Abstract
Cell / partikelvidhäftningsanalyser är avgörande för att förstå de biokemiska interaktioner som är involverade i sjukdoms patofysiologi och har viktiga tillämpningar i jakten på utveckling av nya behandlingar. Analyser som använder statiska förhållanden misslyckas med att fånga beroendet av vidhäftning på skjuvning, vilket begränsar deras korrelation med in vivo-miljö. Parallella plattflödeskammare som kvantifierar vidhäftning under fysiologiska fluidflöde behöver flera experiment för generering av en skjuv-vidhäftning kartan. Dessutom behöver de inte representera vivo skala och morfologi i och kräver stora volymer (~ ml) av reagenser för experiment. I denna studie visar vi alstringen av shear adhesion karta från ett enda experiment med användning av en mikrovaskulär nätverk baserat mikrofluidikanordning, SynVivo-SMN. Enheten åter komplexet in vivo kärl inklusive geometrisk skala, morfologiska element, flödesegenskaper och cellulära interaktioner i enin vitro-format, vilket ger en biologiskt realistisk miljö för grundforskning och tillämpad forskning i cell-beteende, drug delivery och läkemedelsutveckling. Analysen demonstrerades genom att studera interaktionen av de 2 ^ m biotin dragerade partiklarna med avidinbelagda ytor hos mikrochip. Hela serien av skjuvning observerats i mikrovaskulaturen erhålles i en enda analys som möjliggör vidhäftning mot skjuvning map for partiklama under fysiologiska betingelser.
Introduction
Aktuella analyser för att studera till cell-cell och partikel-cell interaktioner innebär vanligen statisk brunnar format som partiklar eller celler inkuberas på protein matriser eller vidhäftande celler. Vid slutet av den angivna inkubationstiden, är antalet vidhäftande partiklar eller celler kvantifieras med hjälp av mikroskopi 1. Även om dessa analyser ger betydande insikt i de biokemiska processerna bakom dessa interaktioner, är en viktig begränsning bristen på fysiologiska vätskeflöde (typiskt för mikrocirkulationen) och dess inverkan på partikel vidhäftning.
För att övervinna denna begränsning, har in vitro-flödeskammare har utvecklats under senare år. Ett vanligt inslag i dessa flödeskammare är en transparent apparat perfusion vid låga Reynolds-tal för att matcha vägg skjuvhastigheter observerats i blodkärl in vivo 2. Kärlväggen modelleras med antingen beläggning av biomolekyler eller tillväxt av celler på en yta av flödes cHamber 3. Partiklar 4-7 eller celler 8-16 sedan flöt in på önskat område av flöden för att kvantifiera antalet vidhängande partiklar under olika skjuvhastigheter.
Emellertid är ganska dyrt och tidskrävande att använda parallella plattan flödeskammare för att studera och validera de biokemiska fenomen. Detta beror främst på det faktum att flera försök måste genomföras för att skapa en karta över fluid skjuvning mot antalet partiklar / celler följs. Dessutom plattan flödeskammare kräver stora volymer av reagenser på grund av deras stora storlek (höjd> 250 ^ m och en bredd av> 1 mm). Slutligen har dessa enheter inte exakt modell geometriska egenskaper (t.ex. bifurkationer) och flödesförhållanden (t.ex. konvergerande kontra divergerande flöden) som finns in vivo.
Senaste framstegen inom litografi baserad mikro 17-19 har accelererat inom lab-on-a-chipanordningar 20-21. Dessa enheter har bidragit till att utveckla en miniatyriserad version av den parallella plattflödeskammare med mått i mikrometer regimen. Minskningen av dimensionen ger också stora fördelar i form av volymer av reagenser, celler eller partiklar som krävs för experiment. Emellertid är en viktig begränsning av de för närvarande tillgängliga anordningar användningen av linjära kanaler för att modellera mikrokärl, som inte efterliknar den komplexa mikrovaskulaturen observerats in vivo.
Vi har nyligen utvecklat en ny metod för att återskapa mikrovaskulära nätverk på engångsplastunderlag som leder till syntetisk representation av de vivo-förhållanden. Dessa enheter kallas SynVivo-Syntetiska Mikrovaskulära Networks (SMN) är utvecklade med PDMS baserade mjuk litografi process. SynVivo-SMN-enheter kan användas för att få skjuvning vidhäftning karta över cell / partikel adhesion 22, studie målstyrning av läkemedel 23 och have validerats mot in vivo-data 24-25. I detta papper presenterar vi ett protokoll som möjliggör generering av skjuvning vidhäftnings karta från ett enda experiment i volymerna så små som 1-5 pl vilket resulterar i betydande besparingar av resurser och tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Priming den SynVivo-SMN mikroflödessystem enhet
- Varje port (inlopp / utlopp) av anordningen består av två parallella portar - en för strömmar i ytbeläggningsdelar (adhesionsmolekyler, tillväxtfaktorer matriser, etc.) och / eller celler för ympning och den andra för att köra analysen (Figur 1A ).
- Helt dränka SynVivo-SMN mikroflödessystem enhet (Figur 1B) i en petriskål med sterilt avjoniserat (DI) vatten och placera skålen i en vakuumtorkapparat. Tillåt exsickatorn löpa tills all luft avlägsnas från kanalerna hos anordningen. Det tar ungefär 15 minuter.
- Innan du tar bort enheten från vattnet, placera Tygon slang (OD på 0,06 "och ID av 0,02") fyllas med vatten till varje port på enheten med fin-punkt pincett. Slangen bör vara ungefär 1 tum i längd. Anordningen kan nu avlägsnas från vattnet. Figur 1C visar bilden av Device med slangen.
2. Beläggning av mikroflödessystem enhet med önskat protein (t.ex. avidin)
- Med användning av en pipett, placera en droppe vatten (cirka 100 ^ il) runt basen av en inloppsport slangen. Ta försiktigt bort slangen som används för att sätta i gång apparaten. Den droppe vatten kommer att hindra luft från att inträda i anordningen.
- Bered en 1 ml spruta laddad med avidin i en koncentration av 20 pg / ml. Anslut sprutan till en 24 G-rostfritt stål nål och slangar. Sätt i slangen till en av inloppsöppningarna hos anordningen. Kläm fast inloppet inte utnyttjas med en käke klämma.
- Injicera avidin vid en flödeshastighet av 1 jil / min under 10 min för att medge fullständig perfusion av anordningen. Vid slutet av flödestiden, klämma slangen med käken klämman och placera enheten vid 4 ° C över natten.
3. Flödande den Biotinylated Partiklar för vidhäftning Experiment
- Låt enhetenkomma till rumstemperatur. Placera anordningen på ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med en motoriserad scen och en högpresterande kamera.
- Bered en lösning av 2 | im biotinylerade partiklarna vid en koncentration av 5 x 10 6 partiklar / ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Fyll på partiklarna in i en 1 ml spruta. Förbered en andra 1 ml spruta med endast PBS. Fyll varje spruta på en sprutpump och anslut till nål och slangar.
- Med användning av en pipett, placera en droppe vatten (cirka 100 ^ il) runt basen av inloppsporten slangen. Ta försiktigt bort slangar som används för att belägga anordningen. Den droppe vatten kommer att hindra luft från att inträda i anordningen.
- Sätt försiktigt i slangen är för biotinylerade partiklar och PBS från steg 3.2 till var och en av inloppsportar. Figur 2A visar bilden av set-up.
- Börja injicera biotinylerade partiklar vid en flödeshastighet av 2,5 | il / min. Övervaka inloppsporten på mikroskopet. Vid första teckenav partiklar, börjar timern och fortsätter flödet till 3 min.
- Vid slutet av den 3 min, stoppa flödet av biotinylerade partiklar och samtidigt stirra flödet av PBS vid en flödeshastighet av 2,5 | il / min. Tillåt PBS för att strömma i anordningen under 3 minuter för att tvätta bort obundna partiklar.
4. Förvärva bilder och göra intresseområde (AOI) Mätningar Använda Imaging Software (NIKON Elements)
- Använd "scan stor bild"-funktionen i bildbehandlingsprogram för att hämta bilden för hela enheten.
- Sekventiellt nummer de förgreningar i enheten och skapa ett cirkulär AOI med dubbla diametern av kanalerna. I så fall in AOI diametern till 200 um eftersom kanaldiametern är 100 nm.
- Använd den automatiska räkningen funktion i bildbehandlingsprogram för att exportera antalet partiklar i varje AOI till en MS Excel-ark.
- Likaså använder den automatiska räkningen funktionen för att exportera antalet partiklar i helaenheten.
5. Particle Flux analys med Computational Fluid Dynamics (CFD) Modeller
- CFD-simuleringar drivs med hjälp av kommersiellt tillgängliga program (CFD-ACE +, ESI Inc.) för SynVivo-SMN enhet topologi. Resultaten lagras i en databas för analys av experimentella observationer. Den lagrar information simuleringsresultat på vägg skjuvhastigheter, hastighet, partikelflöde och adhesion i enheten.
- Simuleringsresultaten används för att fastställa antalet partiklar som kommer in varje AOI utifrån en given inlopp partikelkoncentration.
6. Generera Shear Adhesion Karta
- Beräkna% av vidhäftning genom att dividera de vidhäftade partiklarna i bifurkation av de partiklar som strömmar i förgreningen såsom visas i ekvation 6.1.
där antalet partiklar vidhäftade och de partiklar som strömmar erhålles från protocol steg 4,3 och 5,2, respektive. - Plotta shear adhesion kartan med hjälp av skjuvhastigheten vid varje förgrening av de nätverk som erhållits från databasen i steg (5,1) och de vidhäftningsvärden% erhålls från ekvation 6.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en schematisk och en ljus fältbild av SynVivo-SMN enhet. Figur 1B visar SynVivo-SMN anordning monterad på en glasplatta. Figur 1C visar anordningen med slangen efter primning med vatten i en vakuumexsickator.
Figur 2A visar en bild av den experimentella-inställd. Figur 2B visar en typisk avidinbelagda SynVivo-SMN anordning binds 2 ìm biotinylerade partiklar. Observera att partiklar företrädesvis hålla sig nära de förgreningar i nätverket.
Fig. 3A visar de numrerade bifurkationer i SynVivo-SMN nätverket. Figur 3B visar prov vägg skjuvning karta genereras av CFD-modell av anordningen. Skjuvhastigheten varierar i anordningen sträcker sig från 250 sek -1 till 15 sek -1 som observerades i mikrocirkulation in vivo. Observera att dessa varierandeskjuvningshastigheter inte kan erhållas samtidigt i linjära mikroflödeskanaler eftersom de ger en konstant skjuvhastighet för varje flödeshastighet. Fig. 3C visar en kurva av värdena av skjuvhastigheten vid vardera av de förgreningar av nätverket. Data visar att skjuvhastigheten mönstren är komplex och kan inte erhållas med en enkel analytisk relation till skillnad från linjära flödeskanaler. Dessutom flera förgreningar (AOI) finns i nätverket som faller i samma skjuvning bin, lägga till statistisk säkerhet av data.
Figur 4A visar provresultat av CFD-analys för partikelflöden i det nätverk som används för att beräkna partikelflöden i grenarna och förgreningar av den experimentella nätverket. Figur 4B visar skjuvning vidhäftnings kartan beräknas från den enda SynVivo-SMN experiment. Vidhäftningen skjuvning kartor följer det omvända förhållandet som observeras från skjuvning vidhäftning karta erhållits frånlinjära kanalexperiment. Men i kontrast med hjälp av en SynVivo analys, gör ett enda experiment generation av denna skjuvning kartan till skillnad från flera experimentella körningar som krävs från de linjära kanaler som leder till betydande besparingar av tid och resurser. Observera att experiment körs i tre exemplar för maximal statistisk analys.
Figur 1. SynVivo-SMN enheter. Vänster panel (Figur 1A) visar schematiskt anordningen. Höger panel (Figur 1A) visar ljusa fält bild av enheten. Figur 1B visar SynVivo-SMN enhet monterad på mikroskopglas. Figur 1C visar enheten med Tygon ™ slang fäst vid inlopp / utloppsportar efter grundning med vatten.
Figur 2. Typisk vidhäftningsanalys i SynVivo-SMN. Figur 2A visar en bild av den experimentella-inställd. Figur 2B visar biotinylerade partiklar efter bindning i enheten. Observera att partikel vidhäftning befinns vara lokaliserade nära bifurkation jämfört med grenarna i nätverket.
Figur 3. Shear analys i SynVivo-SMN. Figur 3A visar alla bifurkationer numrerade i nätet och en förstorad vy av förgreningar från experimenten. Figur 3B visar den kvalitativa vägg skjuvning karta i bifurkationer i nätverket. Figur3C visar den kvantitativa informationen om skjuvning i grenarna i nätverket. Observera att brytmönster i nätverket är komplexa och spänner över de fysiologiska intervallen skjuvhastigheter (0-240 sek -1) som finns in vivo.
Figur 4. Generering av skjuvning vidhäftning kartan. Figur 4A belyser partikelbanor (visas i vitt) i de nätverk som erhålls från CFD-simulering. Dessa banor är efterbehandlade för att erhålla partikelflöden i de olika grenarna och bifurkationer. Figur 4B visar skjuvning vidhäftning kartan erhållits från en enda SynVivo-SMN experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parallella plattflödeskammare, samtidigt som de ger betydande inblickar i cell-cell-och cell-partikelinteraktioner, lider av flera begränsningar såsom hög förbrukning av reagens och behovet av flera experimentella körningar för att generera en skjuvning vidhäftning kartan. Användningen av SynVivo syntetiska Microvascular Networks (SynVivo-SMNs) möjliggör alstring av en skjuv-vidhäftning karta från ett enda experiment under förhållanden som härmar in vivo-betingelser. Dessutom är betydande besparingar (> 95%) i reagens också erhållas.
Det viktigaste steget i att driva partikelvidhäftningsförsök med SynVivo-SMN är att säkerställa bubbla fria förhållanden i chipet före experiment. Införande av bubblor skulle leda till flödes instabilitet och brist på tillgång till "luft låst" regioner av chipet. Därför måste stor försiktighet vidtas vid insättningar och extraktioner av slangar från hamnarna i enheten. I händelse av en bubbla finns i: tee-enhet under priming steget, kan man upprepa priming steget igen för att ta bort bubblorna. Alternativt kan ett flöde i media / reagens vid en låg flödeshastighet (0,1 | il / min eller mindre) för att säkerställa bubbelfri primning av anordningen.
Den största begränsningen i protokollet är det chip som obrukbar efter förekomsten av en bubbla som inte kan tas bort. Men med noggrann praxis man kan utföra experiment med nära 100% framgång. Också, generering av skjuvning vidhäftning map kräver information från CFD-modeller. Däremot kan en i förväg beräknad databas av CFD resultat för olika flödesförhållanden lätt övervinna behovet att utföra CFD-simuleringar.
Även om den metod som presenteras här använde avidin-biotin-system för enkel demonstration, kan någon ligand-receptor-kombinationen på partiklar eller celler användas som studie partikel-yta eller interaktioner cellytan i realtid i enheten. Vidare kan celler cultured i anordningen för att studera partikel-cell-och cell-cell-interaktioner. Kultur av celler kräver beläggning av kanalerna för den enhet med matris lämplig för önskade celltyper. Till exempel kan endotelceller odlas på fibronektin belagda kanaler. Efter sammanflödet kan endotelcellerna aktiveras med hjälp av TNF-α eller andra relevanta cytokiner. Vita blodkroppar (WBC) kan injiceras och deras interaktioner på aktiverade endotelceller kan studeras i realtid. I likhet med det protokoll som visats i denna studie, kan en vidhäftnings skjuvning karta av vita blodkroppar lätt genereras från ett enda experiment.
Det protokoll som nämns i detta dokument kan användas för att studera effekten av nätverks morfologi på partikel / cell adhesion som en modell för in vivo-förhållanden. Dessutom är effekten av flödet på partikel / cellvidhäftning och cellbeteende för modellering av fysiologiska betingelser kan också lätt bedömas. Slutligen kan protokollet vara ossed för att studera läkemedelstillförsel och effekt för målinriktad leverans till önskade cellpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publikation avgift för den här artikeln sponsrad av CFD Research Corporation.
Acknowledgments
SynVivo tekniken utvecklades under bidrags # 2R44HL076034 från NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. Cell adhesion assays. Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
