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Immunology and Infection

प्रतिदीप्ति doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

हम कीट और संयंत्र के ऊतकों में वायरस और बैक्टीरिया के स्थानीयकरण के लिए यहाँ स्वस्थानी संकरण में एक सरल प्रतिदीप्ति (मछली) विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल पूरे माउंट में mRNA के दृश्य और सूक्ष्म वर्गों के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Abstract

सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति सामान्यतः कोशिकाओं में जीन टेप visualizing और आगे इस तरह के वायरस और बैक्टीरिया से संक्रमण के रूप में सेल में अन्य घटकों कल्पना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है के लिए इस्तेमाल की तकनीक की एक किस्म को दिया नाम है. स्थानिक स्थानीयकरण और संक्रमण की प्रक्रिया के दौरान वायरस और बैक्टीरिया के दृश्य के विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में इस तरह के प्रोटीन और RNAseq के रूप में अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रयोगों का पूरक है कि एक आवश्यक कदम है. इन एजेंटों के साथ spatiotemporal संक्रमण को समझना सेलुलर घटकों के साथ उनकी बातचीत को समझने के उद्देश्य से जैविक प्रयोगों के पूरक. ऐसे पत्रकार जीन सिस्टम या immunohistochemical विधियों के रूप में वायरस और बैक्टीरिया दृश्यमान करने के लिए कई तकनीकों का समय लेने वाली है, और कुछ मॉडल जीवों के साथ काम करते हैं और जटिल तरीके में शामिल करने के लिए सीमित कर रहे हैं. सेल में शाही सेना या डीएनए प्रजातियों कि लक्ष्य मछली एक अपेक्षाकृत आसान और तेजी से मुझे हैजीन के spatiotemporal स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए और नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए thod. इस विधि मजबूत और प्रोटोकॉल विचार नहीं कर रहे हैं, जो कम hybridizing, वाणिज्यिक खरीदा जांच, रोजगार जब लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हो सकता है. नमूना तैयार करने, निर्धारण, संकरण, और सूक्ष्म दृश्य जटिल कदम शामिल नहीं है जब यह विशेष रूप से मजबूत है. यहाँ हम कीट और संयंत्र के ऊतकों में बैक्टीरिया और वायरस के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विधि उनके 5 'या 3' पर फ्लोरोसेंट रंगों संयुग्मित कम डीएनए जांच समाप्त होता है 20 आधार जोड़े के साथ सरल तैयारी, निर्धारण, और कीट पूरे mounts और विच्छेदित अंगों या हाथ से बनाया संयंत्र वर्गों के संकरण, पर आधारित है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कीट और संयंत्र के ऊतकों की एक संख्या के लिए लागू किया गया है, और सेल में mRNAs या अन्य शाही सेना या डीएनए प्रजातियों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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उनके संक्रमित संयंत्र मेजबानों के साथ संयंत्र वायरस और अन्य रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करते हैं, तो यह है कि वे अपने मेजबानों पर नकारात्मक प्रभाव के कारण चाहे, बगल में रोगजनकों और उनके संबंधित न्यूक्लिक एसिड कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है. संयंत्र कोशिकाओं के भीतर और बीच रोगज़नक़ आंदोलन का अध्ययन करने पर यह सबसे महत्वपूर्ण है. रोगज़नक़ के जीन उत्पादों की सीटू स्थानीयकरण में pathogenicity प्रक्रिया के अध्ययन के लिए अन्य तरीकों का पूरक है कि एक आवश्यक कदम है. कई संयंत्र रोगजनकों, विशेष रूप से वायरस, उनके वैक्टर के साथ जटिल और अंतरंग बातचीत होने, कीड़ों से प्रेषित कर रहे हैं. उनके वैक्टर में इन वायरस के स्थानीयकरण प्रसारण के लिए पथ के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और वेक्टर के अंदर संभव बातचीत साइटों. कुछ कीट vectored संयंत्र वायरस का संचरण इन कीड़ों के भीतर रहते हैं कि एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया द्वारा सहायता प्राप्त है. बेहतर ये संयंत्र वायरस बी के प्रसारण का अध्ययन करने के लिएउनके वैक्टर, यह सामान्य रूप में एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया कल्पना, और विशेष रूप से वायरस के संचरण में शामिल लोगों के लिए भी आवश्यक है y. वायरस और एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया की colocalization इस प्रकार अपने कीट मेजबान के भीतर इन जीवों के बीच संभावित संबंधों की जांच के लिए वांछित है. एक तरफ वायरस के संचरण से, एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया कीट वैक्टर के जीव विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित, कीड़े के भीतर इन बैक्टीरिया की इस प्रकार स्थानिक स्थानीयकरण उच्च ब्याज और महत्व का है.

टमाटर पीला पत्ता कर्ल वायरस (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) दुनिया भर में 1-4 की खेती टमाटर का सबसे महत्वपूर्ण वायरल रोग जटिल है. TYLCV एक फ्लोएम सीमित वायरस है और विशेष रूप से whitefly Bemisia tabaci 5,6 द्वारा vectored है. उनके whitefly वैक्टर में begomoviruses के स्थानान्तरण का वर्णन एक मॉडल 6-9 प्रस्तावित किया गया है. दो विशिष्ट बाधाओं को सक्रिय रूप से dur पार कर रहे हैंआद्यमध्यांत्र / hemolymph और hemolymph / लार ग्रंथि बाधाओं: इस प्रसारता प्रसारण आईएनजी. इस संचरण प्रक्रिया वायरस capsid पहचान जो अज्ञात रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता किए जाने की परिकल्पना की है. TYLCV बी पार करने के लिए सोचा है यह संयंत्र में इंजेक्शन से पहले tabaci आद्यमध्यांत्र 6,10, और प्राथमिक लार ग्रंथि 6 के माध्यम से अवशोषित कर लेता है. Whitefly hemolymph में, TYLCV कीट माध्यमिक एंडोसिम्बायोटक जीवाणु Hamiltonella द्वारा उत्पादित एक GroEL प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान. इस बातचीत hemolymph में TYLCV के सुरक्षित परिवहन सुनिश्चित करता है, और कीट प्रतिरक्षा प्रणाली 11. Hamiltonella और Portiera, प्राथमिक endosymbiont के हमले से बचाता है whiteflies की, bacteriocytes में रखे जाते हैं, hemolymph और घर एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया 11. बी में पाया कीट कोशिकाओं tabaci रिकेटसिआ, Arsenophonus, Wolbachia, और Fritsch सहित अतिरिक्त एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया बंदरगाहोंbacteriocytes अंदर या बाहर स्थानीय है, और किया जा सकता है जो ईए, कीट जीव विज्ञान 12 पर विविध प्रभाव है.

कई रिपोर्टों सूक्ष्म मोटी अनुभाग 10,13 पर बगल में इस तरह के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर), एंटीबॉडी और शाही सेना के रूप में समय लेने वाली और महंगा प्रोटोकॉल का उपयोग करके पौधों और whiteflies में TYLCV के स्थानीयकरण का अध्ययन करने का प्रयास किया है, हाल ही में एक अध्ययन स्थानीयकरण वर्णित एक सरल प्रोटोकॉल 14 का उपयोग करके अपने संयंत्र और वेक्टर मेजबान अंदर संयंत्र वायरस की. यहाँ हम बी में TYLCV का स्थानीयकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन tabaci midguts और लार ग्रंथियों विच्छेदित और वर्गों में TYLCV संक्रमित पौधों से तैयार किया. हम आगे Portiera, बी के प्राथमिक endosymbiont का स्थानीयकरण वर्णन tabaci, और अपनी माध्यमिक endosymbionts Hamitonella, रिकेटसिआ और Arsenophonus. इस प्रोटोकॉल, लघु डीएनए जांच के प्रयोग पर आधारित है किfluorescently उनके 5 'अंत पर लेबल, और विशेष रूप से वायरल या बैक्टीरियल जीन दृश्यों में पूरक दृश्यों को संकरण कर रहे हैं. नमूना प्रसंस्करण अपेक्षाकृत आसान है और प्राप्त संकेत अत्यधिक विशिष्ट है. वर्णित प्रोटोकॉल उनके पौधे, पशु और कीट मेजबान में वायरस, बैक्टीरिया और अन्य रोगजनकों स्थानीय बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आगे किसी भी ऊतक में mRNA स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

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1. मछली विश्लेषण के लिए जनरल whitefly, संयंत्र, और वायरस तैयारी

  1. रियर बी और क्यू समयुग्मी कपास seedlings (Gossypium hirsutum एल CV. Acala) पर whiteflies और 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस, 60% सापेक्ष आर्द्रता की मानक स्थितियों के तहत कीटरोधक पिंजरों और वृद्धि कमरे के अंदर बनाए रखने, और एक 14 घंटा प्रकाश / 10 घंटा अंधेरे photoperiod.
  2. पहले से वर्णित 15-19 के रूप में endosymbiont विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग endosymbionts साथ संक्रमण का परीक्षण करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करना.
  3. एक वाणिज्यिक नर्सरी या संयंत्र टमाटर के बीज से टमाटर seedlings (सोलेनम esculentum CV. बीफस्टीक) खरीद.
  4. पौधों TYLCV 15 की whitefly की मध्यस्थता टीका के लिए सबसे उपयुक्त उम्र (अनुभाग नीचे 4.1 देखें), चार सच पत्ती अवस्था तक पहुंचने तक ऊपर वर्णित एक ही पालन शर्तों के तहत बनाए रखें.

2. एंडो के लिए कीट हैंडलिंग, फिक्सेशन, जांच डिजाइन, संकरण, और दृश्यsymbiont मछली

  1. कपास के पौधों से आकांक्षा से 10 वयस्क whiteflies लीजिए, या कपास के पत्तों से 10 3 या 4 वें instar nymphs लेने.
  2. तुरंत Eppendorf ट्यूबों के अंदर Carnoy लगानेवाला (क्लोरोफॉर्म इथेनॉल हिमनदों एसिटिक एसिड, 06:03:01, / खंड खंड) में विसर्जित कर दिया. (रातोंरात) रात भर के लिए 2 घंटे के लिए ठीक करें.
  3. पूरी तरह से लगानेवाला हटाने और 2 घंटे के लिए इथेनॉल में 6% एच 22 में रंग हटाना.
  4. कमरे के तापमान पर कई हफ्तों के लिए कई दिनों के लिए पूर्ण इथेनॉल में नमूनों की रक्षा करें, या अगले चरण पर जाएँ.
  5. डिजाइन जांच प्रत्येक जीवाणु के -16 ribosomal शाही सेना जीन के आधार पर ही पूरक रिवर्स डीएनए प्राइमरों. जांच डिजाइनिंग के लिए, खाते में पीसीआर प्राइमरों डिजाइन करने के लिए एक ही विचार ले. Oligonucleotide जांच का प्रयोग BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG -3 ', Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC -3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA -3 'और Ars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA -3 'क्रमशः Portiera, रिकेटसिआ, Hamilonella, और Arsenophonus, के विशिष्ट लक्षित के लिए.
  6. मिलीलीटर प्रति संकरण बफर में अंधेरे में रात भर नमूने संकरण (20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 0.9 एम NaCl, 0.01% [WT वॉल /] सोडियम सल्फेट dodecyl, 30% [/ खंड खंड] formamide) 10 pmol युक्त फ्लोरोसेंट जांच . यदि आवश्यक हो तो अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ एक से अधिक जांच का मिश्रण. लक्षित जीवाणु और कोई जांच नमूने के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के साथ noninfected whiteflies का प्रयोग करें.
  7. , एक तरल अवरोधक के साथ निहित संकरण बफर में, एक खुर्दबीन स्लाइड पर, पूरे नमूनों माउंट एक कवर पर्ची के साथ कवर, एक प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन के नीचे नेल पॉलिश, और दृश्य के साथ सील.

3. Whitefly अंग विच्छेदन, निर्धारण, संकरण, और TYLCV मछली के लिए विज़ुअलाइज़ेशन

  1. लगातार आकांक्षा और ane द्वारा TYLCV संक्रमित टमाटर के पौधों पर पाला वयस्क whiteflies लीजिएएसीटोन के साथ गर्भवती कागज तौलिया के लिए जोखिम के sthetize. एसीटोन के लिए भी लंबे समय जोखिम whiteflies ऊतकों को ठीक कर सकते हैं के रूप में केवल 1-2 मिनट के लिए whiteflies बेनकाब. विशिष्ट संकरण पुष्टि करने के लिए noninfected टमाटर पौधों और नियंत्रण के लिए कोई जांच नमूनों पर पाला nonviruliferous whiteflies का प्रयोग करें.
  2. अवसाद खुर्दबीन पर माउंट whiteflies एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग अंग विच्छेदन के लिए स्लाइड.
  3. Prothorax से कीट सिर दूर करना और 1x पीबीएस में लार ग्रंथियों काटना के कारण अपने छोटे आकार, बेहतर दृश्य के लिए 1% toluidine नीले दाग के साथ पूरक. 2-3 मिनट के लिए दाग के अवशोषण की अनुमति दें.
  4. छाती और निरीक्षण और आद्यमध्यांत्र बाहर निष्कासित करने के लिए पेट के बीच मोड़ पर अलग कीट खींचो. पेट नोक पर संदंश के साथ धक्का द्वारा पेट की सामग्री निष्कासित.
  5. धीरे सफल विच्छेदन से पीबीएस और toluidine नीले निकालें और धीरे 5 मिनट के लिए अंगों को ठीक करने के लिए Carnoy लगानेवाला के 300 μl जोड़ें.
  6. एकविच्छेदित अंगों की अनियंत्रित आंदोलन को रोकने के लिए उदास अच्छी तरह से एक पक्ष से और नहीं ऊपर से लगानेवाला डीडी. एक बार लगानेवाला छू, अंगों कांच का पालन करना होगा, और इस प्रक्रिया के दौरान वे कदम नहीं होगा.
  7. लगानेवाला निकालें और TYLCV कोट प्रोटीन जीन में एक दृश्य के लिए पूरक है जो फ्लोरोसेंट डीएनए जांच Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA -3 'के 10 pmol के साथ पूरक संकरण बफर के 500 μl जोड़ें.
  8. तल पर गीला तौलिया कागज के साथ छोटे प्लास्टिक बॉक्स से बना एक छोटा सा नम कक्ष के अंदर नमूना के साथ स्लाइड incubating द्वारा अंधेरे में कमरे के तापमान पर रातोंरात संकरण.
  9. संकरण के बाद, एक ठीक विच्छेदन उपकरण के साथ अंगों लेने के लिए और तेजी से DAPI (1x पीबीएस में 0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक और तरल अवरोधक के साथ निहित नई संकरण बफर के 30 μl युक्त एक ताजा खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए उन्हें स्थानांतरित.
  10. एक कवर पर्ची के साथ नमूनों को कवर, बुद्धि सीलएक प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन के नीचे ज नेल पॉलिश और देखें.

4. हैंडलिंग प्लांट, TYLCV मछली के लिए हाथ से सेक्शनिंग, निर्धारण, और संकरण

  1. विषाक्त बनाने वाला whitefly की मध्यस्थता टीका का उपयोग TYLCV साथ टमाटर seedlings टीका लगाना. वायरस symptomless पौधों में इस मछली विधि टीका के बाद एक सप्ताह का उपयोग कर पाया जा सकता है. विशिष्ट रोग के लक्षण दिखाई तीन सप्ताह के बाद टीका हैं. विशिष्ट संकरण पुष्टि करने के लिए नियंत्रण के लिए noninfected टमाटर पौधों और कोई जांच नमूने का प्रयोग करें.
  2. टमाटर का हाथ काट 2-4 सेमी लंबे अनुदैर्ध्य या पार वर्गों की तैयारी के लिए एक तेज ऊतकीय रेजर ब्लेड का प्रयोग तनों और पत्तियों.
  3. Eppendorf ट्यूबों में, 2 घंटा के लिए रात भर कमरे के तापमान पर के लिए Carnoy लगानेवाला में वर्गों को ठीक.
  4. लगानेवाला निकालें और कमरे के तापमान पर कई हफ्तों के लिए कई दिनों के लिए पूर्ण इथेनॉल में वर्गों की रक्षा, या अगले चरण पर जाएँ.
  5. वर्गों धो लेंसंकरण बफर में तीन बार, 1 मिनट प्रत्येक.
  6. TYLCV कोट प्रोटीन जीन में एक दृश्य के लिए पूरक है जो फ्लोरोसेंट oligonucleotide जांच Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA -3 'की 10 pmol के साथ पूरक संकरण बफर के 500 μl के साथ वर्गों संकरण.
  7. संकरण बफर में, वर्गों में तीन बार, 1 मिनट प्रत्येक धो लें.
  8. DAPI (1x पीबीएस में 0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक और तरल अवरोधक के साथ निहित संकरण बफर में पूरा पर्वत वर्गों, एक प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन के नीचे नेल पॉलिश और दृष्टि से सील, एक coverslip के साथ कवर किया.

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Representative Results

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इस पांडुलिपि में अध्ययन प्रणाली चित्र 1 में दिखाया गया है और TYLCV साथ एक संक्रमित संयंत्र, एक वयस्क और whitefly बी की एक अप्सरा भी शामिल है tabaci, और कीट में TYLCV स्थानान्तरण के लिए रास्ता दिखा whitefly के आंतरिक शरीर रचना. 2 प्राथमिक symbiont Portiera और माध्यमिक symbiont के लिए एक वयस्क whitefly में डबल मछली से पता चलता है Arsenophonus. चित्रा 3 Portiera और Hamiltonella के लिए डबल मछली से पता चलता है, और चित्रा 4 Portiera और रिकेटसिआ, बी में दोनों के आंकड़े के लिए डबल मछली से पता चलता है tabaci 4 वें instar अप्सरा. 5 एक whitefly विच्छेदित आद्यमध्यांत्र में TYLCV और DAPI धुंधला के लिए मछली से पता चलता है, और चित्रा 6 एक विच्छेदित whitefly प्राथमिक लार ग्रंथियों में TYLCV और DAPI धुंधला के लिए एक मछली पता चलता है. 7 TYLCV और में DAPI धुंधला के लिए मछली से पता चलता हैहाथ कट TYLCV संक्रमित संयंत्र वर्गों.

चित्रा 1
चित्रा 1. इस पांडुलिपि में अध्ययन प्रणाली का सिंहावलोकन टमाटर पीला पत्ता कर्ल वायरस (TYLCV). बी) के साथ संक्रमण के कारण होता है. एक) विशिष्ट रोग के लक्षण एक वयस्क whitefly 4 वें nymphal चरण की. सी) बाहरी दृश्य के बाहरी दृश्य whitefly विकास जीवन चक्र में. अन्य nymphal चरणों जनरल बाहरी दृश्य में समान है लेकिन आकार में छोटे होते हैं. डी) एक वयस्क बी के आंतरिक शरीर रचना विज्ञान के योजनाबद्ध देखें tabaci संयंत्र चलनी तत्वों, परिसंचरण और संचरण (काला तीर) से TYLCV अधिग्रहण की राह दिखा. लाल कणों TYLCV virions को देखें. पी: फ्लोएम, एस: एस tylet, ई: घेघा, एफसी: फिल्टर चैम्बर, डीएम: उतरते आद्यमध्यांत्र; हूँ:;: caeca, पारा: CA आद्यमध्यांत्र आरोही पश्चांत्र, ई.पू.: bacteriocytes, पी एस जी:. प्राथमिक लार ग्रंथि बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. बी पर Portiera और Arsenphonus की डबल मछली tabaci क्यू समयुग्मी वयस्क (ए) और लेबल क्षेत्र (बी) उज्ज्वल क्षेत्र चैनल के नीचे और. Portiera विशेष जांच (लाल) Cy5 और Arsenphonus विशेष जांच (संयुग्मित हर जांच द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने के संयुक्त ऑप्टिकल वर्गों दोनों पर ज़ूम Cy3 संयुग्मित) पीले इस्तेमाल किया गया. ई: अंडा.पीजी "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. बी पर Portiera और Hamiltonella की डबल मछली Cy5 और Cy3 संयुग्मित Hamiltonella विशेष जांच (हरा) संयुग्मित tabaci अप्सरा. Portiera विशेष जांच (लाल) का इस्तेमाल किया गया. ए) Hamiltonella संकरण संकेत संयुक्त ऑप्टिकल वर्गों से प्राप्त और. बी अंधेरे क्षेत्र के अंतर्गत देखा) से प्राप्त Portiera संकरण संकेत ऑप्टिकल वर्गों संयुक्त और अंधेरे क्षेत्र के अंतर्गत देखा. सी) Portiera और Hamiltonella उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत संकेत विलय कर दिया. डी) Portiera और Hamiltonella संयुक्त संकेतों दा के नीचे देखाआर.के. क्षेत्र. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. बी पर Portiera और रिकेटसिआ की डबल मछली Cy5 और रिकेटसिआ विशेष जांच Cy3 संयुग्मित (नीला) संयुग्मित tabaci अप्सरा. Portiera विशेष जांच (लाल) का इस्तेमाल किया गया. ए) संयुक्त ऑप्टिकल वर्गों से प्राप्त की है और अंधेरे क्षेत्र के अंतर्गत देखा रिकेटसिआ संकरण संकेत. बी से प्राप्त) Portiera संकरण संकेत उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत ऑप्टिकल वर्गों संयुक्त और अंधेरे क्षेत्र के अंतर्गत देखा. सी) Portiera और रिकेटसिआ संयुक्त संकेतों. डी) रिकेटसिआ संयुक्त संकेतों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
एक वयस्क बी की विच्छेदित आद्यमध्यांत्र पर TYLCV की चित्रा 5. मछली Cy3 संयुग्मित एक संक्रमित टमाटर के पौधे. TYLCV विशेष जांच (लाल) से 48 घंटे के लिए वायरस का अधिग्रहण किया था कि tabaci महिला इस्तेमाल किया गया था, और आद्यमध्यांत्र संयुक्त से देखा के रूप में विच्छेदित आद्यमध्यांत्र बढ़ते और दृश्य. ए) से पहले DAPI के साथ सना हुआ था उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत ऑप्टिकल वर्गों. बी) TYLCV मछली संकेत (लाल) और DAPI दाग नाभिक क्षेत्र अंधेरे के तहत संयुक्त ऑप्टिकल वर्गों से देखा के रूप में (नीला). एफसी: फिल्टर चैम्बर, डीएम: descendi एनजी आद्यमध्यांत्र; हूँ: आरोही आद्यमध्यांत्र, सीए: caeca, पारा: पश्चांत्र. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
एक वयस्क बी की विच्छेदित प्राथमिक लार ग्रंथि पर TYLCV की चित्रा 6. मछली Cy3 संयुग्मित एक संक्रमित टमाटर के पौधे. TYLCV विशेष जांच (लाल) से 48 घंटे के लिए वायरस का अधिग्रहण किया था कि tabaci महिला का इस्तेमाल किया गया था, और बढ़ते और दृश्य. ए) विच्छेदित और DAPI दाग प्राथमिक लार से पहले DAPI के साथ दाग लार ग्रंथि उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत संयुक्त वर्गों. बी) TYLCV मछली संकेत (लाल) और अंधेरे क्षेत्र के तहत संयुक्त वर्गों से देखा DAPI दाग नाभिक (नीला) से देखा ग्रंथि के रूप में.एस :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. TYLCV संक्रमित पौधे के एक तने के माध्यम से हाथ काट अनुदैर्ध्य अनुभाग पर TYLCV की मछली. TYLCV विशेष जांच Cy3 संयुग्मित (लाल) लाल के साथ दिखाया गया है एक खंड बढ़ते और दृश्य. ए) से पहले इस्तेमाल किया और DAPI धुंधला के साथ जोड़ दिया गया था TYLCV एक फ्लोएम चलनी तत्व में संकेत, और अंधेरे क्षेत्र के तहत संयुक्त वर्गों. बी) उन्मुखीकरण के लिए उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत (ए) में दिखाया गया है कि एक ही संयुक्त वर्गों से देखा DAPI दाग नाभिक. पीएच: फ्लोएम, XY:. जाइलम बड़ा Im देखने के लिए यहां क्लिक करेंउम्र.

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Discussion

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अपने संयंत्र मेजबान और कीट वेक्टर में एक संयंत्र वायरस का स्थानीयकरण, और उनके विशिष्ट whitefly मेजबान में एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, पौधों और यहां तक ​​कि जानवरों के ऊतकों में में अन्य वायरस का स्थानीयकरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता. इसके अलावा, प्रोटोकॉल एंडोसिम्बायोटक और रोगजनक बैक्टीरिया और पौधे और पशु प्रणालियों में अन्य सूक्ष्मजीवों स्थानीय बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्णित विधियों एक छोटी, fluorescently लेबल oligonucleotide डीएनए जांच और सेल में लक्ष्य डीएनए या शाही सेना अणु के बीच संकरण की सरल अवधारणा पर भरोसा करते हैं. परिणाम न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ एक विशिष्ट संकरण, और प्रतिदीप्ति या confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर पाया एक संकेत है. एक से अधिक जीन लक्ष्य है कि विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ कई जांच, एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक एकल कोशिका या ऊतक में एक से अधिक लक्ष्य दृश्यमान करने में सक्षम बनाता है. इन प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं को सरल और नमूना प्रसंस्करण समय कर रहे हैंकम से कम है. इस तरह के उच्च पृष्ठभूमि संकेत, नमूनों के लिए लंबे समय प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए कई और महंगा सामग्री के उपयोग के रूप में अन्य प्रोटोकॉल से जुड़ी समस्याओं, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में बाधाओं नहीं कर रहे हैं.

बी बी और क्यू biotypes स्थितियां उनके संबंधित मेजबान संयंत्र के साथ, किसी भी whitefly समयुग्मी को लागू पालन, लेकिन, tabaci whiteflies इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. whitefly संकेत शर्तों के तहत तीन सप्ताह में अपने जीवन चक्र पूरा करता है. इस्तेमाल किया बी समयुग्मी आबादी के प्रत्येक व्यक्ति प्राथमिक endosymbiont Portiera से संक्रमित किया गया था, और माध्यमिक एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया Hamiltonella और रिकेटसिआ. क्यू समयुग्मी व्यक्तियों Portiera और Arsenophonus से संक्रमित थे. दुनिया भर के अन्य whitefly आबादी इन या से संक्रमित होना दिखाया गया है अन्य एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरियल प्रजातियों, और विभिन्न स्थानिक localizati साथशरीर 16-20 में पैटर्न पर.

TYLCV संक्रमित पौधों ठेठ रोग के लक्षण टीका निम्नलिखित तीन सप्ताह दिखा. TYLCV स्थानीयकरण के लिए, रोगसूचक पौधों 24 घंटे के लिए whiteflies द्वारा वायरस अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और वायरस से ऊपर वर्णित मछली प्रोटोकॉल का उपयोग संक्रमित पौधों और कीड़ों में पाया जा सकता है. कीड़ों में प्रयोग किया जांच पौधों में Cy3 सबसे उपयुक्त है और क्लोरोप्लास्ट, संयंत्र सेल में सबसे प्रचुर मात्रा में organelles के रूप में इसी तरह की तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति नहीं करता, Cy3 और Cy5 सहित विभिन्न तरंग दैर्ध्य, साथ excised कर सकते हैं जो कई fluorophore साथ संयुग्मित जा सकता है.

बैक्टीरिया और पौधों और कीड़े में वायरस का स्थानीयकरण के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के सफल क्रियान्वयन के बेहतर दृश्य और जांच पैठ, विशिष्टता के लिए अच्छा जांच डिजाइन और के लिए पूरे कीड़ों के मामले में 2 हे 2 एच के साथ समाशोधन के लिए नमूने का अच्छा निर्धारण पर निर्भर करता है बीEtter संकेत दृश्य. पौधों में मछली के मामले में, हाथ से बने वर्गों अच्छा जांच पैठ और संकेत के बेहतर दृश्य के लिए संभव के रूप में पतली होना चाहिए. यह काटने के साथ मदद करने के लिए दो स्टायरोफोम टुकड़ों के बीच पत्ता डालकर और कई विक्रेताओं से इस उद्देश्य के लिए खरीदा जा सकता है जो पेशेवर रेज़र ब्लेड का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल हालांकि यह जांच प्रारूप subcellular स्थानीयकरण के लिए एक उपयुक्त विधि में, यहाँ का वर्णन का उपयोग, विकसित होने की संभावना है, लक्ष्य की subcellular स्थानीयकरण के लिए उपयुक्त नहीं है. उदाहरण के लिए, यहाँ वर्णित कम जांच वैसे बायोटिन और बदले में मंदिर के तहत कल्पना की जा सकती है कि streptavidin संयुग्मित सोने के कणों का उपयोग लक्षित किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंट नहीं अणुओं के रूप में अणुओं को संयुग्मित किया जा सकता है. यह बाद में संशोधन जीन टेप और सूक्ष्मजीवों सहित कई लक्ष्यों के subcellular स्थानीयकरण के लिए उपयुक्त हो सकता है. अंत में, वर्णित प्रोटोकॉलइस तरह के डीएनए और आरएनए लेकिन नहीं प्रोटीन के रूप में न्यूक्लिक एसिड के साथ संकरण के लिए उपयुक्त हैं.

यहाँ वर्णित मछली प्रोटोकॉल में सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह ताजा कीट और संयंत्र सामग्री, साथ ही ताजा लगानेवाला और संकरण buffers का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. जांच हमेशा दोहराया ठंड और विगलन से बचने के लिए छोटे aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक वर्णित कदम के प्रसंस्करण समय का अध्ययन किया जीवों पर निर्भर करता है calibrated किया जा सकता है. प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, निर्धारण और रंग हटाने की क्रिया के बाद, whitefly और संयंत्र के नमूने कमरे के तापमान पर पूर्ण इथेनॉल में लंबे समय के लिए संरक्षित किया जा सकता है. एक स्थान से प्रसंस्करण के लिए नमूने भेजने, या लंबे समय पाठ्यक्रम प्रयोगों प्रदर्शन करने पर यह कदम विशेष रूप से उपयोगी है. संकरण संकेत की गुणवत्ता इस लंबे समय संरक्षण निम्नलिखित प्रभावित नहीं था.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Ghanim प्रयोगशाला में अनुसंधान नहीं अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. जर्मन इजरायल फाउंडेशन (GIF) से 908-42.12/2006, कोई अनुदान. IS-4062-07 संयुक्त राज्य अमेरिका इसराइल Binational कृषि अनुसंधान और विकास कोष (चारण), और अनुसंधान अनुदान नहीं से. एमजी करने के लिए इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ISF) से 884/07

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

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प्रतिदीप्ति<em&gt; बगल में</emवायरस और संयंत्र और कीट ऊतकों में एंडोसिम्बायोटक जीवाणु के स्थानीयकरण के लिए&gt; hybridizations (मछली)
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Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

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