Generering av skjæradhesjon Kart Bruke SynVivo Syntetisk mikrovaskulære Networks

Abstract

Cell / partikkeladhesjon analysene er avgjørende for å forstå de biokjemiske interaksjoner involvert i sykdom patofysiologi og har viktige anvendelser i jakten på utvikling av nye behandlingsformer. Analyser ved hjelp av statiske forhold klarer å fange avhengighet av adhesjonen på skjærkraft, noe som begrenser deres korrelasjon med in vivo miljøet. Parallell plate strømningskamre som kvantifiserer adhesjon under fysiologiske væskestrømmen trenger flere eksperimenter for generering av et kart skjæradhesjon. I tillegg har de ikke representerer in vivo skala og morfologi og krever store volum (~ ml) med reagenser for eksperimenter. I denne studien, demonstrerer vi generasjon skjæradhesjon kart fra et enkelt eksperiment ved hjelp av en mikrovaskulær nettverk basert microfluidic enhet, SynVivo-SMN. Denne enheten gjenskaper den komplekse in vivo blodkar inkludert geometrisk skala, morfologiske elementer, flytfunksjoner og cellulære interaksjoner i enin vitro-format, og gir dermed en biologisk realistisk miljø for grunnleggende og anvendt forskning i mobilnettet atferd, levering av legemidler, og legemiddelforskning. Analysen ble demonstrert ved å studere interaksjonen av de to mikrometer biotin-belagte partikler med avidin-belagte overflater av mikrochip. Hele serien av skjær observert i microvasculature blir oppnådd i en enkelt analyse muliggjør adhesjon sammenlignet med skjær kart for de partikler under fysiologiske betingelser.

Introduction

Omløps analyser for å studere til celle-celle og partikkel-celle interaksjoner involverer typisk statisk brønn plate-format, der partikler eller celler blir inkubert på protein-matrikser eller adherente celler. På slutten av den angitte inkubasjonstid, blir antallet adherente partikler eller celler kvantifiseres ved hjelp av mikroskopi ^1.. Selv om disse analysene gi betydelig innsikt i de biokjemiske prosessene bak disse interaksjoner, er en viktig begrensning mangel på fysiologiske strømning (typisk for mikrosirkulasjon) og dens innvirkning på partikkeladhesjon.

For å overkomme denne begrensningen, har in vitro flyt kamre blitt utviklet de siste årene. Et felles element i disse strømningskamrene er en transparent apparat perfundert ved lave Reynolds-tall som passer veggskjærhastigheter observert i blodkar in vivo ^2.. Den beholderveggen er modellert ved enten belegg av biomolekyler eller vekst av celler på den ene overflate av strømnings cHamber ^tre. Partikler ^4-7 eller ^8-16 celler blir deretter strømmet inn i det ønskede område av strømningshastigheter til å kvantifisere antallet holde partiklene under forskjellige skjærhastigheter.

Imidlertid er bruken av parallelle plate strømningskammere for å studere og å validere de biokjemiske fenomener ganske kostbart og tidkrevende. Dette er hovedsakelig på grunn av det faktum at flere eksperimenter må utføres for å generere et kart av fluidic skjær g. antall partikler / celler holdt. I tillegg plate strømningskamrene krever store volumer av reagenser på grunn av deres store størrelse (høyde> 250 um og bredde> 1 mm). Til slutt, disse enhetene ikke nøyaktig modell geometriske egenskaper (f.eks bifurcations) og strømningsforhold (f.eks konvergerende vs divergerende strømmer) som er tilstede i vivo.

Nylige fremskritt innen litografi basert microfabrication ^17-19 har akselerert innen lab-on-a-chipenheter ^20-21. Disse enhetene har vært medvirkende i å utvikle en miniatyrisert versjon av parallell plate flyt kammer med dimensjoner i mikrometer regime. Reduksjonen i størrelse gir også betydelige fordeler i form av volumer av reagenser, celler eller partikler som kreves for eksperimenter. Det er imidlertid en viktig begrensning av de for tiden tilgjengelige enheter ved bruk av lineære kanaler for å modellere microvessels, som ikke etterligner den komplekse microvasculature observert in vivo.

Vi har nylig utviklet en ny metode for å gjenskape mikrovaskulære nettverk på engangs plastunderlag som resulterer i syntetisk fremstilling av in vivo forhold. Disse enhetene betegnes SynVivo-Syntetiske mikrovaskulære Networks (SMN) er utviklet ved hjelp av PDMS basert soft-litografi prosess. SynVivo-SMN-enheter kan brukes til å skaffe skjæradhesjon kartet celle / partikkeladhesjon ^22, studere målrettet levering av legemidler ²³ og have blitt validert mot in vivo data ^24-25. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll som gjør det mulig generasjon av skjæradhesjon kart fra et enkelt eksperiment i volumene så små som 1-5 mL dermed resultere i betydelige besparelser av ressurser og tid.

Protocol

En. Grunning den SynVivo-SMN Microfluidic Device

1. Hver port (innløp / utløp) av anordningen består av to parallelle porter - en for strømmer i overflatebeleggdelene (adhesjonsmolekyler, vekst matrikser, etc.) og / eller celler for såing av frø, og den andre for gjennomføring av analysen (figur 1A ).
2. Fullstendig senk SynVivo-SMN mikrofluidinnretningen (figur 1B) i en petriskål inneholdende sterilt avionisert (DI) vann, og plassere formen i en vakuum-eksikkator. La eksikkator å løpe inntil all luft er fjernet fra kanalene i enheten. Dette bør ta ca 15 min.
3. Før du fjerner enheten fra vannet, legg Tygon slange (OD på 0,06 "og ID på 0,02") grunnes med vann i hver port på enheten med fin-punkts tang. Slangen bør være omtrent 1 cm i lengde. Anordningen kan nå fjernes fra vannet. Figur 1C viser bildet av device med slangen.

2. Coating Microfluidic Device med ønsket protein (f.eks, avidin)

1. Ved hjelp av en pipette, plassere en dråpe vann (ca. 100 ul) rundt bunnen av den ene tilførselsåpning slangen. Fjern forsiktig slangen som brukes til å prime enheten. Den vanndråpe vil hindre luft fra å komme inn i enheten.
2. Tilbered en 1 ml sprøyte lastet med avidin i en konsentrasjon på 20 pg / ml. Koble sprøyten til en 24 G nål av rustfritt stål og rør. Før produksjonsrøret til en av innløpsportene i enheten. Klem innløpsport som ikke er utnyttet med en kjeveklemme.
3. Injiser avidin ved en strømningshastighet på 1 mL / min i 10 min for å tillate fullstendig perfusjon av enheten. Ved slutten av spyletid, klemme slangen med kjeveklemmen og plassere anordningen ved 4 ° C over natten.

Tre. Flowing den Biotinylated Partikler for vedheft Experiments

1. Vent på at enhetenkomme til romtemperatur. Sett apparatet på en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en motorisert scene og et kamera med høy ytelse.
2. Tilbered en løsning av 2 mikrometer biotinylerte partikler i en konsentrasjon på 5 x 10 ^{til 6} partikler / ml i fosfatbuffer saltvann (PBS). Last inn partiklene i en 1 ml sprøyte. Forbered en andre en ml sprøyte med kun PBS. Laste hver sprøyte på en sprøytepumpe og koble til nål og slange.
3. Ved hjelp av en pipette, plassere en dråpe vann (ca. 100 ul) rundt bunnen av innløpsåpningen slangen. Fjern forsiktig slangen brukes til å belegge enheten. Den vanndråpe vil hindre luft fra å komme inn i enheten.
4. Sett forsiktig slangen er for biotinylerte partikler og PBS fra trinn 3,2 i hver av innløpsportene. Figur 2A viser bilde av oppsettet.
5. Begynn å injisere biotinylerte partikler ved en strømningshastighet på 2,5 mL / min. Overvåk innløpsporten på mikroskopet. Ved første tegnav partikler, begynner tidsuret og fortsette strømning i 3 min.
6. Ved slutten av de 3 minutter, stoppe strømmen av biotinylerte partikler samtidig stirrer strømmen av PBS ved en strømningshastighet på 2,5 mL / min. Tillat PBS for å strømme inn i enheten i 3 min for å vaske av ubundne partikler.

4. Skaffe bilder og Making område av interesse (AOI) målinger ved hjelp av bildebehandlingsprogram (NIKON Elements)

1. Bruk "scan stort bilde"-funksjonen i bildebehandlingsprogrammer for å hente bildet av hele enheten.
2. Sekvensielt nummer de bifurcations i enheten og opprette en sirkulær AOI med to ganger diameteren av kanalene. I så fall stiller diameteren AOI til 200 mikrometer siden diameter kanalen er 100 mikrometer.
3. Bruk den automatiserte teller funksjon i bildebehandlingsprogrammer for å eksportere antall partikler i hvert AOI til en MS Excel-ark.
4. På samme måte, bruke den automatiserte teller funksjonen for å eksportere antall partikler i heleenhet.

5. Particle Flux Analysis Bruke Computational Fluid Dynamics (CFD) Modeller

1. CFD simuleringer drives ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (CFD-ACE +, ESI Inc.) for SynVivo-SMN enhet topologi. Resultatene blir lagret i en database for å analysere eksperimentelle observasjoner. Den simuleringsresultatene lagre informasjon på veggen skjærhastigheter, fart, partikkel flux, og heft i enheten.
2. Simuleringsresultatene brukes til å bestemme antall partikler som kommer inn hvert AOI basert på en gitt innløp partikkelkonsentrasjonen.

6. Generering skjæradhesjon Kart

1. Beregn% av adhesjon ved å dividere det adherte partikler i bifurkasjon av partiklene som strømmer i bifurkasjon som vist i likning 6.1.
   
   der erholdes antallet partikler overholdes og de partikler som strømmer fra protocol trinn 4,3 og 5,2, henholdsvis.
2. Plott skjæradhesjon kartet ved hjelp av skjærhastighet på hver bifurcation av nettverkene hentet fra databasen i trinn (5.1) og de% vedheft verdier hentet fra ligningen 6.1.

Representative Results

Figur 1A viser et skjematisk og et lyst felt bilde av SynVivo-SMN enhet. Figur 1B viser SynVivo-SMN enhet er montert på en glass-slide. Figur 1C viser anordningen med slangen etter priming med vann i en vakuum-eksikkator.

Figur 2A viser et bilde av den eksperimentelle-oppstilling. Figur 2B viser et typisk avidin-belagte SynVivo-SMN enhet etter binding av to mikrometer biotinylerte partikler. Legg merke til at partiklene holder seg fortrinnsvis i nærheten av de bifurcations i nettverket.

Fig. 3A viser de nummererte bifurcations i SynVivo-SMN nettverk. Figur 3B viser prøveveggen skjær kort som genereres av CFD-modell av anordningen. Den skjærhastighet varierer i anordningen som strekker seg fra 250 sek ^-1 til 15 sek ^-1 som observert i microvasculature in vivo. Merk at disse varierendeskjærhastigheter ikke kan oppnås samtidig i lineære microfluidic kanaler som de gir en konstant skjærhastighet for hver strømningshastighet. Figur 3C viser et plott av verdiene av den skjærhastighet ved hver av forgreningene for nettverket. Dataene viser at skjærhastighetsmønsteret er komplekse og kan ikke oppnås med en enkel analytisk forhold i motsetning til lineære strømningskanaler. Videre flere bifurcations (AOIs) er til stede i nettverket som faller i den samme skjær bin, og legger til den statistiske tillit av dataene.

Figur 4A viser eksempler på resultater av CFD-analyse for partikkel flukser i nettet som brukes til å beregne partikkel flukser i grenene og forgreningene for det eksperimentelle nettverket. Figur 4B viser skjæradhesjon kart beregnet fra enkelt SynVivo-SMN eksperimentet. Den skjæradhesjon maps følger den inverse forholdet som observert fra skjæradhesjon kartet innhentet fralineære kanal eksperimenter. Men i motsetning bruker en SynVivo analysen, gir et enkelt eksperiment generasjon av denne skjær kartet motsetning til flere eksperimentelle kjører kreves fra de lineære kanaler som resulterer i betydelige besparelser av tid og ressurser. Merk at eksperimenter blir drevet i triplicates for maksimal statistisk analyse.

Figur 1. SynVivo-SMN enheter. Venstre panel (figur 1A) viser en skjematisk av enheten. Høyre panel (figur 1A) viser lyse felt bilde av enheten. Figur 1B viser SynVivo-SMN enhet montert på mikroskop glass slide. Figur 1C viser enheten med Tygon ™ slange festet til innløp / utløp porter følgende priming med vann.

Figur 2. Typisk adhesjonsanalysen ifølge SynVivo-SMN. Figur 2A viser et bilde av den eksperimentelle-oppstilling. Figur 2B viser biotinylerte partikler bindes i enheten. Legg merke til at partikkel-adhesjon er funnet å være lokalisert i nærheten av delinger i forhold til de grenene av nettverket.

Figur 3. Skjær analyse i SynVivo-SMN. Figur 3A viser alle bifurcations nummererte i nettverket og et forstørret bilde av bifurcations fra forsøkene. Figur 3B viser den kvalitative veggen skjær kartet i de bifurcations i nettverket. Figur3C viser kvantitativ informasjon om skjær i grener i nettet. Merk at skjær mønstre i nettverket er komplekse og spenner de fysiologiske utvalgene av skjærhastigheter (0-240 sek ^-1) funnet in vivo.

Figur 4. Generering av skjæradhesjon kartet. Figur 4A fremhever partikkelbaner (vist i hvitt) i nettverkene hentet fra CFD simulering. Disse baner er etter-behandlet for å oppnå partikkel flukser i de forskjellige avdelinger og de ​​bifurcations. Figur 4B viser skjæradhesjon kart erholdt fra en enkelt SynVivo-SMN eksperimentet.

Discussion

Parallell plate strømningskamrene, samtidig som det gir betydelige innsikt i celle-celle-og celle-partikkelinteraksjonene, lider av flere begrensninger som høyt forbruk av reagenser, og behovet for flere eksperimentelle kjøringer for å generere et kart skjæradhesjon. Bruken av SynVivo-syntetiske mikrovaskulær Networks (SynVivo-SMNs) muliggjør genereringen av et skjæradhesjon kart fra et enkelt eksperiment ved tilstander etterligne in vivo-betingelser. I tillegg er betydelige besparelser (> 95%) i reagenser også erholdt.

Det viktigste steget i å kjøre partikkeladhesjon eksperimenter med SynVivo-SMN er å sikre boble frie forhold i brikken før eksperimentering. Innføring av bobler ville føre til å strømme ustabilitet og mangel på tilgang til "luft låst" regioner av brikken. Derfor trenger stor forsiktighet for å bli tatt under innsettinger og uttak av produksjonsrør fra havnene i enheten. I tilfelle av en boble som finnes i the-enhet under priming trinn, kan man gjenta grunning skritt igjen for å fjerne boblene. Alternativt kan man flyte i media / reagenser til en lav strømningshastigheter (0,1 mL / min eller mindre) å sikre boble gratis grunning av enheten.

Den viktigste begrensning av protokollen er brikken blir ubrukbar etter tilstedeværelsen av en boble som ikke kan fjernes. Men med forsiktig praksis kan man utføre eksperimenter med nær 100% suksess. Også, generering av skjæradhesjon kartet krever informasjon fra CFD-modeller. Imidlertid kan en pre-beregnet database med CFD resultater for ulike strømningsforhold lett overvinne behovet for å utføre CFD simuleringer.

Selv om metoden som er presentert her brukt avidin-biotin-systemet for enkel demonstrasjon, kan en hvilken som helst ligand-reseptor-kombinasjonen på partikler eller celler benyttes til å være studie partikkel-overflate-eller celle-overflate-vekselvirkninger i sanntid i enheten. Videre kan cellene være cultured i enheten for å studere partikkel-celle og celle-celle interaksjoner. Dyrkning av celler krever belegging av kanalene i enheten med matrise egnet for ønskede celletyper. For eksempel kan endoteliale cellene dyrkes på fibronektin belagt kanaler. Etter sammenløpet, kan de endotelcellene aktiveres ved hjelp av TNF-α-eller andre relevante cytokiner. Hvite blodlegemer (wbcs) kan injiseres og deres interaksjoner på aktiverte endotelceller kan studeres i sanntid. I likhet med protokollen demonstrert i denne studien, kan en skjæradhesjon kart av hvite blodceller lett genereres fra et enkelt eksperiment.

Protokollen som er nevnt i dette dokumentet, kan brukes til å studere virkningen av nett-morfologi på partikkel / celle adhesjon som en modell for in vivo-betingelser. I tillegg er effekten av strømnings på partikkel / celle adhesjon og cellulære oppførselen for modellering fysiologiske betingelser kan også lett evalueres. Til slutt, kan protokollen være ossed å studere levering av legemidler og effekt for målrettet levering til ønskede cellepopulasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SynVivo-SMN	CFD Research	SMN-001	Exclusive at CFDRC
CFD-ACE+	ESI Inc.	N/A
Avidin	Invitrogen	43-4401	Any avidin source will work for this assay
Biotinylated Particles	Polysciences	24173-1	Any source of biotinylated particles will work for the assay
Tygon Tubing	VWR	63018-044	Size is typical for use with SynVivo-SMN
NIKON Elements	NIKON Instruments	N/A	Any other imaging software can be used