Summary
घुलनशील टाइप 1 कोलेजन (col1) के अलगाव के लिए पारंपरिक प्रक्रियाओं की वजह से लंबा बफर incubations और तंतुओं की श्रमसाध्य resuspensions के शुरू से खत्म करने के बारे में 10 दिन की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम कम से कम 3 घंटे में छोटे त्वचीय बायोप्सी से Col1 शुद्ध करने के लिए एक साधन के वर्णन.
Abstract
घुलनशील टाइप 1 कोलेजन (col1) सेल संस्कृतियों के लिए एक चिपकने वाला सब्सट्रेट के रूप में और पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए एक सेलुलर पाड़ के रूप में बड़े पैमाने पर प्रयोग किया जाता है. चिकित्सकीय, यह प्रोटीन व्यापक रूप से कॉस्मेटिक सर्जरी, चमड़े का इंजेक्शन, हड्डी कलम बांधने का काम, और पुनर्निर्माण सर्जरी के लिए प्रयोग किया जाता है. इन प्रक्रियाओं के लिए col1 के सूत्रों सूजन और अस्वीकृति के लिए क्षमता के साथ ही जीनोबायोटिक रोग संचरण बढ़ जाता है, जो आमतौर पर nonhuman हैं. इसे देखते हुए, कुशलतापूर्वक और जल्दी से autologously व्युत्पन्न ऊतकों की सीमित मात्रा से Col1 शुद्ध करने के लिए एक विधि इन मुद्दों के कई दरकिनार होगा, लेकिन, मानक अलगाव प्रोटोकॉल लंबी हैं और अक्सर श्लेषजनउत्पादी ऊतकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम कम से कम 3 घंटे के बारे में 10 दिनों से इस प्रोटीन को अलग और शुद्ध करने के लिए आवश्यक समय को कम कर देता है कि एक कुशल Col1 निष्कर्षण विधि का प्रदर्शन. हम कई सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान की वजह से अपनी उपलब्धता के बारे में हमारी ऊतक स्रोत के रूप में डर्मिस चुना है. टीउसकी विधि यथार्थ त्वचा की थोड़ी मात्रा से अत्यधिक शुद्ध, घुलनशील Col1 प्राप्त करने के लिए सशक्त आंदोलन और केन्द्रापसारक निस्पंदन के साथ संयुक्त पारंपरिक निष्कर्षण बफ़र्स का उपयोग करता है. संक्षेप में, त्वचीय बायोप्सी वसा, संयोजी ऊतक, और बालों को हटाने के बाद ठंडा DH 2 हे में अच्छी तरह से धो रहे हैं. त्वचा के नमूनों 0.5 एम सोडियम एसीटेट और एक उच्च गति पीठ टॉप homogenizer का उपयोग noncollagenous प्रोटीन और polysaccharides के छीन रहे हैं. अवशिष्ट ठोस से कोलेजन बाद में homogenizer का उपयोग कर एक 0.075 एम सोडियम साइट्रेट बफर के साथ निकाला जाता है. इन निष्कर्षों तुलनीय या बेहतर व्यावसायिक उत्पादों के लिए गुणवत्ता या पारंपरिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त उन की Col1 तैयारी उपज है कि 100,000 मेगावाट कट ऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर शुद्ध किया जाता है. हम इस पद्धति अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए autologously व्युत्पन्न Col1 के उपयोग की सुविधा होगी आशा.
Introduction
दशकों के लिए, शोधकर्ताओं और वाणिज्यिक विक्रेताओं इस्तेमाल किया जा सकता है कि संगठित Col1 तंतुओं के एक मैट्रिक्स के एक मेजबान में जो परिणाम निराकरण के बाद एक सरल एसिड निष्कर्षण प्रोटोकॉल, के कुछ बदलाव का उपयोग त्वचा और कण्डरा सहित ऊतक सूत्रों के एक वर्गीकरण से solubilized Col1 अलग है जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 1-4 की एक भीड़ के लिए. Col1 के लिए नैदानिक आवेदन के कई उदाहरण हैं, जबकि इस प्रोटीन की तैयारी 5-7 प्रदर्शन करने के लिए कई दिनों या हफ्तों लेने लंबा एक्सट्रेक्शन की आवश्यकता है, क्योंकि इनमें से कुछ autologously व्युत्पन्न Col1 रोजगार. नतीजतन, अनुसंधान जांचकर्ताओं और चिकित्सकों आम तौर पर इस तरह के चूहे, गोजातीय, या सुअर का यथार्थ त्वचा के रूप में nonhuman ऊतकों का उपयोग कर या शवों से हटा त्वचा का उपयोग कर या पुरुष खतना निम्नलिखित तैयार कर रहे हैं कि Col1 के महंगा, वाणिज्यिक तैयारियों का उपयोग करें. पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए, अपनी क्षमता के संबंध में इन उत्पादों का प्रदर्शन परिवर्तनशीलता के कई ठोस रूप के लिएmatrices या सेल लगाव और विकास का समर्थन करने में सक्षम ऊतक निर्माणों. नतीजतन, जल्दी से सुलभ और भरपूर मात्रा में ऑटोलॉगस ऊतक स्रोतों से Col1 निकालने के लिए बनाया गया एक नया मानकीकृत पद्धति के लिए एक विशिष्ट आवश्यकता नहीं है.
इस तरह की एक विधि Col1 ब्याज के पशु मॉडल से निकाला और कोलेजन आधारित scaffolds पर इकट्ठे इंजीनियर के ऊतकों के preclinical परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां अनुसंधान की स्थापना में समय और पैसा दोनों बचा होगा. इसी समय, क्लिनिक में एक तेजी से पृथक, autologously व्युत्पन्न Col1 उपयोग करने का विकल्प होने अन्यथा अल्लोजीनिक या xenogeneic तैयारी प्राप्त होता है कि मरीजों के लिए समग्र सुरक्षा में वृद्धि होगी. एक autogeneic तैयारी प्राप्त रोगियों के लिए, इस सुव्यवस्थित विधि बहुत बायोप्सी संग्रह और कोलेजन आवेदन के बीच के अंतराल को कम करेगा. इन कारणों के लिए, हम उच्च गति एजी का उपयोग करके एक लंबे समय से स्थापित Col1 अलगाव और शुद्धीकरण पद्धति पर सुधार करने की मांग कीitation और आकार अपवर्जन centrifugation. यह विधि कई प्रयोगशालाओं में पाया मानक buffers और उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए सरल है. उच्च गति आंदोलन से रोजगार, हमारे प्रोटोकॉल कम से कम 3 घंटे 8 के लिए लगभग 10 दिनों से घुलनशील, त्वचीय Col1 अलग करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है. महत्वपूर्ण बात, इस विधि आसानी प्रक्रियाओं का एक सेट के दौरान रोगियों में उपयोग के लिए autologously व्युत्पन्न Col1 तैयार करने के क्रम में नैदानिक सेटिंग में प्रदर्शन किया जा सकता है.
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Protocol
यहाँ हम भेड़ त्वचा से col1 के अलगाव का प्रदर्शन करेंगे. लिखित रूप में, इस प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक खरगोश और मानव त्वचा से Col1 अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
1. त्वचीय नमूना तैयार
- उपयोग करने के लिए पिछले 4 डिग्री सेल्सियस तक सभी अभिकर्मकों संतुलित करना.
- ठंडा DH 2 हे में चमड़े का नमूना (25-50 ग्राम) कुल्ला और लोमनाशक क्रीम के साथ किसी भी ऊन, फर, या बालों को हटा दें.
- संयोजी ऊतक और वसा का नमूना स्वच्छ परिमार्जन करने के लिए एक एकल बढ़त रेजर ब्लेड का प्रयोग करें.
- ठंडा DH 2 ओ में नमूना कुल्ला
- एक एकल बढ़त धार के साथ 1 सेमी एक्स 1 सेमी टुकड़ों में त्वचा नमूना स्लाइस.
2. Noncollagenous solubilized सामग्री हटाने
- नमूना 50 मिलीलीटर प्रति शंक्वाकार ट्यूब की 5 ग्राम वजन और ठंडा 0.5 एम सोडियम एसीटेट की 30 मिलीलीटर जोड़ें.
- पीठ टॉप homogenizer में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब अनुकूलक का उपयोग कर 6 मीटर / सेकंड की स्थापना पर 1 मिनट के लिए ट्यूब मिलाएं.
- समर्थन त्यागें7 सोडियम एसीटेट धोने चक्र के लिए कुल ernatant और दोहराने.
- ठंडा DH 2 हे में नमूना कुल्ला और अवशिष्ट सोडियम एसीटेट दूर करने के लिए एक बार मिश्रण.
- अतिरिक्त तरल निकालने और फिर एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण करने के लिए ट्यूब के पक्ष के खिलाफ नमूना सेक करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें.
3. मैं कोलेजन निकालना लिखें
- नमूना compressing और प्रत्येक धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला discarding पीठ टॉप homogenizer में 6 मीटर / सेकंड में 1 मिनट के लिए मिलीग्राम / छ 2 में दो बार नमूना धो 0.075 एम सोडियम साइट्रेट बफर.
- नमूने के लिए 0.075 एम सोडियम साइट्रेट बफर का एक ताजा 2 मिलीग्राम / छ विभाज्य जोड़ें.
- प्रत्येक चक्र के बीच बफर हटाने के बिना 6 अनुक्रमिक 1 मिनट, आंदोलन की 6 मीटर / सेकंड पीठ टॉप homogenizer मिश्रण चक्र पूरा करें.
- एक संग्रह ट्यूब के लिए मोटी, स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- नमूने के लिए एक मिलीग्राम / छ 1 अतिरिक्त 0.075 एम सोडियम साइट्रेट बफर जोड़ें और एक अंतिम पीठ टॉप homogenizer हिलाओ प्रदर्शनtion चक्र.
- एक संग्रह ट्यूब के लिए यह अंतिम सतह पर तैरनेवाला जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3200 XG पर संग्रह ट्यूब अपकेंद्रित्र
- एक 100,000 आणविक वजन के शीर्ष कम्पार्टमेंट स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस काट दिया.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 3200 XG पर अपकेंद्रित्र
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वच्छ शंक्वाकार ट्यूब और स्टोर करने के लिए ऊपरी डिब्बे से शुद्ध Col1 स्थानांतरण
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Representative Results
इस Col1 अलगाव प्रोटोकॉल को पूरा करने के बारे में 2 घंटे और 15 मिनट की आवश्यकता है. चित्रा 1 इस प्रक्रिया में प्रमुख कदम रूपरेखा एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है. नमूना तैयार कर रहा है और उच्च गति आंदोलन के 7 चक्रों प्रदर्शन और सोडियम एसीटेट के साथ rinses लगभग 35 मिनट (आंकड़े 1 ए सी) लेता है. एक आंदोलन का निष्पादन और DH 2 हे के साथ चक्र कुल्ला लगभग 5 मिनट (आंकड़े -1 डी और 1E) लेता है. सोडियम साइट्रेट जोड़ना और एक आंदोलन के लिए नमूना subjecting और आंदोलन के 6 चक्रों के बाद चक्र लगभग 45 मिनट (आंकड़े 1F और 1G) लेता कुल्ला. तरल निकालने से शेष ठोस centrifuging 15 मिनट (चित्रा 1H) लेता है. अंत में, एक फिल्टर डिवाइस के लिए नमूना हस्तांतरण और शुद्ध, solubilized Col1 ध्यान केंद्रित करने और छोटे प्रोटीन को हटाने के लिए एक और centrifugation कदम प्रदर्शन30 मिनट लगते हैं (आंकड़े 1 मैं और 1J). अंतिम उत्पाद आगे ना 2 HCO 3 जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा polymerized जा सकता है कि घुलनशील Col1 का एक केंद्रित, उच्च शुद्ध तैयारी है इस के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों उत्पाद सेल टिशू कल्चर प्लेटें लगाव या 3-D ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक पाड़ (आंकड़े 2A और 2 बी) के रूप में इस्तेमाल किया जा के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में सेवा कर सकता है Col1 तंतुओं प्रकट बढ़ाया.
चित्रा 1. सुधार Col1 अलगाव विधि का योजनाबद्ध सिंहावलोकन. एक) कटा हुआ है डर्मिस) एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब. बी को जोड़ा जाता है 0.5 एम सोडियम एसीटेट नमूना जोड़ा जाता है. सी)नमूना प्रत्येक चक्र के बाद बदल दिया सोडियम एसीटेट बफर के साथ आंदोलन के 7 चक्रों के अधीन है. डी) DH 2 हे त्वचा नमूना करने के लिए जोड़ा गया है. ई) तैयारी आंदोलन और DH 2 हे 1 चक्र के अधीन है बंद डाला है. एफ) 0.075 एम सोडियम साइट्रेट नमूना आंदोलन. एच) के 6 चक्रों नमूना बड़ी ठोस हटाने के लिए centrifuged है के अधीन है नमूना. जी) के लिए जोड़ा है. मैं) पर तैरनेवाला केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट में काट एक 100,000 आणविक वजन को सौंप दिया है एक शंक्वाकार ट्यूब. जे) इस इकाई centrifuged है और शीर्ष डिब्बे में रहता है कि चिपचिपा तरल एकत्र किया जाता है.
चित्रा 2. रैपिड अलगाव froतंतुओं में polymerized Col1 उपज के लिए एम डर्मिस. घुलनशील Col1 ना 2 HCO 3 जोड़कर निष्प्रभावी और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated था एक चरण विपरीत छवि (ए) और हमारे तेजी से अलगाव विधि का उपयोग कर उत्पन्न Col1 तंतुओं (संरक्षित D-बैंडिंग दिखा) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (बी). स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन और 500 एनएम (क्रमशः). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण घटक अतिरिक्त तरल निकालने के लिए चमड़े का नमूना के दोहराया कुशल संपीड़न है. यह नमूना compressing द्वारा 2.5 कदम में जितना संभव हो उतना सोडियम एसीटेट दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम ट्यूब के पक्ष के खिलाफ त्वचा को संकुचित करने के लिए एक रंग का उपयोग करें, लेकिन, जाली का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, इस ट्यूब से नमूना को हटाने की जरूरत है और इन चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी, हालांकि. इसी तरह, यह सोडियम साइट्रेट की मात्रा बाद निकासी चरणों में सटीक है कि इतनी 3.1 कदम में नमूना सेक करने के लिए महत्वपूर्ण है. पर्याप्त रूप से इन कदमों के किसी भी नमूने में से तरल को दूर करने में विफलता के अंतिम Col1 उपज पर एक हानिकारक प्रभाव पड़ेगा. इस प्रोटोकॉल के लिए एक और महत्वपूर्ण घटक 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी अभिकर्मकों बनाए रखने के लिए है यह एसिड solubilized Col1 के कुशल निकासी सुनिश्चित करता है और कोलेजन के solidification रोकता है. साथ ही, प्रक्रिया सभी का उपयोग किया जा सकता हैएक बाँझ वातावरण में बाँझ अभिकर्मकों. यह मानव में इस्तेमाल के लिए col1 अलग करने के लिए इस विधि को रोजगार के इच्छुक लोगों के लिए विशेष महत्व का होगा. Col1 की कई वाणिज्यिक स्रोतों को प्रभावी ढंग से गामा विकिरण द्वारा निष्फल कर दिया गया है. दुर्भाग्य से, इस अभ्यास बहुत प्रोटीन विखंडन और विकृतीकरण 9,10 के कारण जैल फार्म की क्षमता कम कर देता है.
यह प्रक्रिया मात्रा बफर करने के लिए चमड़े का नमूना के आदर्श अनुपात स्थापित करने के लिए प्रदर्शन किया कई प्रयोगों से निर्धारित Col1 निकासी के लिए इष्टतम स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है. अन्वेषक बड़ा त्वचा के नमूनों के लिए इस प्रक्रिया को काम करना चाहता है और अधिक ट्यूबों के अलावा सुझाव दिया है. हमारे अनुभव के आधार पर, यह नमूना जोड़ने या प्रत्येक ट्यूब के लिए संकेत से बफर करने के लिए उचित नहीं है. यह भी ध्यान देने योग्य है कि आमतौर पर बी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है जो सिलिका, चीनी मिट्टी, गारनेट, एल्यूमीनियम ऑक्साइड, सिलिकॉन कार्बाइड, या zirconium ऑक्साइड, से बना मोतीench टॉप homogenizers, हमारी प्रक्रिया से छोड़े गए हैं. कदम 3.3 में वर्णित 6 अनुक्रमिक 1 मिनट आंदोलन चक्र की वजह से हमारे आंदोलन उपकरणों द्वारा लगाए गए एक सीमा के लिए आवश्यक हैं. हम केवल मशीन एक रोकने की आवश्यकता है, जिसके बाद एक समय में 60 सेकंड के लिए कुल नमूना आंदोलन कर सकते हैं. एक 6 मिनट सीधे के लिए सेट किया जा सकता है कि उपकरण है, तो यह संभावना एक, छह मिनट चक्र को स्विच करने के लिए ठीक हो जाएगा. हम फिर भी वर्णित नमूना वजन और बफर संस्करणों का कड़ाई से पालन सुझाव है.
हम इस तैयारी विधि कुशलतापूर्वक भेड़, खरगोश, और मानव त्वचीय नमूने 8 से घुलनशील Col1 आइसोलेट्स पाया है. दूसरी ओर, इस प्रोटोकॉल सुअर का त्वचा के नमूनों से Col1 सफ़ाई में सफल नहीं था. यहां तक कि विधि के लिए व्यापक संशोधनों के साथ, सुअर का डर्मिस क्योंकि अक्षम Col1 निकासी में जिसके परिणामस्वरूप अवशिष्ट लिपिड और वसा का झाग का एक अत्यधिक राशि का उत्पादन किया. इसके विपरीत, Col1 पूरे चूहे की पूंछ से शुद्ध किया जा सकता हैया lysing मैट्रिक्स माला भी शामिल है कि एक थोड़ा संशोधित तैयारी का उपयोग कर चूहे की पूंछ tendons पृथक. यह पहले से विस्तार 8 में वर्णित किया गया है.
अनुसंधान वैज्ञानिकों के लिए, इस विधि का उपयोग कर प्राप्त अंतिम एसिड solubilized Col1 उत्पाद की क्षमता का उपयोग करता शामिल हैं: एक) सेल लगाव और प्रसार का समर्थन करने के लिए संस्कृति प्लेटों के लिए एक चिपकने वाला सब्सट्रेट उपलब्ध कराने, 2 के लिए सतहों ख) सूक्ष्म patterning - या 3 - आयामी (2 - या 3 डी) सेल संस्कृति, और ग) ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए 3 डी scaffolds के निर्माण. बहुत से बहुत परिवर्तनशीलता की कुछ छोटी राशि किसी भी शुद्धि विधि से उम्मीद की जा रही है, वहीं हम इन तरल Col1 तैयारी लगातार विभिन्न सेल आबादी के साथ संयुक्त और molds में डाली जा करने में सक्षम हो पाया है. पीएच और वार्मिंग को निष्क्रिय करने के बाद, परिणाम एक जम इंजीनियर ऊतक मैट्रिक्स भर में समान रूप से वितरित स्थानिक उन्मुख कोशिकाओं के साथ निर्माण है. के आकार पर निर्भर करता हैमिट्टी, इन निर्माणों लगभग किसी भी आकार और आकार 3,4,11-14 में बनाया जा सकता है.
संक्षेप में, यह इस पद्धति का उपयोग करने के लिए सबसे सम्मोहक कारण यह नाटकीय रूप से इस तरह के छोटे त्वचा बायोप्सी के रूप में एक ऑटोलॉगस ऊतक स्रोत से अत्यधिक शुद्ध, घुलनशील Col1 को अलग करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को कम कर देता है कि हमारी राय है. विधि लंबे समय से स्थापित प्रक्रियाओं पर आधारित है और Col1 पवित्रता के लिए सम्मान और स्थिर 3 डी ऊतकों फार्म की क्षमता के साथ महंगी व्यावसायिक तैयारी की गुणवत्ता के बराबर या अधिक है कि एक उत्पाद का उत्पादन किया जाता है. इसी समय, इस सरल विधि सुरक्षित रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि autologously व्युत्पन्न Col1 के कुशल और तेजी से अलगाव की अनुमति देता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (डीबीसी के लिए HL068915), (कैप) के लिए गाहनेवाला रिसर्च फंड से एक नई शोधकर्ता पुरस्कार से एक शोध अनुदान, एक अनुदान सहायता (डीबीसी के लिए 12GRNT11910008) अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से द्वारा समर्थित किया गया बच्चों का हार्ट फाउंडेशन (डीबीसी के लिए), और बोस्टन बच्चों के अस्पताल के हृदय चालन फंड, रयान परिवार बंदोबस्ती, और दाऊद पुलमैन द्वारा दान से एक शोध अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
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