Abstract
셀 / 입자 접착 분석은 질병의 병태 생리에 관련된 생화학 적 상호 작용을 이해하는 데 중요하며 새로운 치료제의 개발에 대한 탐구에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 정적 조건을 이용하여 분석이 생체 내 환경과의 상관 관계를 제한하는 전단에 접착 의존성을 캡처하지 못한다. 생리적 유체 흐름하에 접착력을 정량화 평행 평판 유동 챔버 전단 접착 맵의 생성을위한 다수의 실험이 필요하다. 또, 이들은 생체 내 치수 및 형태를 나타내지 않는 실험 시약 대용량 (~ ml)에 요구한다. 본 연구에서는 미세 유동 장치, SynVivo-SMN 기반 미세 혈관 망을 이용하여 단일 실험에서 전단 접착 맵의 생성을 보여준다. 이 장치는 기하학적 규모, 형태 요소, 흐름의 특징과에있는 세포의 상호 작용을 포함한 생체 내 혈관의 복잡한을 다시체외 형식함으로써 기본에 대한 생물학적 사실적인 환경을 제공하고 세포 행동, 약물 전달 및 약물 발견 연구를 적용했다. 분석은 마이크로 칩의 아비딘 - 코팅 된 표면을 가진 2 μM 바이오틴 - 코팅 입자의 상호 작용을 연구에 의해 입증되었다. 미세 혈관에서 관찰 전단의 전체 범위는 생리적 조건 하에서 입자의 전단지도 대 단일 분석 가능 밀착성이 얻어진다.
Introduction
세포 - 세포 및 입자 세포의 상호 작용을 연구하는 현재의 분석은 일반적으로 입자 또는 세포가 단백질 행렬 또는 자기편 세포 배양되는 정적 잘 플레이트 형식을 포함한다. 특정 배양 시간의 끝에서, 접착 입자 또는 세포의 숫자는 한 현미경을 사용하여 정량화된다. 이러한 분석은 이러한 상호 작용의 뒤에 생화학 적 프로세스에 중요한 통찰력을 제공하더라도, 키 제한 (미세 혈관의 일반) 생리 학적 유체 흐름의 부족 및 입자 부착에 미치는 영향이다.
이러한 한계를 극복하기 위하여, 시험 관내 유동 챔버는 최근 몇 년 동안 개발되었다. 이러한 흐름 챔버의 일반적인 요소는 생체 내 2 혈관에서 관찰 벽 전단 속도에 맞게 낮은 레이놀즈 수에서 관류 투명 장치이다. 혈관벽은 유량 (C)의 한 표면 상에 생체 분자의 코팅 또는 세포의 성장 중 하나에 의해 모델링된다hamber 3. 입자 4-7 또는 8-16 세포는 다양한 전단 속도에 따라 입자를 부착의 수를 계량하는 유량의 원하는 범위에 유입된다.
그러나, 생화학 적 현상을 연구하고 검증하는 평행 평판 유동 챔버의 사용은 약간 고가이며 시간 소모적이다. 이것은 여러 실험 부착 입자 / 세포의 수 대 유체 전단의지도를 생성하기 위해 수행 될 필요가 있다는 사실에 주로 기인한다. 또한, 플레이트 흐름 챔버는 그들의 큰 크기 (높이> 250 μm의 폭> 1mm)에 시약의 많은 양을 필요로한다. 마지막으로, 이러한 장치는 정확하게 생체에 존재하는 기하학적 특징 (예를 들면, 분기점) 및 유동 조건 (예를 들어, 흐름을 발산 대 수렴)를 모델링하지 않습니다.
리소그래피 기반 미세 17-19 최근 진보는 랩 온어 칩의 필드를 가속화장치 20-21. 이러한 장치는 마이크로 미터 정권의 차원과 병렬 플레이트 흐름 챔버의 소형 버전을 개발하는 수단이되고있다. 치수의 감소는 또한 시약, 세포 나 실험에 필요한 입자의 양 측면에서 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 그러나, 현재 사용 가능한 장치의 주요 제한은 생체 내에서 관찰 복잡한 미세 혈관을 모방하지 않는 미세 혈관을 모델링하는 선형 채널의 사용이다.
우리는 최근 생체 조건의 합성 표현의 결과로 처분 할 수있는 플라스틱 기판에 미세 혈관 네트워크를 재현하기위한 새로운 방법을 개발했습니다. 이 장치는 SynVivo 합성 미세 혈관 네트워크 (SMN)이 소프트 리소그래피 공정을 기반 PDMS를 사용하여 개발 불린다. SynVivo-SMN 장치가 셀 / 파티클 부착 (22)의 전단 접착력 맵을 얻기 위해 사용될 수 있으며, 연구는 약물 전달 (23)과 H를 타겟팅생체 데이터를 24 ~ 25에 대해 유효성이 확인 된 번가. 이 논문에서, 우리는 1 ~ 5 ㎕를가함으로써 자원과 시간을 크게 절감의 결과로 작은 볼륨에서 하나의 실험에서 전단 접착지도의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 제시한다.
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Protocol
1. 못쓰게 SynVivo - SMN 미세 유체 장치
- 장치의 각 포트 (입구 / 출구)는 두 개의 병렬 포트로 구성되어 있습니다 - 표면 코팅 부분에 흐르는 하나의 (부착 분자, 성장 행렬 등) 및 / 또는 파종 및 분석 (그림 1A를 실행하는 기타 세포 ).
- 완전 멸균 탈 (DI) 물을 포함하는 페트리 접시에 SynVivo - SMN 마이크로 유체 장치 (그림 1B)를 물속에 진공 데시 케이 터에 접시를 놓습니다. 모든 공기는 장치의 채널에서 제거 될 때까지 건조기가 실행될. 이것은 약 15 분 소요됩니다.
- 물에서 장치를 제거하기 전에, 미세 포인트 집게로 장치의 각 포트에 물을 준비하는 타이곤 튜브 (0.06 OD "0.02의 ID")를 배치합니다. 튜브의 길이는 약 1 인치이어야한다. 이 디바이스는 이제 물에서 제거 할 수 있습니다. 그림 1C는 배포 장치의 이미지를 보여줍니다튜브에 전자.
2. 원하는 단백질과 미세 유체 장치를 코팅 (예를 들어, 아비딘)
- 피펫을 사용하여, 하나의 흡입구 튜브의 기지 주변의 물 (약 100 μL)의 하락을 배치합니다. 조심스럽게 주요 장치에 사용되는 튜브를 제거합니다. 물방울은 장치에 들어가는 공기를 방지 할 것이다.
- 20 ㎍ / ㎖의 농도에서 아비딘로드 1 ML의 주사기를 준비합니다. 24 G 스테인레스 스틸 바늘과 튜브에 주사기를 연결합니다. 장치의 입구 포트 중 하나에 튜브를 삽입한다. 턱 클램프로 활용되고 있지 유입구 클램프.
- 장치의 완전한 재관류를 허용하도록 10 분 동안 1 μL / 분의 유속으로 주입 아비딘. 유동 시간의 끝에서, 턱 클램프 튜브 클램프하고 밤새 39 ° C에서 장치를 배치.
3. 접착 실험에 대한 바이오틴 입자를 흐르는
- 장치에 허용실온에 와서. 동력 스테이지 및 고성능 카메라를 구비 한 반전 된 형광 현미경에 기기를 배치.
- 인산 완충액 생리 식염수 (PBS) 중 5 × 106 입자 / ml의 농도로 2 μM 바이오틴 입자의 용액을 제조 하였다. 1 ML의 주사기로 입자를 넣습니다. 만 PBS의 제 1 ML의 주사기를 준비합니다. 주사기 펌프 각 주사기를 넣고 바늘과 튜브에 연결합니다.
- 피펫을 사용하여 흡입구 튜브의 기지 주변의 물 (약 100 μL)의 하락을 배치합니다. 조심스럽게 코트 장치에 사용되는 튜브를 제거합니다. 물방울은 장치에 들어가는 공기를 방지 할 것이다.
- 조심스럽게 입구 포트에 각각 단계 3.2 바이오틴 입자와 PBS에 대한 튜브의 삽입합니다. 그림 2A는 셋업의 이미지를 보여줍니다.
- 2.5 μL / 분의 유속으로 바이오틴 화 입자를 주입하기 시작한다. 현미경의 유입 포트를 모니터링합니다. 첫 번째 기호입자, 타이머를 시작하고 3 분 동안 흐름을 계속합니다.
- 동시에 2.5 μL / 분의 유속으로 PBS의 흐름을 응시하면서 3 분의 끝에서, 바이오틴 화 입자의 흐름을 멈춘다. PBS는 언 바운드 입자를 씻어 3 분의 장치에 흐름을 허용합니다.
4. 이미지 획득 및 이미징 소프트웨어 (NIKON 요소)를 사용하여이자 (AOI) 측정의 지역 만들기
- 전체 장치의 이미지를 얻기 위해 이미징 소프트웨어의 "스캔 큰 이미지"기능을 사용합니다.
- 장치에 순차적으로 번호 분기점과 채널의 두 배 직경 원형 AOI를 만듭니다. 채널 직경 100 μm의 때문에이 경우에는 200 ㎛로 AOI 직경을 설정한다.
- MS 엑셀 시트에 각 AOI에있는 입자의 수를 내보낼 이미징 소프트웨어의 자동 카운트 기능을 사용합니다.
- 마찬가지로, 전체 입자의 수를 내보낼 자동 카운트 기능을 사용장치.
5. 전산 유체 역학 (CFD) 모델을 사용하여 입자 플럭스 분석
- CFD 시뮬레이션은 SynVivo - SMN 장치 토폴로지를위한 상용 소프트웨어 (CFD-ACE +, ESI 주식 회사)를 사용하여 실행됩니다. 결과는 실험적 관측을 분석 데이터베이스에 저장된다. 벽 전단 속도, 속도, 입자 플럭스, 장치의 부착에 대한 시뮬레이션 결과 정보를 저장합니다.
- 시뮬레이션 결과는 관련 입구 입자 농도에 기초하여 각각의 AOI 들어가는 입자의 개수를 결정하는 데 사용된다.
6. 생성 전단 접착지도
- 수학 식 6.1에 도시 된 바와 같이 분기점에서 흐르는 입자로의 분기점에 부착 된 입자를 분할함으로써 밀착성의 %를 계산한다.
부착 입자 흐르는 입자의 수는 P로부터 획득되는 곳rotocol은 각각 4.3과 5.2 단계를 반복합니다. - 단계 (5.1)에서의 데이터베이스로부터 얻어진 네트워크 및 수학 식 6.1로부터 얻어진 % 접착 값의 각 분기점에서 전단 속도를 사용하여 전단 접착지도를 플롯.
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Representative Results
도 1a는 SynVivo-SMN 장치의 회로도 및 시야 화상을 나타낸다.도 1b는 유리 슬라이드 상에 장착 SynVivo-SMN 장치.도 1C는 진공 데시 케이 터에 물 프라이밍 다음 튜빙 장치를 도시 나타낸다.
그림 2A는 2 μm의 바이오틴 입자의 결합 다음과 같은 일반적인 아비딘 코팅 SynVivo - SMN 장치를 보여주는 실험 세트입니다. 그림 2B의 이미지를 보여줍니다. 입자가 우선적으로 네트워크의 분기점 근처 준수합니다.
도 3a는 SynVivo-SMN 네트워크 번호 분기점을 나타낸다.도 3b는 상기 장치의 CFD 모델에 의해 생성 된 샘플 벽 전단지도를 보여준다. 전단 속도 250 초 -1에서 15 초에 이르는 장치가 다릅니다 -1 생체 내 미세 혈관에서 관찰. 참고 이러한 변화그들 각각의 유량에 대한 일정한 전단 속도를 제공하기 때문에 전단 속도가 선형 미세 유체 채널에서 동시에 얻을 수 없다.도 3c는 네트워크의 분기점의 각각의 전단 율의 값의 플롯을 나타낸다. 데이터는 전단 속도 패턴이 복잡하며, 선형 유동 채널과 다른 간단한 분석적 관계를 얻을 수 없다는 것을 보여준다. 또한, 다 분기점 (AOIs)는 데이터의 통계적 신뢰도를 추가 같은 전단 bin에 떨어질 네트워크에 존재한다.
도 4a는 실험 네트워크의 지점과 분기점의 입자 플럭스를 계산하는 데 사용되는 네트워크에있는 입자 플럭스의 CFD 분석 샘플 결과를 보여줍니다. 그림 (b)는 하나의 SynVivo - SMN 실험에서 계산 된 전단 접착지도를 보여줍니다. 전단 접착 맵으로부터 얻어진 전단 접착 맵으로부터 관찰 반비례 관계를 다음선형 채널의 실험. 그러나 SynVivo 분석법을 이용하여 달리 단일 실험은 시간과 자원의 상당한 절감 효과 선형 채널에서 필요한 여러 실험 실행 달리이 전단 맵의 생성을 허용한다. 실험 최대한의 통계 분석을 위해 삼중으로 실행합니다.
그림 1. SynVivo - SMN 장치. 왼쪽 패널 (그림 1A)는 장치의 개략도를 보여줍니다. 오른쪽 패널 (그림 1A)는 장치의 시야 이미지를 보여줍니다. 그림 1B는 현미경 유리 슬라이드에 장착 된 SynVivo - SMN 장치. 그림 1C 물에 프라이밍 다음 입구 / 출구 포트에 연결된 타이곤 ™ 튜브와 장치를 보여줍니다.
그림 2. SynVivo - SMN에서 일반적인 접착 분석. 그림 2A는 실험 세트입니다. 그림 2B의 이미지를 보여줍니다 바이오틴 입자가 장치에 바인딩 다음 보여줍니다. 파티클 부착이 네트워크의 분기에 비해 분기점 근처 지역화 밝혀 유의.
그림 3. SynVivo - SMN의 전단 분석. 그림 3a는 네트워크 번호가 모든 분기점을 표시하고 실험에서 분기점의 확대보기. 그림 3b는 네트워크의 분기점에서 질적 벽 전단지도. 그림을 보여줍니다3C는 네트워크의 지점에서 전단에 대한 정량적 인 정보를 보여줍니다. 네트워크의 전단 패턴이 복잡하고 생체 내에서 발견 된 전단 속도 (0-240 초 -1)의 생리적 범위에 걸쳐 있습니다.
전단 접착지도의 그림 4. 세대. 도 4a는 CFD 시뮬레이션에 의한 네트워크에서 (백색 표시) 입자 궤적을 강조한다. 이 궤도가 서로 다른 분기와 분기점에서 입자 플럭스를 얻기 위해 후 처리됩니다. 그림 (b)는 하나의 SynVivo - SMN 실험에서 얻은 전단 접착지도를 보여줍니다.
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Discussion
병렬 플레이트 흐름 챔버, 세포 - 세포 및 세포 입자의 상호 작용에 중요한 통찰력을 제공하는 동안, 이러한 높은 시약의 소비와 전단 접착 맵을 생성하기 위해 여러 실험을 실행에 대한 필요성과 같은 몇 가지 제한으로 고통. SynVivo 합성 미세 혈관 네트워크 (SynVivo-SMNs)의 사용은 생체 내 조건에서 모방 조건 번의 실험에서 전단 접착 맵의 생성을 가능하게한다. 또한, 시약의 상당한 절감 (> 95 %)도 얻어진다.
SynVivo-SMN와 파티클 부착 실험을 실행에 가장 중요한 단계는 이전의 실험에 칩에 거품 무료 조건을 확인하는 것입니다. 거품의 도입은 칩의 영역을 "공기가 잠겨"에 대한 액세스의 불안정과 부족 흐름으로 이어질 것입니다. 따라서, 큰 관심은 장치의 포트에서 호스의 삽입과 추출하는 동안 촬영해야합니다. 회에서 발견 버블 경우프라이밍 단계 동안 전자 장치는, 하나는 기포를 제거하기 위해 다시 프라이밍 단계를 반복 할 수있다. 대안 적으로, 하나의 장치 자유롭게 거품 프라이밍을 확보하기 위하여 저 유속 (0.1 μL / 분 이하)에서 미디어 / 시약으로 흐를 수있다.
프로토콜의 주요 제한은 제거 할 수없는 기포의 존재하에 다음 못쓰게되는 칩이다. 그러나,주의 연습 한 가까운 100 % 성공을 실험을 수행 할 수 있습니다. 또한, 전단 접착력 맵의 생성은 CFD 모델로부터의 정보를 필요로한다. 그러나 다른 유동 조건 CFD 결과의 미리 계산 데이터베이스 간단 CFD 시뮬레이션을 수행해야 할 필요를 극복 할 수있다.
여기서 제시된 방법론은 데모의 용이성을 위해 아비딘 - 비오틴 시스템을 사용하지만, 입자 또는 세포에 대한 리간드 - 수용체 결합 연구 입자 표면 또는 장치에 실시간으로 세포 표면의 상호 작용으로 사용될 수있다. 또한, 세포가 세제곱 수 있습니다입자가 세포와 세포 - 세포 상호 작용을 연구 할 수있는 장치에 ltured. 세포 배양이 원하는 세포 유형에 적합한 매트릭스 디바이스의 채널의 코팅을 필요로 할 것이다. 예를 들어, 내피 세포는 피브로넥틴 코팅 채널상에서 배양 될 수있다. 합류 후, 내피 세포는 TNF-α 또는 다른 관련 사이토 카인을 사용하여 활성화 될 수있다. 화이트 혈액 세포 (백혈구)가 주입 될 수 있으며 활성화 된 내피 세포에 미치는 상호 작용을 실시간으로 공부하실 수 있습니다. 본 연구에서 증명 프로토콜과 유사하게, 백혈구의 전단 접착력지도가 쉽게 번의 실험에서 생성 될 수있다.
이 문서에 언급 된 프로토콜은 생체 조건의 모델로 입자 / 세포 접착에 네트워크 형태의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 생리적 조건을 모델링 입자 / 세포 부착 및 세포 행동에 흐름의 효과도 쉽게 평가 될 수있다. 마지막으로, 프로토콜은 우리가 될 수원하는 세포 인구를 대상으로 전달을위한 약물 전달과 효능을 연구하는 에드.
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Disclosures
CFD 연구 법인의 후원이 기사에 대한 게재료.
Acknowledgments
SynVivo 기술은 NHLBI에서 부여 # 2R44HL076034에서 개발되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
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