Summary
تتطلب الإجراءات التقليدية لعزل نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) حوالي 10 يوما من البداية الى النهاية بسبب حضانات عازلة طويلة وشاقة resuspensions من الألياف. هنا، نحن تصف وسيلة لتنقية COL1 الخزعات الجلدية الصغيرة في أقل من 3 دقائق.
Abstract
ويستخدم نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) على نطاق واسع باعتبارها الركيزة لاصقة لمزارع الخلايا وكما سقالة الخلوية للتطبيقات التجدد. سريريا، ويستخدم على نطاق واسع هذا البروتين للجراحة التجميلية، والحقن الجلدية، تطعيم العظام، والجراحة الترميمية. مصادر COL1 لهذه الإجراءات هي غير البشرية عادة، مما يزيد من احتمال التهاب والرفض وكذلك انتقال المرض أجنبي بيولوجيا. في ضوء ذلك، فإن الأسلوب بكفاءة وبسرعة تنقية COL1 من كميات محدودة من أنسجة مستمدة autologously-تحايل العديد من هذه القضايا، ولكن العزلة البروتوكولات القياسية هي طويلة وتتطلب كميات كبيرة من الأنسجة كولاجيني كثير من الأحيان. هنا، علينا أن نظهر طريقة استخراج COL1 فعالة أن يقلل من الوقت اللازم لعزل وتنقية هذا البروتين من حوالي 10 أيام إلى أقل من 3 في الساعة. اخترنا الأدمة كمصدر الأنسجة لدينا بسبب توافره خلال العديد من الإجراءات الجراحية. Tيستخدم طريقته مخازن استخراج التقليدية جنبا إلى جنب مع الانفعالات قوية والترشيح الطرد المركزي للحصول على درجة عالية من محض، قابل للذوبان COL1 من كميات صغيرة من أدمة. لفترة وجيزة، يتم غسلها الخزعات الجلدية تماما في DH الجليد الباردة 2 O بعد إزالة الدهون، والنسيج الضام، والشعر. يتم تجريد عينات الجلد من البروتينات والسكريات غير كولاجيني باستخدام 0.5 M خلات الصوديوم وسرعة عالية مقعد بين كبار الخالط. يتم استخراج الكولاجين من المواد الصلبة المتبقية في وقت لاحق مع 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات باستخدام الخالط. يتم تنقية هذه المقتطفات باستخدام 100،000 ميغاواط وقف انتاج المواد الانشطارية مرشحات الطرد المركزي التي تحقق الاستعدادات COL1 من نوعية مماثلة أو متفوقة على المنتجات التجارية أو تلك التي تم الحصول عليها باستخدام إجراءات التقليدية. نتوقع أن هذه الطريقة تسهل استخدام المستمدة autologously-COL1 للعديد من البحوث والتطبيقات السريرية.
Introduction
على مدى عقود، وقد عزل الباحثون والباعة التجارية solubilized COL1 من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك الجلد والأنسجة وتر استخدام بعض الاختلاف من بروتوكول استخلاص الحمض بسيطة تليها تحييد، مما يؤدي الى إعادة تعليق من مصفوفة من الألياف COL1 المنظمة التي يمكن استخدامها لعدد وافر من التطبيقات الطبية الحيوية 1-4. في حين أن هناك العديد من الأمثلة على التطبيقات السريرية لCOL1، عدد قليل من هذه توظف COL1 المستمدة autologously لأن إعداد هذا البروتين يتطلب قلع مطولة مع الأخذ أيام أو أسابيع لأداء 5-7. ونتيجة لذلك، والمحققين البحوث والأطباء عموما استخدام، المستحضرات التجارية باهظة الثمن من COL1 التي يتم إعدادها باستخدام الأنسجة غير البشرية مثل الفئران والأبقار، أو أدمة الخنازير أو باستخدام إزالة الجثث من الجلد أو بعد ختان الذكور. للتطبيقات التجدد، وكثير من هذه المنتجات المعرض التباين فيما يتعلق قدرتها على تشكيل الصلبةمصفوفات أو يبني الأنسجة قادرة على دعم مرفق الخلية والنمو. وبالتالي، هناك حاجة واضحة لطريقة موحدة جديدة مصممة لاستخراج بسرعة COL1 من مصادر الأنسجة ذاتي الوصول إليها وفيرة.
أن مثل هذا الأسلوب توفير الوقت والمال في إعداد البحوث التي يمكن استخراجها COL1 من نموذج حيواني من الفائدة وتستخدم لاختبار قبل السريرية الأنسجة المهندسة وتجميعها على السقالات القائمة على الكولاجين. في الوقت نفسه، فإن وجود خيار استخدام معزولة بسرعة، COL1 المستمدة autologously في العيادة زيادة السلامة العامة للمرضى من شأنها أن تلقي خلاف ذلك خيفي أو مستحضرات أعضاء غير بشرية. للمرضى الذين يتلقون استعدادا ذاتي المنشأ، فإن هذا الأسلوب مبسطة يقلل كثيرا من الفاصل الزمني بين جمع خزعة وتطبيق الكولاجين. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين بناء على COL1 العزلة وتنقية الأسلوب الراسخة باستخدام عالية السرعة AGitation والحجم الاستبعاد الطرد المركزي. هذه طريقة بسيطة لأداء باستخدام مخازن القياسية والمعدات الموجودة في العديد من المختبرات. من خلال توظيف عالية السرعة والإثارة، لدينا بروتوكول يقلل من الوقت اللازم لعزل القابلة للذوبان، الجلد COL1 من ما يقرب من 10 يوما إلى أقل من 3 ساعة 8. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها بسهولة في الإعداد السريرية من أجل إعداد COL1 المستمدة autologously للاستخدام في المرضى خلال مجموعة واحدة من الإجراءات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هنا سوف علينا أن نظهر عزلة COL1 من الجلد الضأن. كما هو مكتوب، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لعزل بنجاح COL1 من الأرانب وجلد الإنسان.
1. إعداد الجلدية عينة
- تتوازن جميع الكواشف إلى 4 درجة مئوية قبل استخدامها.
- شطف العينة الجلدي (25-50 غ) في DH الجليد الباردة 2 O وإزالة أي الصوف والفراء، أو الشعر مع كريم مزيل الشعر.
- استخدام شفرة حلاقة واحدة الحافة لكشط نظيفة عينة من النسيج الضام والدهون.
- شطف العينة في الجليد الباردة درهم 2 O.
- شريحة عينة الجلد إلى 1 سم × 1 سم قطع مع شفرة حلاقة واحدة الحافة.
2. إزالة المواد غير كولاجيني Solubilized
- تزن من 5 غرام من العينة في أنبوب 50 مل المخروطية وإضافة 30 مل من الجليد الباردة M 0.5 خلات الصوديوم.
- خلط الأنابيب لمدة 1 دقيقة في 6 إعداد م / ثانية باستخدام محول أنبوب 50 مل في الخالط مقعد بين كبار.
- تجاهل سوبernatant وتكرار لما مجموعه 7 الصوديوم خلات دورات الغسيل.
- شطف العينة في DH الجليد الباردة 2 O وتخلط مرة واحدة لإزالة خلات الصوديوم المتبقية.
- استخدام ملعقة لضغط العينة ضد الجانب من الأنبوب لإزالة السائل الزائد، ثم نقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية الطازجة.
3. النوع الأول الكولاجين استخراج
- غسل العينة مرتين في 2 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات لمدة 1 دقيقة في 6 متر / ثانية في الخالط مقعد بين كبار ضغط العينة والتخلص من طاف بعد كل غسل.
- إضافة جديدة 2 مل / ز قسامة من 0.075 M الصوديوم العازلة سترات للعينة.
- تنفيذ 6 متتابعة 1 دقيقة، 6 م / ثانية دورات مقعد بين كبار مزيج من الانفعالات الخالط دون إزالة المنطقة العازلة بين كل دورة.
- نقل، طاف واضحة سميكة إلى أنبوب جمع.
- إضافة مبلغ إضافي 1 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات إلى عينة واحدة وأداء النهائي مقعد بين كبار الخالط agitaدورة نشوئها.
- إضافة هذا طاف النهائي إلى أنبوب جمع.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جمع 3،200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف إلى المقصورة العلوي من 100،000 الوزن الجزيئي قطع جهاز تصفية الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل COL1 تنقيته من المقصورة العلوية لأنبوب مخروطي نظيفة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول العزلة COL1 يتطلب حوالي 2 ساعة و 15 دقيقة لإكمال. ويبين الشكل 1 رسما تخطيطيا يحدد الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء. إعداد العينة وتنفيذ 7 دورات من الثورات عالية السرعة ويشطف مع خلات الصوديوم يستغرق حوالي 35 دقيقة (أرقام 1A-C). أداء التحريض واحدة وشطف دورة مع DH 2 O يستغرق حوالي 5 دقائق (أرقام 1D و1E). مضيفا سيترات الصوديوم وإخضاع العينة إلى التحريض واحدة وشطف دورة تليها 6 دورات من الهياج يستغرق حوالي 45 دقيقة (أرقام 1F و1G). الطرد المركزي في المواد الصلبة المتبقية من استخراج السائل يستغرق 15 دقيقة (الشكل 1H). أخيرا، ونقل العينة إلى جهاز التصفية وتنفيذ الخطوة الطرد المركزي أخرى لتركيز المنقى، COL1 solubilized وإزالة البروتينات الصغيرةيستغرق 30 دقيقة (أرقام 1I و1J). المنتج النهائي هو المركزة، وإعداد عالية نقية من ذوبان COL1 التي يمكن بلمرة بإضافة مزيد من نا 2 HCO 3 واحتضان عند 37 درجة مئوية. النقيض من المرحلة المجهري الصور من هذا المنتج تكشف عزز الألياف COL1 التي يمكن أن تكون بمثابة ركيزة لمرفق الخلية إلى لوحات زراعة الأنسجة أو استخدامها بوصفها سقالة ل3-D تطبيقات هندسة الأنسجة (أرقام 2A و 2B).
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لتحسين طريقة عزل COL1. أ) يتم إضافة شرائح الأدمة إلى 50 مل أنبوب مخروطي. ب) يضاف 0.5 M خلات الصوديوم إلى عينة. ج)تخضع العينة إلى 7 دورات الانفعالات مع العازلة خلات الصوديوم استبدالها بعد كل دورة. D) DH 2 O يضاف إلى عينة الجلد. E) يخضع إعداد دورة إلى 1 من الانفعالات وDH 2 O يسكب قبالة. F) يضاف 0.075 سيترات الصوديوم M للعينة. G) يخضع العينة إلى 6 دورات من الانفعالات. H) يتم طرد عينة لإزالة المواد الصلبة الكبيرة. الأول) يتم نقل طاف ل100،000 الوزن الجزيئي بقطع حدة تصفية الطرد المركزي في أنبوب مخروطي. J) يتم طرد هذه الوحدة ويتم جمع السائل اللزج الذي يبقى في المقصورة العليا.
الشكل 2. العزلة السريع جيئة وذهابام الأدمة لانتاج COL1 بلمرة إلى الألياف. تم تحييد القابلة للذوبان COL1 بإضافة نا 2 HCO 3 ثم حضنت في 37 درجة مئوية. صورة النقيض من المرحلة (أ) وصورة مجهرية انتقال الإلكترون (تبين الحفاظ د النطاقات) (ب) من الألياف COL1 إنشاؤها باستخدام أسلوب العزلة السريع لدينا. أشرطة النطاق = 10 ميكرون و 500 نانومتر (على التوالي). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وثمة عنصر حاسم لهذا الأسلوب هو ضغط كفاءة المتكررة من العينة عن طريق الجلد لإزالة السائل الزائد. فمن الأهمية بمكان لإزالة أكبر قدر ممكن خلات الصوديوم في الخطوة 2.5 عن طريق ضغط العينة. نستخدم ملعقة ضغط الجلد ضد الجانب من الأنبوب، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا القماش القطني، على الرغم من أن هذا يستلزم إزالة عينة من الأنبوب وزيادة الوقت اللازم لتنفيذ هذه الخطوات. وبالمثل، فإنه من المهم لضغط العينة في الخطوة 3.1 بحيث حجم سيترات الصوديوم دقيقة في الخطوات اللاحقة استخراج. وفشل لإزالة السائل كاف من العينة في أي من هذه الخطوات يكون لها تأثير ضار على العائد COL1 النهائي. آخر عنصرا رئيسيا لهذا البروتوكول هو للحفاظ على جميع الكواشف في 4 درجات مئوية. وهذا يضمن استخراج كفاءة COL1 solubilized الحامض ويمنع تصلب الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ الإجراء باستخدام جميعالكواشف معقمة في بيئة معقمة. وهذا سيكون له أهمية خاصة بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في توظيف هذا الأسلوب لعزل COL1 لاستخدامها في البشر. العديد من المصادر التجارية من COL1 تم تعقيمها بشكل فعال من خلال التشعيع بأشعة غاما. للأسف، فإن هذه الممارسة يقلل إلى حد كبير قدرته على تشكيل المواد الهلامية بسبب تفتت البروتين وتمسخ 9،10.
ويمثل هذا الإجراء الظروف المثلى لاستخراج COL1 كما هو محدد من العديد من التجارب أجريت لتحديد النسبة المثالية من عينة الجلد لتخفيف حدة التخزين. ويقترح إضافة المزيد من أنابيب عندما يرغب المحقق لتوظيف هذا الإجراء لعينات الجلد أكبر. بناء على خبرتنا، فإنه ليس من المستحسن لإضافة المزيد من عينة أو المخزن المؤقت مما هو مذكور لكل أنبوب. فمن الجدير بالذكر أيضا أن حبات تتكون من السيليكا، والسيراميك، والعقيق، وأكسيد الألمنيوم، وكربيد السيليكون، أو أكسيد الزركونيوم، والتي تستخدم عادة بالاشتراك مع بench أعلى المجانسة، وحذفت من الإجراء لدينا. في 6 دورات متتابعة 1 دقيقة التحريض هو موضح في الخطوة 3.3 ضرورية بسبب وجود قيود التي تفرضها أجهزة الانفعالات لدينا. يمكننا أن تستنهض الهمم سوى عينة لما مجموعه 60 ثانية في كل مرة، وبعد ذلك يتطلب الجهاز توقف. إذا كان أحد لديه المعدات التي يمكن تعيينها لمدة 6 دقائق على التوالي، فإنه من المحتمل أن يكون على ما يرام للتبديل إلى واحد، ودورة لمدة ست دقائق. نحن لا، ومع ذلك، تشير الالتزام الصارم لوزن وحجم العينة العازلة وصفها.
وقد وجدنا هذا الأسلوب إعداد يعزل بكفاءة ذوبان COL1 من الضأن، الأرانب، وعينات الجلد الإنسان 8. من ناحية أخرى، وكان هذا البروتوكول لم تنجح في تنقية COL1 من عينات الجلد الخنازير. حتى مع تعديلات واسعة النطاق لطريقة، أنتجت الأدمة الخنزير مبلغ باهظ من زبد لأن الدهون المتبقية والدهون مما يؤدي إلى استخراج COL1 غير فعالة. على العكس، COL1 يمكن تنقيته من ذيول الفئران كلهأو معزولة الفئران الأوتار الذيل باستخدام إعداد معدلة بشكل طفيف يتضمن lysing حبات مصفوفة. وقد سبق وصف ذلك بالتفصيل 8.
للعلماء البحوث، والاستخدامات المحتملة للحمض solubilized النهائي COL1 المنتجات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة ما يلي: أ) توفير الركيزة لاصقة لوحات الثقافة لدعم مرفق الخلية والانتشار، ب) الصغيرة الزخرفة من السطوح لمدة 2 - 3 أو - الأبعاد (2 - أو 3-D) خلية ثقافة، وج) إنشاء السقالات 3-D لتطبيقات هندسة الأنسجة. في حين أن بعض كمية صغيرة من تقلب الكثير إلى الكثير هو متوقع من أي طريقة تنقية، وجدنا أن هذه الاستعدادات COL1 السائل هي دائما قادرة على أن تكون جنبا إلى جنب مع السكان الخلية المختلفة وصبها في قوالب. بعد تحييد الحموضة والاحتباس الحراري، والنتيجة هي الأنسجة المهندسة وطدت بناء مع الخلايا الموجهة مكانيا توزع بالتساوي في جميع أنحاء المصفوفة. اعتمادا على شكلالعفن، وهذه التركيبات التي يمكن إدخالها في أي شكل وحجم تقريبا 3،4،11-14.
باختصار، فمن رأينا أن السبب الأكثر إلحاحا للاستفادة من هذا الأسلوب هو أنه يقلل بشكل كبير من الوقت والجهد اللازمين لعزل عالية نقية، قابل للذوبان COL1 من مصدر الأنسجة ذاتي مثل خزعات الجلد الصغيرة. ويستند هذا الأسلوب على الإجراءات المعمول بها منذ فترة طويلة وتنتج المنتجات التي تلبي أو تتجاوز نوعية الاستعدادات تجارية باهظة الثمن فيما يتعلق نقاء COL1 والقدرة على تكوين الأنسجة مستقرة 3-D. في نفس الوقت، وهذه الطريقة المبسطة يسمح للعزلة فعالة وسريعة من COL1 المستمدة autologously التي يمكن استخدامها بأمان لعدد وافر من التطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 إلى DBC)، وجائزة الباحث جديد من صندوق البحوث الدراسه (لCAP)، منحة في والمساعدات من جمعية القلب الأمريكية (12GRNT11910008 إلى DBC) ، منحة بحثية من مؤسسة القلب للأطفال (لDBC)، والتبرعات لمستشفى صندوق الأطفال في بوسطن القلب التوصيل، والوقف ريان الأسرة، وديفيد بولمان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
