이 단백질 널리 성형 수술, 피부 주사, 골 이식 및 재건 수술에 사용됩니다. 이러한 절차에 대한 COL1의 소스는 염증과 거부에 대한 가능성뿐만 아니라 생체 이물 질병의 전송을 증가하는, 일반적으로 인간이 아닌 있습니다. 이러한 관점에서, 효율적이고 신속 autologously 유래 조직의 한정된 양에서 COL1을 정화하는 방법은 많은 문제점을 회피 할하지만, 표준 격리 프로토콜 긴이며 종종 콜라겐 조직의 대량을 요구한다. 여기서, 우리는 이하의 3 시간에 약 10 일에서이 단백질을 분리 및 정제하는 데 필요한 시간을 줄여 효율적인 COL1 추출 방법을 설명한다. 우리는 많은 수술 과정 중에 있기 때문에 가능 여부에 대한 우리의 조직 소스로 진피를 선택했다. 티그의 방법은 진피의 적은 양의 고순도, 수용성 COL1을 얻기 위해 강력한 교반 및 원심 여과와 함께 기존의 추출 버퍼를 사용합니다. 간단히, 피부 조직 검사는 지방, 결합 조직, 그리고 머리를 제거한 후 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O 철저히 세척. 피부 샘플은 0.5 M 아세트산 나트륨 및 고속 벤치 탑 균질화기를 사용하여 단백질 및 다당류 noncollagenous 스트리핑된다. 잔류 고형물로부터 콜라겐이어서 균질화기를 사용하여 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액으로 추출 하였다. 이 추출물을 비교하거나 우수한 상용 제품에 대한 품질이나 기존의 프로 시저를 사용하여 얻은 결과의 COL1 준비를 얻을 수 100,000 MW 컷 - 오프 원심 필터를 사용하여 정제된다. 우리는이 방법은 연구와 임상 응용 프로그램의 다수에 대한 autologously 파생 COL1의 활용을 용이하게 기대하고 있습니다.
Introduction
수십 년 동안, 연구자 및 상업 벤더 사용할 수 있습니다 조직 COL1 원 섬유의 매트릭스의 재 부유 결과 중화 다음에 간단한 산 추출 프로토콜의 일부 변화를 이용하여 피부와 힘줄 등의 조직 소스의 구색에서 용해 COL1을 격리했다 생물 의학 응용 프로그램 1-4의 다수를위한. COL1에 대한 임상 응용의 많은 사례가 있지만이 단백질의 준비 5-7을 수행하는 일 또는 주를 복용 긴 추출을 필요로하기 때문에, 이들 중 몇몇은 autologously 파생 COL1를 사용합니다. 그 결과, 연구 조사와 의사는 일반적으로 쥐, 소 또는 돼지의 진피와 같은 인간이 아닌 조직을 사용하거나 시체에서 제거 스킨을 사용하거나 남성 할례에 따라 제조하는 COL1의 비용, 상업 준비를 사용합니다. 재생 응용 프로그램의 경우, 자신의 능력에 대한 이러한 제품의 전시 변화의 대부분은 고체 형성매트릭스 또는 세포 부착 및 성장을 지원할 수있는 조직 구조. 따라서, 신속하게 접근 할 수 있고 충분한자가 조직 소스에서 COL1를 추출하기 위해 디자인 된 새로운 표준화 된 방법에 대한 구별이 필요하다.
이러한 방법은 COL1은 또한 동물 모델에서 추출 콜라겐 계 지지체에 조립 설계 조직의 전임상 시험에 사용될 수 연구 설정에 시간과 비용을 절약한다. 동시에, 병원에서 급속 절연 autologously 유래 COL1를 사용하는 옵션을 갖는, 그렇지 않으면 동종 또는 이종 제제를받을 환자의 전체적인 안정성을 증가시킬 것이다. autogeneic 제제를 투여받은 환자의 경우,이 간소화 된 방법은 크게 생검 수집 및 콜라겐 애플리케이션 간의 간격을 줄일 것이다. 이러한 이유로, 우리는 고속 AG를 사용하여 노포 COL1 분리 및 정제 방법을 개선하고자itation 및 크기 배제 원심 분리. 이 방법은 많은 실험실에서 발견 된 표준 버퍼 및 장비를 사용하여 수행하는 것이 간단합니다. 고속 교반을 사용함으로써, 우리는 프로토콜 미만 3 시간 (8)에 대략 10 일 ~ 용해, 경피 COL1을 분리하는 데 필요한 시간을 감소시킨다. 중요한 것은,이 방법은 쉽게 절차의 단일 세트 동안 환자에 사용 autologously 유래 COL1을 준비하기 위해 임상 환경에서 수행 될 수있다.
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Protocol
여기에서 우리는 어린 양의 피부에서 COL1의 분리를 보여줍니다. 서면으로,이 프로토콜은 또한 성공적으로 토끼와 인간의 피부로부터 COL1를 분리하는데 사용될 수있다.
1. 피부 샘플을 준비
- 사용하기 전에 4 ° C에 모든 시약을 평형.
- 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O의 피부 샘플 (25~50g)을 씻어 제모 크림 어떤 울, 모피, 또는 머리를 제거합니다.
- 결합 조직과 지방의 샘플 깨끗하게 긁어 단일 에지 면도날을 사용합니다.
- 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O.에서 샘플을 씻어
- 단일 에지 면도날 1cm X 1cm 조각으로 피부 샘플을 조각.
2. Noncollagenous 가용화 물질을 제거
- 샘플 50 ㎖ 당 원뿔 튜브의 5g을 달아 얼음처럼 차가운 0.5 M 아세트산 나트륨 30 ㎖를 추가합니다.
- 벤치 탑 균질의 50 ML 튜브 어댑터를 사용하여 6m / 초 설정으로 1 분 동안 튜브를 섞는다.
- SUP 폐기7 아세트산 나트륨 세척주기의 총 ernatant를 반복합니다.
- 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O에서 샘플을 씻어 잔류 아세트산 나트륨을 제거하기 위해 한 번 섞는다.
- 물기를 제거하고 신선한 50 ML 원뿔 튜브로 전송 튜브의 측면에 대한 샘플을 압축하기 위해 주걱을 사용합니다.
3. I 콜라겐 추출을 입력
- 샘플을 압축하고 각 세척 후 상층 액을 버리고 벤치 탑 균질 6 M / 초에서 1 분에 대한 ㎖ / g의 2 배의 샘플을 씻어 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액.
- 샘플에 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액의 새로운 2 ㎖ / g 나누어지는을 추가합니다.
- 각주기 사이의 버퍼를 제거하지 않고 6 연속 1 분, 교반 6m / 초 벤치 탑 균질 혼합주기를 수행합니다.
- 포집 관에 두꺼운, 상등액을 전송합니다.
- 샘플 ㎖ / g (1 건) 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액을 추가하고 마지막으로 벤치 탑 균질화 AGITA을 수행기의 순환.
- 포집 관이 최종 뜨는을 추가합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 3,200 XG에서 포집 관을 원심 분리기
- 100,000 분자량의 톱 수 납부에 뜨는을 전송 원심 필터 장치를 잘라.
- 4 ℃에서 30 분 동안 3,200 XG에 원심 분리기
- 4 ° C에서 깨끗한 원뿔 관 및 저장에 상부 구획으로부터 정제 된 COL1 이동
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Representative Results
이 COL1 격리 프로토콜은 완료하는 데 약 2 시간 15 분을 필요로한다. 그림 1은이 절차의 주요 단계를 요약 한 개략도를 보여줍니다. 샘플 준비 및 고속 동요의 12 사이클을 수행하고 아세트산 나트륨 헹굼은 약 35 분 (도 1a-C)가 소요된다. 한 교반을 수행하고 dH보다 2 O와주기를 씻어은 약 5 분 (그림 1D 및 1E)가 소요된다. 구연산 나트륨을 추가 한 교반에 샘플을 쓰는 교반의 6 회 반복주기가 약 45 분 (그림 1 층 및 1G)가 소요 씻어. 액체 추출물에서 남아있는 고형물을 원심 분리하면 15 분 (그림 1H)가 소요된다. 최종적으로, 필터 장치에 샘플을 전송하고, 정제, 가용화 COL1 농축 작은 단백질을 제거하는 또 다른 원심 분리 단계를 수행하는 단계30 분 소요됩니다 (그림 1I 및 1J). 최종 제품은 더 나 2 HCO 3을 추가하고 37 ℃에서 배양하여 중합 할 수있는 가용 COL1의 집중, 고순도의 준비입니다 이것의 위상 콘트라스트 현미경 이미지는 제품이 세포 조직 배양 플레이트에 부착 또는 3-D 조직 공학 응용을위한 스캐 폴드 (도 2A 및 2B)로 사용될위한 기판으로서 역할을 할 수 COL1 섬유을 계시 고화.
그림 1. 개선 COL1 분리 방법의 개요도. A) 슬라이스 진피)을 50 ㎖ 원뿔형 튜브. B에 첨가 0.5 M 아세트산 나트륨이 샘플에 첨가한다. C)샘플이 각 사이클 후 교체 아세트산 나트륨 완충액으로 교반의 7주기를 실시한다. D) dH보다 2 O는 피부 샘플에 추가됩니다. E) 준비가 교반 및 dH보다 2 O의 1주기를 실시 전원이 부어있다. F) 0.075 M 시트르산 나트륨은 샘플을 교반. H)의 6주기 시료 큰 고형물을 제거하기 위해 원심 분리를 실시 샘플. G)에 첨가된다. I)이 상청액 원심 필터 부에서 잘라 100,000 분자량에 전송 원뿔 튜브. J)이 장치는 원심 분리하여 상단 칸에 남아 점성 액체가 수집됩니다.
그림 2. 신속한 격리 아프로섬유로 중합 COL1을 산출하는 M 진피. 가용성 COL1은 나 2 HCO 3을 추가하여 중화 한 다음 37 ℃에서 배양 하였다 위상 콘트라스트 화상 (A)하고 신속한 분리 방법을 사용하여 생성 COL1 원 섬유의 (보존 D-밴딩을 도시) 투과형 전자 현미경 사진 (B). 스케일 바 = 10 μm의 500 nm의 (각각). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법의 중요한 구성 요소는 물기를 제거하는 피부 샘플의 반복 효율적인 압축입니다. 이 샘플을 압축하여 단계 2.5에 극력 아세트산 나트륨을 제거하는 것이 중요하다. 우리는 튜브의 측면에 대해 피부를 압축 주걱을 사용하지만, 무명천도 사용될 수, 이것은 튜브에서 샘플의 제거를 필요로하고이 단계를 수행하는 데 필요한 시간을 증가시킬 것이지만. 마찬가지로, 시트르산 나트륨의 양이 후속 추출 단계에서 정확하도록 단계 3.1에서 샘플을 압축하는 것이 중요하다. 적절하게 다음 단계 중 하나의 샘플에서 액체를 제거하지 않으면 최종 COL1 수율에 해로운 영향을 미칠 것입니다. 이 프로토콜에 대한 또 다른 주요 구성 요소는 4 ℃에서 모든 시약을 유지하는 것입니다 이 산 가용화 COL1의 효율적인 추출을 보장하고 콜라겐의 응고를 방지 할 수 있습니다. 게다가, 프로 시저 모두를 사용하여 수행 될 수있다무균 환경에서 멸균 시약. 이것은 인간에 사용하기 위해 COL1을 분리하는이 방법을 사용하고자하는 사람들을 위해 특히 중요하다. COL1의 많은 상용 소스 효과적으로 감마 방사선 조사에 의해 살균되었다. 불행하게도,이 방법은 크게 단백질 조각과 변성 9,10에 의한 겔을 형성 할 수있는 능력을 감소시킨다.
이 절차는 볼륨을 버퍼링하는 피부 샘플의 최적 비율을 확립하기 위해 수행 많은 실험에서 결정된 바와 같이 COL1 추출을위한 최적의 조건을 나타낸다. 조사는 큰 피부 샘플에 대해이 절차를 사용하고자 할 때 더 튜브의 추가가 좋습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 더 샘플을 추가하거나 각 튜브에 표시된 것보다 버퍼링하지 않는 것이 좋습니다. 또한 주목할 가치가 일반적으로 B와 함께 사용되는 실리카, 세라믹, 가넷, 산화 알루미늄, 탄화 규소 또는 산화 지르코늄으로 구성 비즈ench 정상 균질, 우리의 절차를 생략합니다. 단계 3.3에서 설명하는 6 연속 1 분 교반주기 때문에 우리의 교반 장치에 의해 부과 된 제한으로 필요합니다. 우리는 단지 기계 정지를 요구 한 후, 한 번에 60 초 총 샘플을 교반 할 수있다. 하나는 6 분의 직선에 대해 설정할 수있는 장비가 있다면, 그것은 가능성이 하나, 6 분 순환으로 전환 괜찮을 것입니다. 그러나 우리는 설명 샘플 무게와 버퍼 볼륨에 대한 엄격한 준수를 제안 않습니다.
우리는이 제조 방법은 효율적으로 양고기, 토끼, 인간의 피부 샘플을 8에서 용해 COL1를 분리 발견했다. 한편,이 프로토콜은 돼지 피부 샘플에서 COL1 정화에 실패했습니다. 심지어 방법에 대한 광범위한 수정을, 돼지 진피 때문에 비효율적 인 COL1 추출의 결과 잔류 지질과 지방의 거품의 엄청난 금액을 생산. 반대로, COL1은 전체 쥐꼬리로부터 정제 할 수있다또는 용균 매트릭스 구슬을 포함하는 약간 수정 준비를 사용하여 쥐의 꼬리 힘줄입니다. 이것은 이전에 상세히 8에 설명되었다.
연구 과학자를 들어,이 방법을 사용하여 얻은 최종 산 - 가용화 COL1 제품의 잠재적 인 용도는 다음을 포함한다 : a) 세포의 부착과 증식을 지원하기 위해 배양 플레이트에 대한 접착 성 기판을 제공하는 단계, 2면의 b) 마이크로 - 패터닝 - 또는 3 - 차원 (2 - 또는 3-D) 세포 배양 및 c) 조직 공학 응용 프로그램에 대한 3 차원 인공 지지체의 창조. 로트 변화의 일부 소량은 정제 방법에서 예상 할 수 있지만, 우리는이 액체 COL1 준비는 지속적으로 다양한 세포 집단과 결합 형으로 캐스팅 할 수 있다는 것을 발견했다. pH와 온난화를 중화 한 후, 결과는 응고 된 조직 공학은 매트릭스 전체에 균일하게 분포 된 공간적으로 지향 세포로 구성이다. 의 형상에 따라서몰드는, 이러한 구조는 사실상 임의의 형상 및 크기 3,4,11-14에서 만들어 질 수있다.
요약하면,이 방법을 활용하는 가장 중요한 이유는 그것이 극적 같은 작은 피부 생검자가 조직 공급원으로부터 고순도, 수용성 COL1을 분리하는 데 필요한 시간과 노력을 감소 시킨다는 것이 우리의 의견이다. 방법은 노포 절차에 기초하고 COL1 순도에 대하여 안정된 3-D 조직을 형성 할 수있는 능력을 가진 고가의 시판 제제의 품질을 충족하거나 초과하는 제품을 생산하고있다. 동시에,이 간략화 된 방법은 안전하게 임상 응용의 다수를 위해 사용될 수있다 autologously 유래 COL1의 효율적이고 신속한 분리를 허용한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (DBC에 HL068915), (CAP로) 채찍질 연구 기금에서 새 연구원 수상에서 연구 보조금, 보조금의 에이드 (DBC에 12GRNT11910008) 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서보기에 의해 지원되었다 , 어린이 심장 재단 (DBC에), 그리고 보스턴 아동 병원 심장 전도 기금, 라이언 가족 성기 사이즈, 그리고 데이빗 풀먼에 의해 기부에서 연구 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
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