Abstract
セル/粒子接着アッセイは疾患の病態生理に関与して生化学的相互作用を理解する上で重要であり、新たな治療薬の開発のための探求の重要な用途がある。静的条件を用いたアッセイは、 生体内環境との相関性を制限する、剪断に対する密着性の依存性を捕捉することができない。生理学的な流体の流れの下での密着性を定量化する平行板フローチャンバーは、剪断接着マップを生成するための複数の実験を必要とする。加えて、それらはインビボ規模および形態を表し、実験のための試薬 の大量（〜ml）を必要としない。本研究では、マイクロ流体デバイス、SynVivo-SMNベースの微小血管ネットワークを用いて単一の実験からの剪断接着マップの生成を示す。このデバイスは、幾何学的な規模、形態学的要素、フロー機能との細胞間相互作用を含む、 生体内血管系で複合体を再作成in vitroでのフォーマット、それによって基本のため、生物学的に現実的な環境を提供し、細胞挙動、薬物送達、および創薬応用研究。アッセイは、マイクロチップのアビジン被覆表面とのビオチン2μmの被覆粒子との相互作用を研究することによって実証された。微小血管系において観察剪断の全範囲は、生理的条件下で粒子に対するせん断マップ対接着を可能にする単一のアッセイで得られる。
Introduction
細胞間および粒子 - 細胞相互作用を研究するための現在のアッセイは、典型的には粒子または細胞は、タンパク質マトリックスまたは接着細胞上でインキュベートされた静的なウェルプレートフォーマットを含む。指定されたインキュベーション時間の終了時に、付着粒子または細胞の数を、顕微鏡1を用いて定量する。これらのアッセイは、これらの相互作用の背後にある生物化学的プロセスに重要な洞察を提供するにもかかわらず、主要な制限は、生理的な流体（典型的な微小循環の）流れと粒子の付着への影響がないことである。
この制限を克服するために、 インビトロのフローチャンバーは、近年開発されている。これらのフローチャンバーの共通要素は、 インビボ 2 の血管において観察される壁せん断速度と一致するように、低レイノルズ数で灌流透明な装置である。血管壁は、流れcの一面に生体分子の被膜または細胞の増殖のいずれかによってモデル化されるhamber 3。粒子4-7又は8-16の細胞は、次いで種々の剪断速度下で粒子を付着させるの数を定量化するために流速の所望の範囲内に流される。
しかし、生化学的現象を研究し、検証するための平行板フローチャンバーの使用は、かなり高価であり、時間がかかる。これは、複数の実験が付着粒子/細胞の数に対する流体剪断の地図を生成するために行われる必要があるという事実に主に起因する。また、プレートフローチャンバーは、それらの大きなサイズ（高さ>250μmで、幅> 1mm）のに試薬を大量に必要とする。最後に、これらのデバイスは、正確に生体内に存在する幾何学的特徴（ 例えば 、分岐点）とフロー条件（ 例えば 、フローを発散対収束）をモデル化しないでください。
リソグラフィベースの微細加工17〜19の最近の進歩により、ラボ·オン·チップのフィールドを加速していますデバイス20〜21。これらのデバイスは、マイクロメートル領域における寸法の平行板フローチャンバーの小型化されたバージョンの開発に尽力してきました。ディメンションの減少も試薬、細胞や実験に必要とされる粒子の体積の面で大きなメリットが得られます。しかしながら、現在利用可能なデバイスの重要な制限は、in vivoで観察複合体微小血管系を模倣していない微小血管をモデル化する線形チャネルの使用である。
我々は最近、生体内の条件の合成表現、その結果、使い捨てのプラスチック基板上に微小血管のネットワークを再作成するための新たな方法論を開発しました。これらのデバイスは、SynVivo、合成微小血管ネットワーク（SMN）と呼ばれるPDMSベースのソフトリソグラフィプロセスを使用して開発されている。 SynVivo-SMNデバイスは、細胞/粒子の密着22の剪断接着マップを得るために使用することができ、研究では、薬物送達及びh 23を標的とin vivoデータ24〜25と比較して検証されていAVE。本論文では、それによって、資源と時間の大幅な節約をもたらす1-5μLと小さい容量の中で単一の実験から、せん断接着マップの生成を可能にするプロトコルを提示する。
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Protocol
1。プライミングSynVivo-SMNマイクロ流体デバイス
- デバイスの各ポート（入口/出口）は、2つのパラレルポートから構成されている-表面被覆部分に流れる毎に（接着分子、成長マトリックスなど）および/ または播種アッセイ（ 図1Aを実行するための他のための細胞）。
- 完全滅菌脱イオン（DI）水を含むペトリ皿にSynVivo-SMNマイクロ流体デバイス（ 図1B）を水没し、真空デシケーターにお皿を置く。空気のすべてがデバイスのチャネルから削除されるまでデシケーターを実行させておきます。これは、約15分かかります。
- 水からデバイスを取り外す前に、細かい点ピンセットでデバイスの各ポートに水で下塗りタイゴンチューブ（0.06のOD」と0.02のID」）を配置します。チューブは長さが約1インチでなければなりません。デバイスは、水から除去することができる。 図1Cは、デビックの画像を示すチューブとE。
2。所望のタンパク質（ 例えば 、アビジン）とマイクロ流体デバイスをコーティング
- ピペットを用いて、1流入口チューブの根元に水を一滴（約100μl）を配置します。慎重にプライムデバイスに使用されるチューブを取り外します。水滴は、デバイスを空気が入るのを防ぐであろう。
- 20μg/ mlの濃度でアビジンを搭載し1ミリリットルの注射器を準備します。 24 Gのステンレス鋼針やチューブに注射器を接続します。デバイスの入口ポートにチューブを挿入する。ジョーのクランプで利用されていない入口ポートをクランプ。
- 装置の完全なかん流を可能にするために10分間、1μlの/分の流速でアビジンを注入する。フロー時間の終了時に、顎クランプでチューブをクランプし、4℃で一晩装置を配置する。
3。接着実験のためのビオチン化粒子を流れる
- デバイスができるようにする室温に来る。電動ステージと高性能カメラを搭載した倒立蛍光顕微鏡の上には置か。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中5×10 6粒子/ mlの濃度で2μmのビオチン化粒子の溶液を調製する。 1ミリリットルの注射器に粒子をロードします。 PBSのみの第二の1ミリリットルの注射器を準備します。シリンジポンプに各シリンジをロードし、針とチューブに接続します。
- ピペットを用いて、流入口チューブの根元に水を一滴（約100μl）を配置します。丁寧にコーティングするために、デバイスを使用し、チューブを取り外します。水滴は、デバイスを空気が入るのを防ぐであろう。
- 慎重に入口ポートのそれぞれにステップ3.2からチューブのビオチン化粒子と、PBSのために挿入します。 図2（a）は、セットアップの画像を示す。
- 2.5μL/分の流量で、ビオチン化粒子を注入開始。顕微鏡上の入口ポートを監視します。最初の兆候で粒子から、タイマーを開始し、3分間の流れを継続する。
- 同時に2.5μlの/分の流速でPBSの流れを凝視しながら3分間の終わりに、ビオチン化された粒子の流れを止める。 PBSを結合していない粒子を洗い流すために3分間デバイス内に流れるようになります。
4。画像を取得し、イメージングソフトウェア（NIKON要素）を用いて関心領域（AOI）測定の実行
- 装置全体の画像を取得する画像処理ソフトウェアで「スキャン大きなイメージ」機能を使用してください。
- 順次番号分岐装置内のチャンネルの二倍の直径を持つ円形のAOIを作成します。チャンネル径が100μmであるため、この場合は、200μmのAOI径を設定します。
- MS Excelのシートに各AOIの粒子数をエクスポートするために、イメージングソフトウェアで自動化されたカウント機能を使用してください。
- 同様に、全体の中の粒子の数をエクスポートするために自動化されたカウント機能を使用デバイス。
5。計算流体力学（CFD）モデルを用いて粒子フラックス解析
- CFDシミュレーションはSynVivo-SMNのデバイストポロジのために市販のソフト（CFD-ACE +、ESI社）を使用して実行されます。結果は、実験観察を分析するためのデータベースに格納される。壁のせん断速度、速度、粒子束、およびデバイスにおける接着に関するシミュレーション結果情報を格納します。
- シミュレーション結果は、所与の入口粒子濃度に基づいて、それぞれのAOIに入る粒子の数を決定するために使用される。
6。生成剪断接着地図
- 式6.1に示すように分岐部を流れる粒子によって分岐内の付着した粒子を分割することにより密着性の％を計算します。
付着粒子の数と粒子が流れることは、pから得られる場合rotocolは、それぞれ4.3と5.2を繰り返します。 - ステップ（5.1）でデータベースから取得したネットワークおよび式6.1から得％の接着値の各分岐部に剪断速度を用いて剪断接着マップをプロットする。
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Representative Results
図1Aは、概略的かつSynVivo-SMN装置の明視野像を示す。 図1Bは、スライドガラス上に搭載SynVivo-SMN装置を示す。 図1Cは 、真空デシケーター中で水でプライミング以下のチューブを有する装置を示している。
図2aは、実験的な設定までのイメージを示す。 図2Bは、2ミクロンビオチン化粒子の結合後の典型的なアビジン被覆SynVivo-SMN装置を示す。粒子が優先的にネットワーク内の分岐点の近くに準拠していることに注意してください。
図3Aは、SynVivo-SMNネットワーク内の番号付き分岐を示している。 図3Bは 、装置のCFDモデルによって生成されたサンプル壁剪断マップを示す。剪断速度250秒-1から15秒の範囲で変化するデバイス-1 インビボでの微小血管系において観察される。これらは様々なことに注意してくださいそれらは各流量に対して一定の剪断速度を与えるように、剪断速度は、直線のマイクロ流体チャネルを同時に得ることができない。 図3Cは、ネットワークの分岐の各々において剪断速度の値のプロットを示す。データは、剪断速度パターンは複雑であり、直線流路とは異なり、単純な解析的な関係を得ることができないことを示している。さらに、複数の分岐点（AOIを）は、データの統計的な信頼に加えて、同じせん断ビンに落ちるネットワーク内に存在している。
図4Aは、実験ネットワークの枝および分岐の粒子束を計算するために使用されるネットワークにおける粒子フラックスのためのCFD解析のサンプル結果を示す。 図4Bは、単一SynVivo-SMN実験から計算された剪断接着マップを示す。剪断接着マップから得られた剪断接着マップから観察されるように逆の関係に従う線形チャネル実験。しかしながら、SynVivoアッセイを用いて対照的に、単一の実験では、時間とリソースの大幅な節約をもたらす線形チャネルから必要な複数回の実験と異なり、この剪断マップの生成を可能にする。実験は、最大の統計分析のために三連で実行されることに注意してください。
図1 SynVivo-SMN装置。左パネル（ 図1A）は装置の概略を示す図である。 図1Bは、顕微鏡スライドガラス上に搭載SynVivo-SMN装置を示している。右のパネル（ 図1A）は 、デバイスの明視野像を示す図である。 図1Cは、水でプライミング次の入口/出口ポートに取り付けられたタイゴン™チューブで装置を示している。
図2。SynVivo-SMNにおける典型的な接着アッセイ。図2（a）は、実験的な設定をバックアップします。 図2Bの画像を示しているビオチン化粒子が装置内の結合後に表示されます。パーティクル付着がネットワークの枝に比べて分岐部の近くに局在することが判明したことに注意してください。
図3。SynVivo-SMNのせん断分析。図3（a）は、すべてのネットワークに番号分岐点とした実験からの分岐点の拡大図を示している。 図3Bは 、ネットワーク内の分岐点での質的な壁面せん断マップを示している。 図図3（c）は、ネットワーク内の支店のせん断に関する定量的な情報を示しています。ネットワーク内のせん断パターンは複雑であり、 生体内で見つかったせん断速度（0〜240秒-1）の生理的な範囲に及ぶことに注意してください。
図4剪断接着マップの生成。図4Aは、CFDシミュレーションから得られたネットワークで（白で示されている）粒子軌道を強調しています。これらの軌道が異なる分岐や分岐点での粒子フラックスを得るために、後処理さである。 図4Bは、シングルSynVivo-SMNの実験で得られたせん断接着マップを示している。
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Discussion
パラレルプレートフローチャンバーは、細胞 - 細胞および細胞 - 粒子間相互作用に重要な洞察を提供しながら、このような高い試薬の消費および剪断接着マップを生成するために複数の実験ランの必要性など、いくつかの制限を受ける。 SynVivo合成微小血管ネットワーク（SynVivo-SMNs）の使用は、生体内の状態に模倣条件での一回の実験からの剪断接着マップの生成を可能にします。また、試薬を大幅に節約（> 95％）も得られる。
SynVivo-SMNとパーティクル付着実験を実行している中で最も重要なステップは、実験前に、チップ内の気泡のない条件を確保することです。気泡の導入は、チップの領域を「空気がロックされた」へのアクセスの不安定性および欠如を流れるように導くであろう。そのため、細心の注意は、デバイスのポートからチューブの挿入および抽出の際に注意が必要です。目で見られるバブルの場合プライミング工程中の電子装置は、一つの気泡を除去するために再度プライミング工程を繰り返すことができる。あるいは、装置の無気泡プライミングを確実にするために低流量（0.1μL/分以下）で培地/試薬中に流れることができる。
プロトコルの主な制限は、削除することはできません、バブルの存在以下の使用不能レンダリングされているチップです。しかし、慎重に練習して1はほぼ100％の成功を用いた実験を行うことができます。また、剪断接着マップの生成は、CFDモデルからの情報を必要とする。しかしながら、異なる流れ条件のためのCFD結果の事前計算されたデータベースを容易にCFDシミュレーションを実行する必要性を克服することができる。
ここに示す方法は、デモを容易にするためにアビジン - ビオチン系を用いているが、粒子または細胞上の任意のリガンド - 受容体の組み合わせは、装置にリアルタイムで学習粒子表面または細胞 - 表面相互作用であるために使用することができる。さらに、細胞は、Cuすることができる粒子 - 細胞および細胞 - 細胞間相互作用を研究するための装置でltured。細胞の培養は、所望の細胞型に適したマトリックスを有するデバイスのチャネルのコーティングを必要とする。例えば、内皮細胞は、フィブロネクチンコーティングしたチャネル上で培養することができる。コンフルエンス後、内皮細胞は、TNF-α又は他の関連するサイトカインを用いて活性化することができる。白色血液細胞（白血球）を挿入することができ、活性化内皮細胞上のその相互作用をリアルタイムで研究することができる。この研究で実証されたプロトコルと同様に、白血球の剪断接着マップが容易に単一の実験から生成することができる。
この論文に記載されたプロトコルは、 インビボ条件のモデルとして、粒子/細胞接着のネットワークの形態の効果を研究するために使用することができる。加えて、生理学的条件をモデル化するための粒子/細胞接着および細胞挙動に対する流れの効果はまた、容易に評価することができる。最後に、プロトコルは、私たちすることができます所望の細胞集団への標的化送達のための薬物送達性と有効性を研究するエド。
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Disclosures
CFDリサーチ社が主催するこの記事の公開手数料。
Acknowledgments
SynVivo技術はNHLBIからの助成金番号2R44HL076034の下で開発されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
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