Abstract
Адгезии анализы Сотовый / частиц имеют решающее значение для понимания биохимических взаимодействий, участвующих в патофизиологии заболеваний и имеют важные приложения в стремлении к разработке новых терапевтических средств. Анализы, использующие статические условия не в состоянии захватить зависимость адгезии на сдвиг, что ограничивает их корреляцию с окружающей среды в естественных условиях. Параллельные камеры потока пластина, которая количественно адгезию при физиологической потока жидкости нужно несколько экспериментов для генерации сдвига адгезии карте. Кроме того, они не представляют естественных условиях масштаба в и морфологию и требуют больших объемов (~ мл) реагентов для экспериментов. В этом исследовании, мы демонстрируем поколение сдвига адгезии карте из одного эксперимента с использованием сети микрососудов микрожидкостных устройств, SynVivo-SMN основе. Это устройство воссоздает комплекс в естественных условиях сосудистой включая геометрической шкале, морфологических элементов, особенности течения и клеточных взаимодействий вФормат в пробирке, тем самым обеспечивая биологически реалистичное окружение для фундаментальных и прикладных исследований в клеточной поведения, доставки лекарств и лекарственных препаратов. Анализ показал, изучая взаимодействие мкм биотина покрытием частиц 2 с авидином покрытием поверхности микрочипа. Весь ассортимент сдвига, наблюдаемого в микрососудов получается в одном анализа позволяет адгезии против карте сдвига для частиц в физиологических условиях.
Introduction
Текущие анализы для изучения в клетка-клетка и частица-клеточных взаимодействий обычно включают статический формат луночный планшет, в котором частицы или клетки инкубируют в белковых матриц или адгезивных клеток. В конце указанного времени инкубации, количество прилипших частиц или клеток количественно с помощью микроскопии 1. Даже если эти анализы обеспечивают значительно углубить понимание биохимических процессов, стоящих за этими взаимодействиями, основным ограничением является отсутствие физиологического течения жидкости (типичный микроциркуляции) и его влияние на адгезию частиц.
Чтобы преодолеть это ограничение, в пробирке проточных камерах были разработаны в последние годы. Общим элементом этих проточных камерах представляет собой прозрачную устройство перфузии при небольших числах Рейнольдса, чтобы соответствовать скорости сдвига стены, наблюдаемые в кровеносных сосудах в естественных условиях 2. Стенке сосуда моделируется либо покрытие из биомолекул или роста клеток на одной поверхности потока сHamber 3. Частицы 4-7 или 8-16 клетки затем течет в в желаемом диапазоне расходов количественно количество придерживаясь частиц при различных скоростях сдвига.
Тем не менее, использование параллельных проточных камерах пластина для изучения и проверки биохимические явления довольно дорого и отнимает много времени. Это происходит главным образом из-за того, что несколько экспериментов должны быть проведены для генерирования карту жидкостного сдвига от количества частиц / клеток прилипшего. Кроме того, камеры потока пластина требуют больших объемов реагентов из-за их большого размера (высота> 250 мкм и шириной> 1 мм). Наконец, эти устройства не точно моделировать геометрические особенности (например, бифуркации) и условий обтекания (например, сходящиеся против расходящиеся потоки), которые присутствуют в естественных условиях.
Последние достижения в области литографии на основе микротехнологий 17-19 ускорили поле лаборатории-на-чипеустройства 20-21. Эти устройства играют важную роль в развитии миниатюрные версии камеры параллельного потока пластина с размерами в режиме микрометра. Снижение размерности также дает значительные преимущества с точки зрения объемов реагентов, клетки или частицы, необходимой для экспериментов. Тем не менее, ключевым ограничение имеющихся в настоящее время устройств является использование линейных каналов для моделирования микрососудов, которые не имитируют сложную микроциркуляторного русла наблюдается в естественных условиях.
Недавно мы разработали новый методику воссоздания микрососудистых сетей на одноразовых пластиковых подложках в результате чего синтетического представления естественных условиях обстановки в. Эти устройства называются SynVivo-Синтетические Микрососудистые сети (SMN) разрабатываются с использованием PDMS основе процесса плавного литографии. Устройства SynVivo-SMN может быть использован для получения сдвига адгезии карту адгезии 22 клеток / частиц, исследование целевой доставки лекарств 23 и чAve была подтверждена против естественных условиях данных в 24-25. В этой статье мы приводим протокол, который позволяет поколение сдвига адгезии карте из одного эксперимента объемов как малые, как 1-5 мкл тем самым приводит к значительной экономии ресурсов и времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Грунтовка микрожидкостных устройств SynVivo-СМН
- Каждый порт (вход / выход) устройства состоит из двух параллельных портов - один для протекания в поверхностных покрытий фрагментов (молекулы адгезии, матрицы роста и др.) и / или клеток для посева, а другой для проведения анализа (рис. 1А ).
- Полностью погрузите SynVivo-SMN микрожидкостных устройств (рис. 1В) в чашке Петри, содержащей стерильной деионизированной (DI) водой и поместить блюдо в вакуумном эксикаторе. Разрешить эксикатор работать, пока весь воздух не будет удален из каналов устройства. Это должно занять приблизительно 15 минут.
- Перед извлечением устройства из воды, поместите Tygon трубки (OD 0,06 "и идентификатор 0,02") загрунтовать воды в каждом порту устройства с тонкой точечных щипцами. Трубка должна быть приблизительно на 1 дюйм в длину. Устройство теперь могут быть удалены из воды. Рисунок 1C показывает изображение дэвове с трубки.
2. Покрытие микрожидкостных устройств с целевой белок (например, Авидин)
- С помощью пипетки поместите каплю воды (приблизительно 100 мкл) вокруг основания трубки одно впускное отверстие порта. Осторожно снимите трубку, используемую для премьер-устройства. Капля воды предотвратит попадание воздуха в устройство.
- Подготовка 1 мл шприц с авидином, загруженной в концентрации 20 мкг / мл. Подключите шприц к 24 G из нержавеющей стали иглы и трубки. Вставка трубки к одному из впускных отверстий устройства. Зажмите входное отверстие не используются с челюсти зажима.
- Введите авидин при скорости потока 1 мкл / мин в течение 10 мин, чтобы позволить полную перфузию устройства. В конце времени потока, зажать трубу с челюстной зажима и поместить устройство при 4 ° С в течение ночи.
3. Измельчитель Биотинилированный Particles для приклеивания экспериментов
- Разрешите устройствудо комнатной температуры. Поставьте устройство на перевернутом флуоресцентный микроскоп оснащен моторизованным стадии и камерой высокого разрешения.
- Готовят раствор 2 мкм биотинилированных частиц в концентрации 5 × 10 6 частиц / мл в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS). Загрузить частиц в 1 мл шприца. Подготовьте второй 1 мл шприц только PBS. Загрузите каждый шприц на шприцевой насос и подключить к иглой и труб.
- С помощью пипетки поместите каплю воды (приблизительно 100 мкл) вокруг основания трубки входное отверстие. Осторожно снимите трубку, используемую для покрытия устройства. Капля воды предотвратит попадание воздуха в устройство.
- Осторожно вставьте трубки для биотинилированными частиц и PBS с шагом 3.2 в каждый из впускных каналов. 2А показывает изображение установки.
- Начать инъекционных биотинилированных частиц при скорости потока 2,5 мкл / мин. Следить за входное отверстие на микроскопом. При первых признакахчастиц, начинают таймер и продолжать подачу в течение 3 мин.
- В конце 3 мин, остановить поток биотинилированных частиц, одновременно глядя поток PBS при скорости потока 2,5 мкл / мин. Разрешить PBS течь в устройстве в течение 3 мин смыть несвязанных частиц.
4. Получение изображений и внесении прочих интересных (AOI) измерений с помощью программы создания (NIKON Elements)
- Используйте функцию "сканирования большое изображение" в ПО для обработки изображений, чтобы приобрести имидж всего устройства.
- Номер Последовательно бифуркации в устройстве и создать круговую AOI с удвоенной диаметра каналов. В этом случае, установите диаметр AOI до 200 мкм, так как диаметр канала составляет 100 мкм.
- Используйте автоматическую функцию счетчика в ПО для обработки изображений, чтобы экспортировать число частиц в каждой AOI к листа MS Excel.
- Кроме того, использовать функцию автоматического подсчета экспортировать число частиц в всейУстройство.
5. Частиц флюса анализ с помощью вычислительной гидродинамики (CFD) Модели
- CFD моделирования выполняются с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (CFD-ACE +, ESI Инк) для топологии устройства SynVivo-SMN. Результаты хранятся в базе данных для анализа экспериментальных наблюдений. Результаты моделирования хранить информацию на скоростях сдвига стены, скорости, потока частиц и адгезии в устройстве.
- Результаты моделирования используются для определения количества частиц, поступающих каждый AOI на основе заданной концентрации на входе частиц.
6. Генерирующая сдвиг адгезии Карта
- Вычислить% адгезии путем деления прилипших частиц в области бифуркации частицами, текущими в области бифуркации как показано в уравнении 6.1.
где число частиц, прилипших частиц и плавные получаются из рrotocol шаги 4,3 и 5,2, соответственно. - Постройте сдвига адгезии карту, используя скорость сдвига на каждом бифуркации сетей, полученных из базы данных в шаге (5.1) и% значений адгезии, полученных из уравнения 6.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На фиг.1А схематически и светлое изображение области SynVivo-SMN устройства. Фиг.1В показывает SynVivo-SMN устройство монтируется на предметное стекло. Фиг.1С показывает устройство с трубкой следующее грунтовка с водой в вакуумном эксикаторе.
Фиг.2А показывает изображение опытно-создана. Фиг.2В показан типичный покрытые авидином SynVivo-SMN устройство После связывания 2 мкм биотинилированных частиц. Обратите внимание, что частицы преимущественно придерживаются около бифуркации в сети.
Фиг.3А показывает пронумерованные бифуркации в сети SynVivo-SMN. Фиг.3В показывает пример стенки карту сдвига, порожденный CFD модели устройства. Скорость сдвига изменяется в устройстве в диапазоне от 250 с -1 до 15 сек -1 как это наблюдается в микрососудов в естественных условиях. Обратите внимание, что эти измененияскорости сдвига не могут быть получены одновременно в линейных микроканалов, поскольку они обеспечивают постоянной скорости сдвига для каждой скорости потока. Фигура 3С показан график значений скорости сдвига на каждом из бифуркаций сети. Данные показывают, что образцы скорости сдвига являются сложными и не могут быть получены с помощью простой аналитической отношений в отличие от линейных проточных каналов. Кроме того, несколько бифуркации (ДЗЗ) присутствуют в сети, которые подпадают в том же бункере сдвига, добавляя к статистической достоверности данных.
4А показаны примеры результатов анализа CFD для потоков частиц в сети, которые используются для вычисления потоков частиц в филиалах и бифуркации экспериментальной сети. 4В показывает сдвиг адгезии карту, считая с одного эксперимента SynVivo-SMN. Адгезия при сдвиге карты следующим образом обратную зависимость как наблюдаемое от сдвига адгезии карте, полученной излинейные эксперименты канала. Однако, в отличие помощью анализа SynVivo, один эксперимент позволяет поколение этой карте сдвига в отличие нескольких опытов, требуемых от линейных каналов приводит к значительной экономии времени и ресурсов. Обратите внимание, что эксперименты выполняются в трех экземплярах для максимального статистического анализа.
Рисунок 1. Устройства SynVivo-SMN. Левой панели (рис. 1А) показана схема устройства. Правая панель (рис. 1А) показывает яркую поля файл устройства. Фиг.1В показывает SynVivo-SMN устройство монтируется на предметное стекло микроскопа. Рисунок 1C показывает устройство с трубки Tygon ™ прилагается к впускных / выпускных портов следующих грунтовка с водой.
Рисунок 2. Типичный анализ адгезии в SynVivo-SMN. 2А показывает изображение опытно-SET UP. Фиг.2В показывает биотинилированные частицы После связывания в устройстве. Обратите внимание, что адгезия частиц оказывается локализованными вблизи бифуркации сравнению с ветвей сети.
Рисунок 3. Сдвига анализ в SynVivo-SMN. 3А показывает все бифуркации пронумерованные в сети и увеличенный вид бифуркации из экспериментов. 3В показана карта качественный стены сдвига в бифуркации в сети. Рисунок3C показывает количественную информацию о сдвиге в филиалах в сети. Обратите внимание, что модели пластины в сети являются сложными и охватывают физиологические диапазоны скоростей сдвига (0-240 сек -1), найденные в естественных условиях.
Рисунок 4. Генерация сдвига адгезии карте. 4А подчеркивает траектории частиц (показаны белым цветом) в сетях, полученных в результате моделирования CFD. Эти траектории после обработки для получения потоков частиц в различных отраслях и бифуркации. 4В показывает сдвиг карту адгезии, полученную от одного эксперимента SynVivo-SMN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Параллельных камер потока пластина, обеспечивая при этом значительные понимание клетка-клетка и клетка-частичных взаимодействий, имеют несколько ограничений, таких как высокое потребление реагентов и необходимости нескольких опытов, чтобы генерировать сдвига адгезии карту. Использование SynVivo-синтетических микрососудистых сетей (SynVivo-SMNs) позволяет поколение сдвига адгезии карте от одного эксперимента в условиях, имитирующих в условиях естественных условиях. Кроме того, также получают существенную экономию (> 95%) в реагентов.
Наиболее важным шагом в проведении экспериментов частиц адгезии с SynVivo-SMN является обеспечение пузырь бесплатно условия в чипе до экспериментов. Введение пузырьков приведет течь нестабильность и отсутствие доступа к "воздух заблокирован" регионы чипа. Следовательно, большое внимание должно быть принято во время вставки и извлечений из трубок из портов устройства. В случае пузыре, найденного в гоэ устройство во время заливки шагом, можно повторить шаг грунтовки снова, чтобы удалить пузырьки. Кроме того, можно поступать в СМИ / реагентов на низких скоростях потока (0,1 мкл / мин или меньше), чтобы обеспечить пузырь бесплатно грунтовки устройства.
Основным ограничением протокола является чип быть непригодным следующее присутствии пузырь, который не может быть удален. Тем не менее, при тщательном практике можно проводить эксперименты с рядом успеха 100%. Кроме того, генерация сдвига адгезии карте требует информации из моделей CFD. Тем не менее, предварительно вычислены база данных результатов CFD для различных условий потока может легко преодолеть необходимость для выполнения моделирования CFD.
Хотя, методология, представленные здесь использовали авидин-биотин систему для простоты демонстрации, любая комбинация лиганд-рецептор на частицы или клетки могут быть использованы для быть исследование частиц поверхность или клеточной поверхности взаимодействия в режиме реального времени в устройстве. Кроме того, клетки могут быть у.е.ltured в устройстве для изучения частиц клеточных и межклеточных взаимодействий. Культура клеток потребует покрытие из каналов устройства с матрицы, пригодной для желаемых типов клеток. Например, эндотелиальные клетки можно культивировать на фибронектина покрытием каналов. После слияния, эндотелиальные клетки можно активировать с помощью TNF-α или другие соответствующие цитокины. Лейкоциты (лейкоцитов) может быть введен и их взаимодействия на активированных эндотелиальных клеток могут быть изучены в режиме реального времени. Как и в протоколе показано в этом исследовании, адгезия сдвига карта белых кровяных клеток может быть легко сгенерирована из одного эксперимента.
Протокол упоминается в этой статье, могут быть использованы для изучения влияния сети морфологии на адгезию частиц / клетку в качестве модели естественных условиях обстановки в. Кроме того, эффект от потока на адгезию частиц / клеток и клеточного поведения для моделирования физиологических условий также может быть легко оценена. Наконец, протокол может быть намред учиться доставки лекарств и эффективность для адресной доставки в желаемых клеточных популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Плата за публикации этой статьи, спонсируемой CFD Research Corporation.
Acknowledgments
Технология SynVivo был разработан в рамках гранта # 2R44HL076034 от NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. Cell adhesion assays. Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
